【摘要】
小分子化合物（small molecular analysis,SMAs）的检测在食品药品检测、环境监测、疾病诊断等方面具有重要意义。然而，由于竞争性反应形式，市售SMA免疫测定的性能在灵敏度和特异性上受到限制。近年来，非竞争性免疫分析法在SMAs检测中的应用已成为一个热门话题，特别是随着抗体开发技术的快速发展，抗免疫复合物（anti-IC）试剂的研究和发展引起了众多关注。本文综述了抗IC试剂的发展历程，探讨了不同抗IC试剂制备方法的优缺点、IC与抗IC抗体的相互作用机制以及抗IC抗体在SMAs检测中的应用，并对非竞争性免疫检测中所面临的挑战和潜在的解决方案进行了讨论，旨在为SMA的快速、精确检测提供参考和指导。
【引言】
SMA免疫分析可分为两大类：竞争性免疫分析和非竞争性免疫分析。竞争法通常涉及样品中的半抗原-载体蛋白偶联物和分析物竞争抗体有限结合位点，如图1A，因此具有以下局限性：（1）灵敏度有限：检测低浓度待测物时难以区分阳性和阴性样本。（2）单个表位限制：待测物与标记的类似物竞争单一抗体，限制了灵敏度和特异性。（3）检测范围窄，精度差：检测结果重复性低，无法很好的应用于环境或食品中微量待测物的检测。（4）交叉反应和特异性问题：特别是存在多个结构类似物时，由于缺乏多个识别位点可能导致特异性差，难以区分结构相似物。（5）较长的孵育时间：在竞争性免疫测定中，往往需要较长时间的孵育才能达到平衡。
非竞争性方法可以提高灵敏度、改进检测范围和精准度，已报道了几种SMA非竞争免疫测定方法（图1）。表1比较了非竞争性免疫测定方法与竞争性方法的性能。图2列出了非竞争性单表位SMA免疫分析方法的发展历程。
显然，非竞争性方法存在各自的局限性。例如，基于生物素化的夹心型测定（图1B），要求待测物质具有反应性基团用于修饰，过程复杂且不适合自动化检测。固相化表位免疫测定方法（图1C）也需要待测物质具有反应性基团以便于抗SMA抗体结合，过程复杂且劳动密集。基于抗独特型抗体的测定方式（图1D），受到需要产生α和β型抗独特型抗体的限制，且特异性不足。基于特殊分离的免疫测定（图1E）、流动注射酶免疫测定（图1F）和基于传感器的免疫测定（图1I）都需要特定的分离设备或分析仪器，成本高。部分开放夹心免疫测定（图1G）和基于淬灭体的免疫测定（图1J）属于均相检测，灵敏度有限，容易受基质干扰。双抗夹心测定方法（图1K）在产生高亲和力和高特异性夹心抗体对方面面临重大技术挑战，只有少数成功案例。相比之下，基于抗免疫复合物抗体或抗免疫复合物肽的方式（图1L）具有高通用性，无需反应性基团、容易自动化检测、不易受基质干扰、灵敏度和特异性高。最近，基于抗IC抗体的检测方法引起了越来越多的关注。但是已报道的文献忽略了抗IC抗体的详细制备方法以及与其结合位点的相关结构信息。本文着重总结抗IC试剂开发的最新进展及其应用。
图1：用于监测SMA的非竞争性免疫分析方法
表1：非竞争性ELSIA与竞争性ELSIA的比较
图2：SMAs非竞争性免疫分析方法的发展历程
【抗IC试剂的制备方法】
1. 动物免疫
Brown等利用抗体与抗原结合导致IgG抗体分子上出现新表位的特点，用人IgG抗原免疫复合物免疫兔，在其血清中检测到抗新表位的抗体，但是在小鼠体内这类抗体的比例非常低。另外也证明了此类抗体的结合依赖完整的IgG而不是F(ab’)2片段。Voss团队是第一个专门开发IC抗体的团队，与之前意外发现抗IC抗体的团队不同，他们的目标是开发针对由高亲和力小鼠IgG2a单克隆抗体（mAb）Fab与荧光素共价结合形成的免疫复合物的鼠源多克隆抗体。他们制备抗IC抗体的策略包括：首先，倾向于使用共价结合的IC而非可逆的IC进行免疫。其次，确保抗原-抗体亲和力足够高（2-3×10-10 M），以最大化抗原和抗体之间的分子间力。第三，在免疫原准备过程中特别去除了非特异性共价结合的半抗原-抗体副产物，以集中免疫反应于特定的IC。第四，使用同种异体免疫以减少抗同种型抗体的产生。最后成功生产了鼠源多克隆腹水，这种腹水不识别荧光素或未与配体结合的抗荧光素抗体，但对与抗原结合的荧光素Fab片段具有高特异性。当抗荧光素抗体与荧光素结合时，新暴露的抗原决定簇被称为“亚型”。识别这些新决定簇的抗体被命名为抗亚型抗体。对抗亚型抗体的结合机制进一步研究表明，多克隆抗亚型抗体在抗荧光素抗体的结合位点周围形成了一个249 kDa的复合物，阻止了荧光素从Ab1结合位点的解离。在上述研究基础上，通过动物免疫法制备了抗THC、血管紧张素、地高辛、微囊藻毒素和熊去氧胆酸7-N-乙酰氨基葡萄糖的抗免疫复合物抗体。
常规动物免疫可以使用与Ab1同源或异源的物种进行。如果Ab1是小鼠单克隆抗体，那么它可以直接与相应的SMA一起孵育形成IC，然后作为小鼠免疫的免疫原（图3）。这种免疫方法有助于避免产生抗同种型抗体和抗同种异型抗体。Ab1可以与异源蛋白结合以增强其免疫原性，如钥匙孔血蓝蛋白（KLH）。为了防止IC在注射到生物体内后解离，可对SMA进行化学修饰以引入反应性基团，进而与Ab1形成稳定的共价键。例如，Kobayashi等将UDCA 7-NAG上的游离羧基衍生化，形成N-琥珀酰亚胺酯。将该酯与Ab1在pH 5.0下孵育形成IC。随后，将pH值调至7−8，以恢复N-琥珀酰亚胺酯与ε-氨基的反应性，使其在结合位点附近与赖氨酸残基形成酰胺键。尽管SMA和Ab1之间存在化学交联，但产生的抗体中有很大一部分是针对Ab1的抗独特型抗体，这表明一定比例的IC仍然在体内发生了解离。当将半抗原与鼠单抗结合形成的IC用作兔子或其他动物的免疫原时，它包括针对鼠单抗的抗IC抗体、Ab1s和抗独特型抗体。为了分离特异性识别IC的抗IC抗体，抗血清必须分别用与半抗原和小鼠单克隆抗体结合的固相载体吸收。
作者团队开发25-羟基维生素D、雌二醇（E2）和醛固酮的非竞争性检测试剂的过程中，试图通过免疫小鼠制备SMA Ab1 IC的抗IC抗体。发现当鼠源Ab1与SMA一起孵育免疫效果很差。使用与SMA一起孵育的非鼠抗获得了更好的免疫结果。当用弗氏佐剂乳化时，由Ab1和SMA形成的IC可能会在剧烈的乳化条件下解离，导致在随后的筛选过程中靶向IC新表位的抗体阳性克隆率较低。阳性率低的另一个原因可能是抗体结合后IC的构象变化很小，大多数SMA嵌入抗体中，难以形成新的有效表位。因此，研究人员越来越多地使用噬菌体展示技术作为传统免疫方法的替代品来制备抗IC抗体。
图3：使用动物免疫、细胞融合制备Ab1与抗IC抗体
2. 噬菌体展示文库
抗体库的来源、多样性和库容量与筛选抗体的亲和力直接相关。天然抗体文库整合了来自多个供体（如兔子或人类）的天然免疫球蛋白基因库。这些文库是通过从B细胞中分别克隆编码重链（VH）和轻链（VL）可变结构域的基因构建的。VH和VL结构域的随机重排引入了额外的多样性。天然抗体库用于筛选难以通过免疫获得的抗体，如抗IC抗体、抗毒素和自身抗体。免疫文库通常由小鼠脾脏和外周血中的B细胞基因构建，容量较小而对特定抗原具有较高的特异性抗体滴度。与天然文库类似，VH和VL的原始配对在扩增的过程中容易丢失，与杂交瘤技术相比，这是一个缺点，杂交瘤技术保留了成熟的VH和VL对，并保持了亲和力（图4）。
与竞争法相比，非竞争法灵敏度的提高主要取决于抗IC肽的亲和力。然而，在某些情况下，竞争法甚至比非竞争法更灵敏。例如，即在竞争形式下，标记的模拟肽的亲和力较低，使分析物能够更有效地与固定的抗体竞争，从而灵敏度高。相比之下，由于标记肽和IC之间的亲和力不足，非竞争性方法的灵敏度较低。为了解决这个问题，Chen等人使用赖氨酸作为支架来合成单体、二聚体和四聚体树枝状肽，提高了示踪剂的化合价，并提高了它们对IC的结合亲和力。示踪剂的亲和力随着化合价的增加而显著增加，四聚体示踪剂的亲和力比单体示踪剂高10倍。噬菌体展示肽往往优于合成肽，主要有两个原因。首先，噬菌体展示技术有助于维持肽的特异性构象，这对结合至关重要。噬菌体外壳蛋白提供的结构完整性确保了肽采用必要的构象与其靶标有效相互作用。其次，由于噬菌体表面没有天然存在的多价结合位点，合成的单价肽的结合亲和力往往低于噬菌体展示肽。
图4:使用不同的噬菌体展示文库制备抗IC抗体
3. 自主多样化库
自主多样化库（ADLib）是另一种基于体细胞高突变的抗体生产系统：使用曲古抑菌素A（TSA）抑制鸡法氏囊淋巴瘤细胞（DT40）的组蛋白脱乙酰酶活性，促进组蛋白乙酰化，引起免疫球蛋白基因的高频重组。DT40细胞可以表达膜结合IgM，使其成为B细胞受体（BCR）显示和抗体产生的潜在系统。然而，DT40-Ig基因座的基因转换频率并不高，只有一小部分细胞在传代几周后发生基因转换。因此，有必要显著提高Ig基因的转化率。TSA介导的组蛋白乙酰化导致在细胞表面显示膜IgM文库，然后使用抗原包被的磁珠从文库中分选抗原特异性细胞，并培养产生分泌性IgM抗体（图5）。
ADLib能够快速方便地产生针对各种抗原的特异性IgM抗体，而不需要动物免疫。这种方法特别适用于筛选保守的抗原、自身抗原或毒素，但很难获得高亲和力抗体，亲和力通常在10-7M至10-8M之间，需要进一步的亲和力成熟。此外，产生的IgM抗体是五聚体，稳定性较差，更难纯化。表2总结了制备抗IC抗体的不同方法的比较。
图5：使用ADLib制备抗体
表2：抗IC抗体制备方法的比较
【抗IC抗体与SMA-Ab1的相互作用】
许多研究证实，SMA与抗体活性位点的结合会诱导抗体的构象变化。Nemeth等人使用各种光谱方法研究了作为半抗原的FITC（异构体I）与特异性单克隆IgG1之间的相互作用。结果表明，在FITC结合后，抗体高变区和FITC之间的特异性结合区的水合水平显著降低，从而改变了分子运动。微环境的这种变化影响了抗体和半抗原的功能。此外，半抗原的结合不仅在CDR区，也在抗体的恒定区诱导构象变化。
Qaraghuli等将SMA-Ab1 IC的结构与游离抗体进行了比较，确定了SMA与Ab1结合后变化的三个趋势：（1）形成口袋以容纳SMA；（2）SMA绑定后口袋消失；（3）口袋保持不变或几乎不变，如图6所示。这些结合位点的动态突显了CDR环，特别是CDR3，在使抗体的结合位点调节适应各种抗原结构方面的重要作用。
在SMA与Ab1结合后，抗IC抗体识别由SMA和Ab1可变区组成的构象表位，而不是氨基酸的线性序列。抗IC抗体与IC的结合可以显著降低SMA的一级解离速率，使其延迟数倍甚至数百或数千倍。抗IC抗体延迟SMA解离速率的机制可能与Ab1可变区振动动力学的显著降低有关。
基于抗IC试剂的非竞争性试验的特异性增强在于抗IC抗体与SMA-Ab1之间的特异性相互作用。抗IC抗体识别由IC内的Ab1的半抗原和可变区组成的表位。这种特异性对于夹心免疫分析的高灵敏度和特异性至关重要。例如，Omi等开发的E2的抗IC抗体与E2-mAb IC结合，当E2在C6位置被生物素化E2取代时，反应性极小。这说明抗IC抗体识别E2-mAb IC内携带C6位置的E2部分（图7）。类似地，25（OH）D3夹心试验的抗体显示与生物素化25（OH）D3的弱反应性，证实抗IC抗体特异性识别IC中25（OH）D3的C3位置周围的区域。这些相互作用不仅是由于单独的半抗原，而且显著地受到Ab1结合半抗原时诱导的构象变化的影响。总之，半抗原-抗体复合物中抗IC抗体的结构识别是半抗原、Ab1可变区和结合后诱导的构象变化之间的复杂相互作用。这种复杂的结合机制构成了非竞争性夹心免疫测定优于传统竞争性形式的基础。
图6：SMAs与Ab1结合后的三种变化趋势
图7：使用抗IC抗体检测E2
【基于抗IC试剂的SMA免疫检测应用（表3）】
1. 抗IC试剂在毒素和药物滥用中的应用
Peltomaa等利用单克隆抗黄曲霉毒素小鼠抗体和从合成抗体文库中选择的抗IC scFv建立用于快速检测黄曲霉毒素的一步夹心荧光测定法。该方法的LoD为70 pg/mL，检测时间在15 min内。在该试验中，scFv与碱性磷酸酶（AP）融合，避免了直接标记scFv，从而保留了其结合活性，如图8所示。除scFv外，噬菌体展示肽可用于小分子夹心检测。Zou等分离了黄曲霉毒素B1纳米抗体Nb28具有高亲和力的肽，在4轮淘选后，使用噬菌体展示从随机线性8-mer肽文库中筛选出复合物，建立黄曲霉毒素B1的化学发光免疫分析。
2. 抗IC抗体在临床诊断中的应用。
近年来，日本Fujirebio股份有限公司在LUMIPULSE平台上推出了25-羟基维素D和醛固酮的夹心方法，深圳新工业生物医学工程有限公司在Maglumi系统上开发了E2、总三碘甲状腺原氨酸和他克莫司的夹心方法。这些方法在临床测试界引起了广泛关注。Lanja等以LC-MS/MS作为金标准，系统地评估了LUMIPULSE 25-羟基维生素D夹心法与Abbott、Beckman和Roche的三种商业竞争方法的性能，发现夹心法精度较高，适合作为常规临床检测方法。
3. 抗IC试剂在农药残留检测中的应用
在农药残留检测中，抗IC试剂的应用显著提高了灵敏度，并实现了对各种化合物的快速现场分析，包括孔雀石绿、隐形孔雀石绿、异恶草酮、钼酸盐、阿特拉津、3-苯氧基苯甲酸和苯并噻虫啉等。Gonzalez-Techera等将噬菌体抗IC粒子集成到电化学传感器中，建立了一种新的阿特拉津电化学检测方法，特异性识别阿特拉津和Ab1的IC，LoD为0.2 pg/mL，比用相同Ab1建立的竞争性ELISA方法灵敏200倍，检测范围也扩大了10倍。该检测方法可以直接使用未稀释的河水样本，无需前处理，适用于快速现场检测。
表3：SMAs抗IC免疫分析汇总
【总结】
抗IC试剂的使用在克服传统竞争性免疫测定的局限性方面显示出巨大的潜力，特别是在灵敏度、精密度、特异性和动态范围方面。首先，关于提高灵敏度，基于抗IC的非竞争性方法比竞争性检测的灵敏度提高了几倍到几百倍，从而可以更准确地检测SMA。其次，在提高特异性方面，Ab1与SMA和抗IC抗体结合的双重识别机制，识别形成的IC、通过减少交叉反应性和基质干扰提供更高的特异性。这种增强的特异性对于检测结构相似的分析物和确保准确的结果特别有益。第三，抗IC抗体的多功能应用扩大了SMA检测在临床诊断、食品安全和环境监测等领域的可能性。关于未来的研究方向，首先，需要更全面地了解IC形成时发生的构象变化。进一步探索SMA-Ab1亲和力与这些结构变化之间的关系将有助于生产具有最佳结合特性的抗IC抗体。其次，尽量减少交叉反应仍然是一个挑战。研究抗IC抗体以更高的选择性识别IC的机制，特别是在存在结构类似物的情况下，对于提高检测特异性至关重要，尤其是在复杂的样品基质中。最后，探索制备抗IC抗体的新方法，如使用免疫文库和单B细胞技术，可以提高抗IC抗的生产效率和特异性。
原文出处：
Du, K., He, H., Zhao, L., Gao, L. & Li, T. Application of Anti-Immune Complex Reagents in Small Molecule Analyte Immunoassays.ACS Omega 9, 45688–45705 (2024).
https://doi.org/10.1021/acsomega.4c07268
指导老师：王战辉
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