摘要
ELISA是最常用的快速检测技术之一，其中辣根过氧化物酶（HRP）和过氧化氢（H2O2）在整个ELISA过程中具有不可或缺的作用。然而，HRP和H2O2对高温敏感，阻碍了ELISA的更广泛利用和提高了储存运输成本。因此，基于葡萄糖氧化酶（GOx）和HRP对葡萄糖的级联催化以及金属有机框架（MOF）的一系列优点（大表面积、高稳定性、大量不饱和金属位点和易于功能化等），本文开发了一种基于级联催化的竞争性荧光ELISA（CCF-ELISA），使用玉米赤霉烯酮（ZEN）作为靶标检测玉米中的霉菌毒素。结果显示，MOF不仅对酶活性有显著保护作用，且基于MOF所构建的CCF-ELISA能够以0.54 ng/mL的IC50浓度检测ZEN，检测范围为0.19-1.51 ng/mL。当检测实际污染的玉米样品时，CCF-ELISA的检测结果与高效液相色谱串联质谱法高度一致，证明了开发的CCF-ELISA在食品安全快速检测方面的潜力。
研究内容
1.CCF-ELISA的原理
图1展示了GOx/HRP@ZIF-90@mAb复合物的合成过程。在合成过程中，Zn2+离子与配体2-ICA形成交联，促进了通过2-ICA自组装在ZIF-90孔隙中的GOx和HRP的封装。富含氨基的抗体通过席夫碱反应与2-ICA的醛基结合，从而有效地固定在ZIF-90表面。将该复合物应用于CCF-ELISA中，通过间接竞争与酶标板上的包被抗原结合，通过葡萄糖的级联催化反应产生检测信号。在葡萄糖存在的条件下，GOx催化葡萄糖氧化生成H2O2和葡萄糖酸。随后，HRP在产生的H2O2存在下氧化Amplex Red，生成试卤灵（resorufin），试卤灵在570 nm的激发下在585 nm处发出荧光。在CCF-ELISA中，产生的试卤灵的荧光强度与样品中ZEN的浓度呈负相关，从而实现ZEN的检测。
图1. 基于GOx/HRP@ZIF-90@mAbZEN复合物的CCF-ELISA检测ZEN的示意图。（A）GOx/HRP@ZIF-90@mAbZEN复合物的合成，（B）级联催化的机制，（C）CCF-ELISA的示意图。
2. GOx@ZIF-90、HRP@ZIF-90、GOx/HRP@ZIF-90和GOx/HRP@ZIF-90@mAb的表征
对合成的复合材料进行表征和分析。SEM图像显示，合成的ZIF-90显示出独特而规则的十二面体形状，单个ZIF-90颗粒的直径约为350nm（如图2A、B所示）。抗体偶联后进行Zeta电位测量，由于抗体表面存在大量羧基，导致GOx/HRP@ZIF-90@mAb的表面电位降低（图2C），证实抗体与GOx/HRP@ZIF-90成功偶联。
通过荧光共聚焦显微镜对GOx和HRP的封装进行验证。GOx和HRP分别用FITC和RhB标记，当GOx封装在ZIF-90内，在488nm激发时，颗粒在518nm处发出绿色荧光（图2D-a）。当HRP封装在ZIF-90中时，在543nm激发下，颗粒在580nm处发出红色荧光（图2D-b），表明GOx和HRP在ZIF-90中成功封装。
图2. GOx/HRP@ZIF-90（A）和GOx/HRP@ZIF-90@mAb（B）的SEM图像，它们的Zeta电位（C），以及（D）FITC-GOx/HRP@ZIF-90（a）和GOx/RhB-HRP@ZIF-90（b）的荧光共聚焦图像，明场图像（c），和合并图像（d）。
对合成的ZIF-90和GOx/HRP@ZIF-90的XRD图谱中可看出峰位置与计算机模拟ZIF-90标准图谱中的峰位置非常接近，证实了合成的ZIF-90和GOx/HRP@ZIF-90的晶体结构与预期一致（图3A）。
通过FTIR分析，C═O键在1670 cm–1处出现明显的拉伸振动，在2720 cm–1和2820 cm–1处出现特征性醛峰，进一步证明制备的ZIF-90和GOx/HRP@ZIF-90结构符合预期（图3B）。
图3.（A）根据ZIF-90（黑色）、合成的GOx/HRP@ZIF-90（红色）和合成的GOx/HRP@ZIF-90@mAb（蓝色）的CIF文件模拟的XRD图谱。（B）合成的ZIF-90（黑色）和GOx/HRP@ZIF-90（红色）的FTIR光谱。
3. 包封酶的活性和热稳定性
考虑到酶的包封率可能会影响催化效率，进而影响测定的灵敏度，在ZIF-90中加载了不同质量比的酶。如图4A所示，当GOx/HRP=1：1时荧光强度达到最高，具有最佳的级联催化活性。如图4B、C所示，将酶暴露于55°C处理，经过6小时处理，自由酶几乎失去了全部活性；相比之下，封装在ZIF-90中的酶保持了至少85%的活性，表明酶在ZIF-90中的封装可以增强其热稳定性。
图4. 通过级联催化以不同质量比的GOx与HRP生成的试卤灵的荧光（A）。热处理后酶活性测定：（B）GOx@ZIF-90（黑色）和游离GOx（红色）和（C）HRP@ZIF-90（黑色）和游离HRP（红色）。
4. 检测条件优化
为了提高灵敏度和检测能力，进行了一系列优化，包括包被抗原的稀释、与GOx/HRP@ZIF-90偶联的抗体量以及GOx/HRP@ZIF-90@mAb复合物的稀释。如图5A所示，当包被抗原从1000倍稀释到81,000倍时，抑制率增加，在81,000倍稀释时达到峰值。因此，选择了81,000倍稀释液用于后续实验。对于抗体，图5B表示当每毫克GOx/HRP@ZIF-90使用20μg抗体时，达到最高抑制率。优化了GOx/HRP@ZIF-90@mAb复合物的剂量。根据图5C，20倍稀释复合物可产生最佳抑制率。选用上述条件进行CCF-ELISA。
图5.优化CCF-ELISA的条件。（A）包被抗原稀释倍数，（B）mAb在GOx/HRP@ZIF-90上的偶联量，以及（C）GOx/HRP@ZIF-90@mAb复合物的稀释倍数。
5. CCF-ELISA的性能
在最佳反应条件下，所建立的CCF-ELISA值检测ZEN的IC50为0.54 ng/mL，LOD为0.05 ng/mL，线性范围为0.19至1.51ng/mL，并表现出良好的特异性，回收率范围为86.3~103.6%。通过对实际污染样品的检测，CCF-ELISA结果与HPLC-MS/MS结果具有高度相关性，表明我们所建立的方法具有一定应用潜力。
图6.构建的CCF-ELISA的性能。（A）对应于不同浓度ZEN的生成的试卤灵的荧光光谱，（B）构建的CCF-ELISA对ZEN的校准曲线，以及（C）CCF-ELISA的特异性评价。
原文出处
Chaochao Chen, Liang Luo, Jianzhong Shen, Zhanhui Wang, Yantong Pan. Metal–Organic Framework-Based Cascade Catalysis-Enabled Fluorescent ELISA with Higher Enzymatic Stability for Zearalenone Detection in Maize. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2024.
https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jafc.4c07146
指导教师：王战辉
