浆细胞(PC)是体液免疫的终端效应器，它们通常在体外存活时间很短。虽然体外生成抗体分泌细胞（ASCs）是一项由来已久的技术，但人类PC研究的主要困难是缺乏体外系统来生成和维持成熟的、长寿命的PC。已有一些体外生成ASCs的体系，但在大多数情况下，分化细胞不能获得成熟PCs，而保持在浆母细胞阶段。即使已报道了体外产生的ASCs表型成熟，但表型也是不完整的，或者PC存活时间短且可变，没有延长寿命的迹象。 本研究作者从外周血B细胞中产生多克隆的长寿命的人PC。经过增殖的成浆细胞阶段后，PC持续没有细胞分裂，其活性仅受选择性培养终止的限制。保守预测PCs的预期寿命为300d，但一些细胞的寿命有可能更长。这些长寿的PC优先来源于记忆B细胞，并获得类似于人骨髓PC的CD138高表型。整个系统的基因表达分析定义了具有相关动态和关联功能特征的基因簇，且这些分化簇中的基因在体外和体外PC中表现出相似的整体表达模式。在体外，PC被完全重新编程到分泌状态，并适应它们的分泌负荷，在没有XBP1 mRNA剪接的情况下，IgG的分泌保持在120 pg/细胞/天。本研究建立一套足以在体外发育和维持成熟人类PC的条件，从而探索和操作人类PC分化的各个阶段。
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1、 体外产生PC群
在体内，T细胞依赖型B细胞激活与长寿PC的发展有关，而IL-21的参与决了PC的命运。作者基于CD40L、IL-21和IL-2组合产生的浆母细胞，改进了最佳细胞数量和活力包括F(ab’)2 anti-IgG/IgM刺激B细胞受体和补充培养基。培养6天后发现从B细胞到浆母细胞的表型转变。这些细胞至少获得CD138的表达，这是与更成熟的PC阶段相关的主要表面标志。随后，驱动浆母细胞群体向成熟的浆细胞表型发展。评估了细胞因子支持PC成熟到第13天的能力，因为这符合短期PC的预期存活时间。IL-6和IFN-a的加入促进了CD138表达的获得，此外，IL-21增加了这一群体的规模（图1A，1B）。随后对基质支持的影响进行了研究，因为造血干细胞和PC占据了相关的位置，所以作者使用了M2-10B4细胞，它支持人骨髓干细胞的长期培养。该间质层显著增加了第13天成熟PC的数量，导致CD138+细胞持续增加2-3倍(图1C，1D)。基质细胞支持存活而不是分化，因为群体在第13天显示出相似比例水平的CD138表达。在该条件下，PC群体可以存活到第20天（图1E）。在这种分化过程中，表面抗原遵循预期的表达模式（图2）。CD20降低，CD27缺失，CD38和HLA-DR增强，CD30的获得区分活化的B细胞/前浆母细胞阶段。CD20缺失、CD30缺失、CD27强表达、CD38增高、CD138缺失是浆母细胞的主要特征。第10天观察到的CD138表达与CD38增强和HLA-DR进一步丢失相关。CD32b、CD38、CD138峰值和HLA-DR缺失是第20天PCs的特征。CD19在浆母细胞和PC上的表达先增加后下降，并维持在较低水平（图3C）。2、 细胞分裂与PC分化
细胞分裂和抗体分泌是相关的，浆母细胞和PC之间最简单的区别是前者保持在细胞周期中，而后者则不是。因此，作者研究在这个系统中，在细胞分裂停止之前，浆母细胞表型成熟为PC是否伴随着额外的几轮增殖。B细胞活化后，在3天内经历了至多4次分裂。在为最大细胞数优化的条件下，第6天的细胞分裂程度导致CFSE稀释到检测范围的极限。为了跟踪成熟浆母细胞的分裂，在第6天加入CFSE。发现第10天的大多数CD138+细胞表现出明显的CFSE稀释。而在第13天和20天之间，整个群体中没有进一步的CFSE稀释（图3A）。第13天负载CFSE的细胞被跟踪到第20天，以证实这一观察结果，种群保持单峰状态，不分成亚种群（图3B）。7d内的总衰变程度与未分裂的淋巴细胞群体相当。随后，作者评估了细胞周期状态(图3C)。虽然在第6天有20%的浆母细胞处于G2/M期，而到第10天，G0/G1组分占总数的93.9%，第13天达到98%，到第20天保持不变。因此，细胞分裂伴随着浆母细胞向PCs的成熟，但是PCs在没有额外的细胞分裂的情况下仍然存在。为了排除由于CD40或BCR依赖信号的残余影响而导致PC前体快速循环的可能性，作者评估了PC培养细胞表面Ig和CD40的表达，以及对CD40或BCR刺激的增殖反应。发现表面L链染色在培养第6天消失；相反，CD40表达在第6天下调，但在PC上重新表达(图3D)。培养第20天的总分化细胞负载CFSE，暴露于BCR或CD40激动剂后无增殖反应。因此，第20天的群体对刺激是不敏感的，刺激在分化的早期阶段促进了快速增殖。值得注意的是，在第10天表达CD138的细胞在第20天产生CD138高表达细胞，而在第10天低/无表达CD138的细胞在第20天显示CD138的平均荧光强度降低了5倍（图3E），表明培养条件促进PC在没有增殖的情况下存活。3、 基质的接触无关性
由于接触依赖和独立的机制支持PC在体内的存活，所以作者进一步研究基质支持是否是接触依赖的。当基质细胞保持在转移腔时，PC的基质支持是接触无关的，因为从上腔获得的PC多2-3倍(图4A)。事实上，从有基质细胞的培养中恢复的PC绝对数比在直接接触培养中观察到的要多(图4B)。4、 PC体外的持续存活
接下来，对培养环境进行了优化，加入了定期更换50%的培养基以延长培养持续时间。在所有捐赠者中，成熟的PC作为一个有活力的群体持续存在到第62天选择性培养终止的点(图5A)。在第62天，从形态学上观察PC是活的，并显示出成熟PC的特征(图5B)。细胞总数在延长的培养间隔内缓慢衰减，趋于平台期(图5C)。正常的人骨髓PC(包括长寿的PC群体)的一个明显特征是CD138非常强的表达，从第34天起，可观察到在体外生成的PC与在骨髓PC有相同水平的CD38和CD138的表达（图5A，5D）。5、 IgHV多克隆与超突变状态
随后作者评估了存活62的PC表达IGHV的重排情况，来判断长寿PC的前体是多克隆还是一种单克隆选择。虽然不能确定所有的功能重排都被检测到，但观察到的独特IGHV重排与PC的比率在1：4到1：20之间(一个供体的900个PC中有212个独特序列，另一个供体中有2000个PC中的104个独特序列)，这表明第62天的PC是广泛的多克隆。虽然PC是由包括初始和记忆细胞在内的全部外周血液B细胞的多克隆激活而来的，但在第62天的PC中，93%的表达功能性IGHV重排显示出体细胞高度突变的证据(图6B)。在重排的IGHV基因群体中，相对于框架区域，CDR中观察到更高的替换到沉默突变率，在框架区域中的替换/沉默比率≤2%(图6C)。因此，第62天的PC来自经历了体细胞超突变的B细胞群体，总体突变模式与功能性Ag受体的选择有关，这与记忆B细胞后代的优先存活一致。6、 基因表达动力学
为了评估基因调控的动态，对整个序列的可变区基因中定义了具有相似时间调控模式的基因簇。定义了50个基因簇，平均大小为66个基因，平均稳定性为97.4%。系统聚类法用来建立这些分化簇之间的相互关系，并强调基因调控的一般模式重复出现（图7）。通过对GO富集的分析，评价了团簇的生物学意义。正如预期的那样，在分化过程中最初被抑制的簇富集了与Ag受体信号、淋巴细胞激活和质膜成分相关的基因。在静止的B细胞中表达的簇和在激活的B细胞中诱导的簇富含与翻译延伸、RNA剪接和从头蛋白折叠有关的基因。在激活的B细胞中诱导的簇，在静止的B细胞中不表达，与细胞周期和有丝分裂细胞周期密切相关。这些簇在第6天的成浆细胞中低水平表达，在PC中被沉默。在PC中特异性诱导的簇与内质网(ER)和高尔基体隔间、蛋白质修饰和核小体组装有关。在浆母细胞中诱导的簇和在PC中持续的簇包括与未折叠蛋白反应(UPR)和内质网结构成分相关的大部分基因。相反，在活化的B细胞中诱导并在随后的分化过程中保持的簇富含与氨基酸代谢过程、电子传输链和对锌离子的反应有关的基因。7、 通用的核心表达特征
随后，从表达谱水平上评估了体外生成的和原代人骨髓PC之间的关系。作者从骨髓样本中分离出PC，通过流式细胞仪确定为表型正常的PC。从13名捐献者中分离出PC，其中3名作为单独样本进行分析，10名作为混合池进行分析。对于大多数终末分化簇，骨髓PC显示出与体外生成的长寿命PC相似的表达水平；分泌基因簇强表达，而B细胞，活化的B细胞，浆母细胞簇相对于在骨髓中和体外PCs中被抑制。相反，与氨基酸代谢、电子传输链和对金属离子的反应相关的基因簇(19、30和36)在体外衍生的PCs中的表达更强，这些基因簇具有适度的动态范围，并在骨髓PCs中保持显著的绝对表达水平。之后，作者考虑了BCL2家族的抗凋亡和促凋亡成员，骨髓PCs中的抗凋亡成员MCL1高表达。在第41天有较高表达的基因中，150个属于分化簇，而95个基因没有明显的GO术语关联。在分化簇中，骨髓pc谱中表达较高的基因更常与分化的早期阶段相关，而第41天pc过度表达的基因更常与分化后期表达的簇相关。因此，在PC分化过程中动态调节的主要基因组在两种来源的PC之间表达相似，证实了这些细胞共享核心基因表达谱，以及预测的延长寿命。8、 PC功能与适应性
为了证明PC功能与分泌基因的表达谱平行，测定细胞上清的Ig成分。用50%的培养基替换进行培养；所以在没有Ig分泌的情况下，整个培养物的浓度应该以连续2倍的稀释度下降。IgM和IgG显示出相反的模式，IgM迅速下降，接近零，而IgG水平缓慢下降，接近平台期（图9A）。将每次细胞评估前3.5天的IgG分泌量除以评估时的细胞数量。平均每细胞IgG分泌速率在第20天达到峰值，约为150pg/细胞/天，然后恢复到稍低的平台期，平均IgG分泌速率约为120pg/细胞/天。相反，IgM分泌率没有达到平台期，从第20天的220pg/细胞/天的峰值下降到第62天的21pg/细胞/天（图9B）。因此，存活的PCs没有丢失功能，在体内长期存活更偏向于IgG分泌。与成功适应分泌负担一致，第62天成熟的PC中基本上检测不到剪接的XBP1mRNA。然而，当用还原剂和经典的内质网应激诱导剂DTT处理时，这些细胞保持了剪接XBP1 mRNA的能力（图9C）。因此，第62天的PC在稳定状态下几乎没有显示出持续的内质网应激的证据，并且通过持续表达多个分泌途径基因来适应它们的分泌负荷。图1.体外培养的PC群体的生成。
图2.分化B细胞培养的表型成熟。从0天到20天整个培养过程中观察到的表型变化的典型例子。每个Ag表达的直方图如图顶部所示，峰值表达点(平均荧光强度)用黑色表示。这些结果代表了与三个独立捐赠者进行的实验。
图3.PC在没有细胞增殖的情况下持续存在。
图4.基质效应与接触无关。
图5.PC的长期存活伴随着逐渐的表型成熟。
图6.长寿PC是多克隆的，大多表达突变的IGHV基因。
图7.体外长期存活的PC被重新编程为分泌活动，并与骨髓PC共享核心基因表达模式。
图8.在稳定的培养条件下，与长寿PC相关的基因表达增加。
图9.长寿命的PC已经适应了分泌负担。
本研究确定了一组条件，这些条件概括了PC生态位在体内的基本功能，保持了一个长寿和表型独特的PC群体。这个模型系统提供了一种工具，可以用它来解决健康和疾病中的PC生物学相关的一些关键问题。Cocco M, Stephenson S, Care MA, et al. In vitro generation of long-lived human plasma cells. J Immunol. 2012;189(12):5773-5785.
https://journals.aai.org/jimmunol/article/189/12/5773/86156
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