简介
基于DNA修饰半抗原（DNA-decorated hapten, DDH）的免疫检测具备卓越的灵敏度、特异性和可靠性。DDH结合了识别元件（半抗原）和信号传递元件（DNA部分），利用可编程的DNA结构，在识别后触发信号传递，从而为免疫检测引入了一种新的信号传递机制。本综述总结了近年来基于DDH的免疫检测的研究进展，这些方法旨在检测特定的小分子化合物和抗体。根据抗体与DDH结合的信号，我们将这些研究分为三类：（1）基于抗体结合诱导DNA构象变化的免疫检测；（2）基于抗体结合诱导核酸共定位的免疫检测；（3）基于抗体空间位阻效应的免疫检测。此外，本文还讨论了基于DDH的免疫检测的基本要素，包括DNA结构设计、信号转化原理以及检测平台。最后，文章探讨了DDH免疫检测在食品安全、医学诊断和环境监测领域的代表性应用，并展望了其面临的挑战和未来发展方向。
1 基于抗体结合诱导DNA构象变化的DDH免疫检测
1.1 构象变化诱导DNA Cargo 链的释放
受运输蛋白启发，Valleé-Beĺisle和Ricci团队开发了一种由抗体控制的三链DNA纳米机器（图1A），该纳米机器能在特定抗体存在时释放DNA链。该纳米机器由三链DNA构成，利用Watson−Crick (−)和Hoogsteen (•)相互作用形成夹扣结构，用于识别特定DNA链，且两端标记地高辛（Dig）半抗原作为抗体识别元件。当抗体与DNA两端的半抗原结合时，三链复合物发生构象变化，导致Cargo从纳米机器中释放。研究表明，这种机制具有广泛适用性，能够实现可逆加载与释放DNA 链。此外，纳米机器结合电化学发光（ECL）传感器（图1B），进一步增强了DDH免疫检测的灵敏度。通过结合酶辅助的循环链置换反应（CDSR），这种系统展示了6.7 pM的低检测限，并具有广泛的线性范围（0.01-200 nM），显著提高了抗Dig抗体的检测准确性和灵敏度。
图1. 构象变化诱导DNA Cargo链的释放：(A) 光学信号和 (B) 集成ECL平台。DNA构象变化引起的供体和受体之间距离的变化：(C) 基于茎环结构（使用的荧光猝灭组分：FAM–BHQ），(D) 基于可切换DNA镊子的（使用的比率荧光组分：绿色AgNCs和红色AgNCs），(E) 基于DNA承载发夹探针（双重AgNCs），(F) 基于DNA折纸纳米技术
1.2 构象变化诱导供体和受体之间的距离变化
DNA构象的变化能引起供体和受体之间的距离变化，从而生成响应信号。Ranallo等人设计了一种基于茎环DNA结构的免疫检测平台，该平台通过抗体结合打开茎环，增强荧光分子/猝灭分子对的发射（图1C）。该平台由荧光和猝灭分子修饰的DNA茎环系统和带有半抗原修饰的单链DNA组成，能够通过抗体结合触发构象变化，实现灵敏检测。另外，He等人开发了具有镊子形状的DNA结构（图1D），该结构通过自组装银纳米簇生成比率信号。设计具有两个相同半抗原位点的DNA，通过抗Dig抗体的结合使得结构伸展并发生构象变化，导致荧光信号反转，检测限为88 pM。Xu团队结合光激电子转移（PET）系统和DDH（图1E），该系统通过双价抗体的结合使DNA构象发生变化，增强荧光信号，达到0.31 pM的高灵敏度。此外，DNA折纸纳米技术也用于检测单分子抗体（图1F），通过构象变化触发荧光信号发射，且在便携式智能手机显微镜上实现了单分子抗Dig的检测。
2 基于抗体结合诱导核酸共定位的DDH免疫检测
2.1 抗体与DDH重组“功能单元”以触发下游事件
抗体与DDH的相互作用可引发核酸链的共定位，进而促成“功能单元”的形成，并激活下游反应。例如，Sorrentino和Ricci提出了一种新方法，利用功能单元作为分子输入，控制DNA纳米结构的组装与解组装。具体来说，输入链被分为两个部分（图2A），分别通过聚T尾巴与半抗原结合，促进与目标抗体的结合。当抗体与这两条链结合时，核酸链共定位，启动茎结构的形成并激活链置换反应。优化的热力学平衡确保了抗体结合后的稳定性。这种方法支持多重检测，能够在同一溶液中检测多个目标分子。进一步研究表明，通过电化学DNA回路和“功能单元”利用，成功实现了9 nM的检测限（图2B），即使在90%的牛血清中也保持高特异性。通过酶放大步骤，该平台提升了灵敏度，检测限可达到1 pM（抗Dig）和3 pM（Anti-DNP）Jiang团队利用“功能单元”触发H1和H2发夹探针之间的可编程杂交链反应（HCR），验证该“功能单元”响应的链反应（图2C）。I1和I2链上标记了Dig，特异性与抗Dig结合。I1和I2分别由互补的六碱基对组成，设计为低温稳定，避免室温下的误结合。抗体结合后，两个链的局部浓度增加，形成“功能单元”，启动HCR反应，增强荧光信号。H1的茎区修饰荧光分子（FAM）和猝灭分子（BHQ-1），破坏FAM/BHQ-1对，放大荧光信号，抗Dig的检测限为0.032 nM。Xu团队深入研究了“功能单元”介导的HCR。所用的DNA结构如图2D所示，其中识别单链DNA（RS）装饰有Dig半抗原，辅助链（HS）未做修饰，而报告链头发状探针（RH）和猝灭链头发状探针（QH）在3'末端分别标记了荧光分子Cy3和BHQ-2。在加入抗Dig后，两个Dig分子通过目标结合相互连接，使DNA结构转变为稳定的构象，增强了结构的刚性，同时也导致3'端的Cy3标记茎结构的打开。QH因此展开，启动了HCR反应，形成长链双螺旋，带来了多个Cy3和BHQ-2的紧密接近。结果，Cy3的荧光强度被BHQ-2猝灭，且猝灭程度与抗Dig的浓度相关，从而使得在酶无放大的情况下实现了皮摩尔浓度的高灵敏度定量检测。该方法的LOD为8.1 pM，比前述方法提高了4倍。Patino Diaz等人开发了细胞自由核酸诊断平台，通过工程化DNA模块在目标抗体结合时诱导转录产生荧光RNA适配体（图2E）。转录模块包含RNA输出区、T7启动子和开关元件，激活后启动转录生成Mango或Spinach适配体。该方法具有低纳摩尔级高灵敏度和优异特异性，且操作简便。尽管与直接信号转导方法相比较为复杂，仍展现了巨大的创新潜力。Bracaglia等人简化了该平台，设计了简化版转录开关ECL免疫传感器（图2F）。该系统通过“功能单元”形成后，恢复启动子功能并激活转录过程，最终通过电极检测RNA适配体，检测限为1.5 nM，比传统方法高效约两个数量级。
图2. 在核酸共定位的过程中，抗体和DDH重构成一个“功能单元”，激活链置换反应，具体表现为：（A）基于光学信号的检测，以及（B）与ECL平台集成用于ECL信号输出。抗体和DDH重构成“功能单元”以（C）触发HCR反应，并（D）报告发夹辅助的HCR反应。（E）由抗体/DDH“功能单元”触发的细胞自由检测平台，用于光学信号输出；（F）进一步简化的细胞自由检测平台，用于ECL信号输出。在核酸共定位的过程中，DNA结构的构象发生变化，用于小分子检测，具体基于：（G）由15个碱基尾巴支撑的茎环构象；（H）茎环DNA探针；和（I）抗体桥接信标。
2.2 核酸的共定位诱导DNA结构构象变化
抗体与DDH结合后，核酸链共定位触发DNA结构变化。例如，Ricci团队设计了一个基于茎环DNA结构的检测方法，通过抗体结合触发核酸共定位，增强荧光信号（图2G）。该系统由三部分组成：带荧光分子和猝灭分子的DNA茎环、半抗原修饰的DNA链及其互补序列。抗体结合后，茎环打开，显著增强荧光信号。该平台可以扩展应用于小分子检测，采用两种DNA模块（报告模块和输入模块）。茎环DNA探针被FRET修饰并带有扩展的单链，能与DDH链杂交形成报告模块（图2H）。输入模块也包含DDH，能够与互补的DNA输入链杂交。当抗体结合时，报告模块和输入模块会靠近并增强荧光信号；但当小分子目标存在时，它们与输入模块竞争结合，减少荧光信号。优化条件下，该免疫传感器能线性检测小分子目标，如毒酸和2,4-二硝基苯酚，检测限分别为7 ± 2 nM和20 ± 3 nM。此外，Yan等人开发了简化的抗体桥接信标（AbB）方法（图2I），通过茎环结构与荧光/猝灭分子结合。当没有目标时，F和Q距离近，导致低荧光；目标结合后，茎环破坏，F和Q距离增大，荧光增强。优化后，该方法以低纳摩尔级检测生物素（13 nM）和Dig（28 nM）。
3 基于抗体空间位阻效应的DDH免疫检测
3.1 抗体空间位阻效应抑制酶或其他DNA与DDH的结合
CRISPR-Cas12a系统以其高特异性和效率，在基因编辑、诊断和治疗中展现潜力。近年来，Cas12a的副切割活性被应用于超越传统核酸检测的创新技术，但其在检测小分子和抗体时多依赖适配体，限制了应用。为扩展其范围，Park团队结合DDH和抗体-半抗原的空间位阻效应，开发了一种蛋白质和小分子检测方法（图3A）：目标蛋白不存在时，DDH激活Cas12a切割探针，产生荧光信号；存在时，目标蛋白抑制激活，信号减弱，抗Dig的检测限为0.09 nM。此外，Zhu等人提出的CRISPR-Cas12a辅助检测可灵敏检测生物素、Dig和叶酸，检测限分别为12.5 pM、63 pM和0.39 nM。
抗体-空间位阻效应还用于杂交链反应（HCR）检测药物小分子。基于该效应的DDH免疫检测结合HCR，设计了启动DNA链调控反应速率：抗体结合小分子时抑制HCR反应，解离后恢复反应，检测小分子达纳摩尔浓度，4分钟内完成，且在50%血浆中仍有效（图3B）。该方法快速、简单、经济。类似地，空间位阻效应用于抗体调控的核酸超分支滚环扩增（HRCA）。当抗体结合Dig标记的引物时，抑制HRCA反应；加入自由Dig分子后，抗体解离，恢复反应（图3C）。HRCA产物与SYBR Green I混合产生荧光信号，Dig和抗Dig的线性检测范围分别为1 nM至100 μM和1 nM至100 nM。此外，抗体可启动等温链置换扩增（ACISDA）。引物编码诺氟沙星（NOR），模板含识别序列和富G序列（图3D）。目标分子缺失时，抗体阻止扩增；存在时，抗体解离激活扩增，检测范围为0.1−500 ng/mL，检测限达0.04 ng/mL。该方法避免洗涤和固定步骤，灵敏度高于ELISA和LFIA。
图3. 基于抗体空间位阻效应的DDH免疫检测示意图。结合位点的空间特性变化影响以下事件：(A) 抑制Cas12a酶对激活DNA的访问；(B) 抑制启动链触发HCR反应；(C) 抑制超分支滚环扩增过程；(D) 抑制等温链置换扩增反应；(E) 降低DNA杂交的稳定性，从而触发链置换的转变；(F) 降低DNA杂交的稳定性并触发链置换；并且降低DNA杂交效率用于（G）基于抗体检测的ECL平台和（H）基于小分子检测的ECL平台。
3.2 抗体空间位阻效应降低DNA杂交的稳定性
Gothelf团队利用抗体与DDH结合的空间位阻效应，开发了一种在血液溶液中检测Dig的方法（图3E）。该方法包括目标识别的小分子与寡核苷酸链结合和通过FRET（荧光共振能量转移）实现信号传递。系统由三条DNA链组成：装饰Alexa-647的DNA链A、修饰Dig半抗原的DNA链B和装饰Alexa-555的DNA链S。链S与链A和链B的序列互补。在没有抗Dig抗体时，系统处于低FRET状态，抗体结合后转为高FRET状态。抗体与Dig结合时，因空间位阻效应，系统回到低FRET状态。FRET值变化可用于检测Dig浓度，具有高度特异性，能在血液样本中检测到低至10 nM的Dig浓度。
Peng等人提出了一种基于空间位阻效应抑制链置换免疫检测的方法，用于检测人血清中的抗体。该方法使用修饰的寡核苷酸序列，包括Dig半抗原修饰的探针（Dig-MP）和竞争序列（Anti-AFP-CP）（3F）。首先，分子信标（MB，带FAM和Dabcyl猝灭对）与Dig-MP退火，形成部分双链DNA。Anti-AFP-CP结合后触发链置换反应（SDR），置换MB并恢复其发夹结构，导致荧光信号减弱。当Anti-Dig与Dig-MP/MB双链结合时，抗体通过空间位阻效应阻止链置换反应，从而抑制信号。该方法的检测限（LOD）为5.6 nM，并且与ECL平台结合后，Anti-Dig的LOD提高到0.67 nM，灵敏度提升了约8倍。
3.3 抗体空间位阻效应降低了DNA杂交的效率
Mahshid等人开发了基于DDH的ECL免疫传感器，利用抗体的空间位阻效应检测抗体和小分子。该传感器可在复杂全血样本中同时检测多个抗体，10分钟内检测Fab片段、链霉亲和素、抗Dig（IgG）和抗DNP（IgE），并具有低检测限(3G)。通过多个电极，平台还能快速检测小分子（如Dig和TNT），在全血中定量分析。该传感器通过电化学信号变化实现检测，当自由分析物存在时，信号增强；不存在时，空间位阻效应减少信号(3H)。检测限为1 nM，适用于全血样本中的Dig检测。
4 其他参与途径
4.1 大质量-电荷比
抗体和DDH可与仪器分析方法结合使用，激光诱导荧光毛细管电泳（CE-LIF）因其高灵敏度、快速分析和低试剂消耗，适用于复杂样本中的痕量分析。Zhao团队开发了一种通过三功能DNA探针介导的免疫检测方法。该探针包含三个组件：半抗原用于与目标抗体结合，信号报告分子用于荧光检测，DNA的负电荷有助于毛细管电泳分离。抗体与探针结合后，负电荷改变质量电荷比，促进复合物与未结合探针的分离。在目标物存在时，目标分子与抗体竞争结合，导致未结合探针的峰值增加。该方法已成功用于在纳摩尔级检测Dig和黄曲霉毒素A（OTA），并表现出优于或与其他方法相当的分析性能。
4.2 蛋白质诱导的荧光增强与猝灭（PIFE/PIFQ）
在之前的研究中，基于抗体空间位阻效应的链置换竞争（SDC）检测法被用于血浆中Dig的测定，并扩展到检测达比加群、甲氨蝶呤和利奈唑胺等临床药物。研究发现，初始孵育几分钟内，FRET信号发生了快速变化，进一步分析显示SDC检测的动力学呈双相变化。抗体通过扰动DNA双链的热力学过程，逐渐引发信号增加，并通过PIFE（荧光增强）或PIFQ（荧光猝灭）效应影响邻近供体的荧光发射。基于这些发现，研究人员开发了一种基于SDC的快速读取检测法，能够在3分钟内定量检测低纳摩尔级别的目标分析物。通过简化检测模式，去除A链后，检测仅基于抗体对供体荧光分子的影响。基于DDH/抗体平台的PIFE方法在达比加群检测中，提高了效率，且不依赖时间，较传统方法更具优势。
5 基于DDH的免疫检测的挑战与展望
尽管近年来基于DDH的免疫检测技术取得了进展，但仍面临一些局限性和挑战。首先，地高辛作为常用靶标，由于其标记过程标准化且容易实现，常用于研究中。然而，其他靶分子标记过程复杂，难以控制标记的准确性和纯度，限制了DDH技术的应用。其次，尽管该技术具有较高的特异性和灵敏度，但实际样本（如食品、医学和环境样本）的复杂性可能干扰灵敏度，甚至导致假阴性结果。最后，DDH在免疫检测中的应用仍处于初期阶段，需要进一步改进和发展
考虑到上述挑战，我们认为以下几点对于未来设计新的基于DDH的免疫检测方法将具有积极的推动作用： (1) 半抗原标记策略应给予更多关注。地高辛标记是生命科学中最为多样化、广泛应用且易于获取的修饰方法之一。遗憾的是，对于其他小分子，需要额外的标记步骤。因此，带有特定官能团（如羧基、氨基和环氧基团）的半抗原在与DNA偶联中起着至关重要的作用（DNA上官能团的修饰可以由DNA合成公司提供）。接下来，DNA与半抗原的偶联可通过酰胺化反应等方式实现。半抗原与DNA偶联后，DDH的纯度过程也非常重要，因为低纯度的DDH会影响后续免疫检测的灵敏度。 (2) 修饰在DNA上的半抗原不应影响与抗体的结合。抗体与标记在DNA上的半抗原的结合在DNA-半抗原基础的免疫检测中具有重要意义。因此，在半抗原结构修饰过程中，不应遮蔽抗体识别表位。为了正确修饰半抗原，需要了解特定抗体的识别位点（即一些官能团和特殊原子）。除了结合位点，抗体与半抗原结合的IC50值和动力学也是需要考虑的重要因素。解离常数（KD）与亲和力成反比，意味着较低的KD值（反映较低的浓度）对应较高的抗体亲和力。IC50值是间接竞争性ELISA标准曲线中的关键参数之一。通常，较低的IC50值表示更高的抗体特异性和更大的检测灵敏度。高亲和力抗体的KD值通常处于低纳摩尔（10−9 M）到皮摩尔（10−12 M）范围。一般来说，高IC50值和高KD值（解离速率常数Kd/结合速率常数Ka）不利于均匀免疫检测方法的建立。 (3) DNA纳米机器的设计与预测对于基于DDH的免疫检测至关重要。并且应进一步拓展研究通过抗体与新型DNA纳米机器结合触发的新检测模式，因为这可能是提高基于DDH的免疫检测可扩展性的关键。 (4) 对灵敏度的追求是将DNA作为信标引入免疫检测的关键原因。然而，我们在这里描述的大多数基于DDH的免疫检测方法——包括“基于抗体结合诱导DNA构象变化的DDH免疫检测”和“基于抗体结合诱导核酸共定位的DDH免疫检测”——并未涉及任何信号放大步骤（无论是化学的还是酶促的）。这意味着，这些平台的检测限可能高于ELISA，因为固定荧光和电化学检测模式本身的灵敏度较低。引入酶催化步骤到设计中，可能提高基于DDH免疫检测灵敏度。 (5) 基于DDH的免疫检测方法在分析物检测中的应用场景尚未完全探索。在食品安全、环境监测和临床诊断领域，利用基于DDH的免疫检测方法对更多类型的分析物进行探索，将具有很高的价值。
综上，我们期望本文能够加深读者对基于DDH免疫检测的理解，并激发新的研究方向，推动该领域的快速发展。跨学科合作与技术创新，特别是人工智能和机器学习，将在推动DDH技术创新中起到关键作用，进一步完善和扩展基于DDH的免疫检测能力。
原文出处：Wang, X., Dou, L., Bai, F., Zhang, Y., Wang, Z., Shen, J., & Wen, K. (2025). Integration of DNA-Decorated Hapten in Emergency Immunoassays for Antibody and Small-Molecule Detection: A Review. Journal of agricultural and food chemistry, 73(2), 1038–1052.
https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c10521
指导教师：王战辉 教授
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