【摘要】
糖结合疫苗在保护和预防传染病方面具有重要价值。该疫苗由两种成分组成：载体蛋白和多糖抗原。目前常用的载体蛋白有破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素非毒性突变体、嗜血杆菌蛋白D和B血清群脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物。多糖抗原主要是通过从原始宿主中提取和纯化而产生的。该文综述了近五年来糖结合疫苗的研究进展，重点关注新的载体和抗原的发展。其中载体的创新发展包括外膜囊泡、糖工程蛋白、新型载体蛋白、病毒样颗粒、蛋白质纳米笼和多肽。关于偶联抗原，该文也描述了在抗菌素耐药性和常见多重耐药病原菌领域的最新进展。
【引言】
疫苗是预防和保护人们免受传染病侵害的最有效手段之一，社会发展高度依赖于新型疫苗和疫苗平台的开发。糖结合疫苗是一个重要的疫苗技术平台。糖结合疫苗由提取并纯化的多糖，单独组成或多糖与载体蛋白的共价偶联组成。仅含有纯化多糖的疫苗只能刺激B细胞产生抗体，无法产生免疫记忆反应。多糖与载体蛋白偶联可诱导长期免疫，促使免疫系统产生T细胞依赖性免疫反应。糖结合疫苗也存在因抗原竞争和载体诱导的表位抑制引起的不良影响。其中抗原竞争是指当一种蛋白质作为独立疫苗成分与另一种使用相同蛋白质作为载体结合疫苗联合使用时引起的现象。载体诱导的表位抑制则归因于先前使用载体蛋白作为单一疫苗成分以及作为偶联疫苗的载体或简单联合使用的情况。抗原竞争和载体诱导的表位抑制均会导致糖结合疫苗的免疫反应减弱。引入与免疫原同属一种物种但新颖且不同的载体有可能部分解决由抗原竞争和载体诱导的表位抑制引起的问题。载体和多糖的选择与开发为糖结合疫苗的研发带来了新的组合和创新方法。在该综述文章中，概述了新型偶联疫苗开发方面的最新研究成果。
【综述内容简介】
1.结合疫苗载体选择标准及研究进展
结合疫苗的载体选择应具备一定标准，如具备经过验证的追踪记录和安全记录、可以在GMP条件下大规模生产。结合疫苗载体蛋白还应满足一些附加标准，如免疫原性、生产的可重复性、活性氨基酸的表面暴露程度、溶解度和稳定性等。目前在疫苗中使用较广泛的传统蛋白质载体有破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197（白喉毒素非毒性突变体）、嗜血杆菌蛋白D和血清群B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物。同时重组无毒形式的铜绿假单胞菌外毒素A、来自肠外致病性大肠杆菌产生的Upec-5211和Orf3526蛋白、混杂的人类CD4+T细胞表位的细丝组成的重组蛋白、重组破伤风毒素HC片段以及合成肽也可作为疫苗的载体。
尽管传统载体蛋白和其他潜在载体（如脂质体、聚合物、无机金颗粒、树状大分子和纳米盘）在结合疫苗的开发中仍然非常适用，但该文重点介绍了外膜囊泡和膜抗原通用模块、糖基工程蛋白和外膜囊泡、蛋白质、病毒样颗粒、蛋白质纳米笼和肽六种新型且不同的载体类型（图1）。
图1 结合疫苗的新载体蛋白。（1）外膜囊泡和膜抗原通用模块；（2）2a，铜绿假单胞菌外毒素A；2b，外膜囊泡；（3）3a，化脓性链球菌溶血素O；3b，破伤风神经毒素受体结合片段HC；（4）病毒样颗粒；（5）蛋白质纳米笼；（6）肽；
1.1外膜囊泡和膜抗原通用模块
外膜囊泡（OMV)和膜抗原通用模块(GMMA)可以从众多不同的细菌中制备得到，其安全性已在多项临床研究中得到验证。由于脂寡糖和脂蛋白等病原体相关分子模式的存在，使外膜囊泡和膜抗原通用模块具有自佐剂特性，在其制备过程中减少了对外加佐剂的需求。外膜囊泡和膜抗原通用模块的尺寸较大（50-200纳米），表面积大，且具有疏水性、电荷和受体相互作用等特性，这些特性对抗原呈递细胞的摄取产生了显著的促进作用。此外，外膜囊泡和膜抗原通用模块可以利用高产量的生产平台高效地进行生产。多个研究团队提供了关于外膜囊泡和膜抗原通用模块作为载体成功应用的数据（表1）。
表1.外膜囊泡和膜抗原通用模块偶联策略
在传统糖结合疫苗中，提取或人工合成的糖通过化学方法与载体蛋白结合，而体内蛋白质糖基偶联技术则是通过在细菌内直接进行重组酶构建实现糖结合物的生成。这些糖结合物由载体蛋白和来源于细菌荚膜或O-抗原多糖的碳水化合物部分构成。蛋白质糖基偶联技术基于空肠弯曲菌的N-连接糖基化系统，可以在大肠杆菌中表达。这种大肠杆菌突变体能够在其糖基载体脂质上产生异源多糖。多糖本身具有多分散性，多糖重复单元的数量可以有很大差异，单个载体蛋白上偶联的多糖数量也会有所不同，因此产生的多糖具有多样性，不利于偶联物的结构解析。该技术也存在一些其他挑战，例如某些酰基转移酶与大多数细菌O-特异多糖不完全兼容，导致生物偶联物的异质性更高。蛋白质糖基偶联技术无需糖合成、纯化、偶联等中间步骤，具有潜在的成本效益。该技术在糖结合疫苗领域已经得到了广泛研究（表2）。
表2.糖基工程偶联策略
抗原竞争和载体诱导的表位抑制导致疫苗中抗原的利用存在问题。因此，需要引入能够改进传统载体的新型蛋白载体。结合疫苗设计的最新进展包括使用同源和异源的蛋白质作为结合抗原的载体。目前已有研究采用单价（针对单一目标抗原）或双价（结合两种目标抗原）的疫苗合成方法来针对特定病原体（表3）。
表3.基于蛋白质的偶联策略
1.4病毒样颗粒
病毒样颗粒（VLPs）属于亚单位疫苗家族的一部分。病毒样颗粒是通过病毒衣壳蛋白自组装形成的。这些颗粒模拟了原始病毒的结构，但无法复制或引发感染。与减毒活疫苗的风险相比，可能更具有安全性。除了作为疫苗成份外，病毒样颗粒也可以作为载体，通过蛋白质展示用于呈递异源蛋白抗原（表4）。
表4.病毒样颗粒
1.5
蛋白质纳米笼
纳米笼由非病毒蛋白亚基构建而成，与病毒样颗粒有相似之处，其中许多亚基可以自组装成纳米笼。它们形成对称结构，在形状和大小上与病毒样颗粒不同。纳米笼包含被B细胞受体识别的重复结构。如基于铁蛋白的纳米笼是来自幽门螺杆菌的铁蛋白模块组装成一个直径为12纳米的球形笼，由24个具有空心核心的亚基组成。已有几项研究报道了使用蛋白质载体纳米笼的疫苗靶点（表5）。
表5.蛋白质纳米笼的偶联策略
肽基疫苗是一种亚单位疫苗，主要由可合成的短序列（单一表位）组成。这类疫苗具有多重优势，如安全性良好、大规模生产简便快捷且纯度高。此外，通过设计结合多个单一表位的肽基疫苗，以及将合成的长肽制成重组重叠肽疫苗，可以拓宽其应用范围并提高有效性。在大多数情况下，为了使抗原肽可用，必须为其配备佐剂，例如通用T细胞表位PADRE，以及作为疏水增溶部分的聚亮氨酸。表6中描述了几种典型应用。
表6.肽偶联策略
2.结合疫苗抗原
耐药病原体（AMR）的风险不容忽视。ESKAPE多重耐药菌（包括粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌）已经对大环内酯类、脂肽类、氟喹诺酮类、恶唑烷酮类、β-内酰胺类、四环素类、β-内酰胺-β-内酰胺酶抑制剂复方以及糖肽类、碳青霉烯类和多黏菌素等抗生素产生了多重耐药性（表7）。欧洲抗菌素耐药性合作组织（EARC）对6种排在最前面的ESKAPE病原体各自导致的死亡人数进行了报道(图2)。世卫组织和美国疾病控制与预防中心对耐药病原体的优先级进行了分类（图3）。下文概述了每种关键多重耐药菌病原体面临的耐药性挑战，以及过去5年内针对耐药病原体的糖结合疫苗的最新应用。
表7.每种ESKAPE病原体的耐药性
图2.EARC. 2019年由ESKAPE病原体造成的死亡人数
图3.根据疾病控制与预防中心和世卫组织对ESKAPE病原体的优先级排序
2.1粪肠球菌
粪肠球菌（E. faecium）是一种革兰氏阳性共生菌，与免疫功能低下人群的严重感染相关。感染在医院环境中持续存在，导致患有其他基础疾病的患者出现医院获得性感染（如血流感染和尿路感染）。在所有与医疗相关的肠球菌感染中，高达30%对万古霉素具有耐药性，并且对其他抗生素的耐药性也在增加。疫苗开发的主要靶点包括荚膜多糖、细胞壁磷壁酸和脂磷壁酸。另一种与肽聚糖层相连且具有潜在免疫原性的多糖是肠球菌多糖抗原。已有部分针对粪肠球菌糖结合疫苗的报道（表8），例如有研究使用了一种合成的细胞壁磷壁酸作为目标抗原制备针对粪肠球菌的糖结合疫苗（图4），并证明了其能引发强烈的免疫反应和高抗体滴度。
表8.针对粪肠球菌的碳水化合物结合疫苗
图4. ESKAPE病原体和靶抗原的示例：粪大肠杆菌：细胞壁磷壁酸；金黄色葡萄球菌：三糖8型荚膜多糖；肺炎克雷伯菌：荚膜多糖K2 ；鲍曼不动杆菌：假胺酸；铜绿假单胞菌：甲基鼠李糖五糖；大肠杆菌：血清型O25B
2.2 金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌（S. aureus）是一种共生革兰氏阳性菌，与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）相关，不仅会导致患有其他基础疾病的患者在医院内感染，还会引起皮肤和软组织的获得性感染。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌会导致患者发病率、死亡率上升，住院时间延长，并增加医疗费用。万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的首选抗生素。然而，过去几十年中，临床分离株对万古霉素的中度耐药和完全耐药已有所发展。尽管万古霉素耐药的发生率仍然较低，但它已成为一个严重的公共卫生问题。
金黄色葡萄球菌的荚膜多糖有13种不同的血清型，从临床分离株中已鉴定出其中的5型和8型最为常见。广泛相关的聚-(1→6)-N-乙酰-D-葡糖胺（PNAG）胞外多糖也是疫苗开发的潜在靶点。表9展示了利用不同平台开发针对金黄色葡萄球菌的有效疫苗的研究案例（表9）。
表9.针对金黄色葡萄球菌的碳水化合物结合疫苗
2.3 肺炎克雷伯菌
肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）是一种共生革兰氏阴性菌。它与持续性尿路感染、软组织感染以及呼吸机相关性肺炎有关。此外，它还容易感染老年人和免疫功能低下患者，导致肺炎和败血症。这种感染在社区环境中也广泛存在。肺炎克雷伯菌对第三代头孢菌素和碳青霉烯类抗生素具有耐药性，这种耐药性是通过产生超广谱β-内酰胺酶（ESBL）或Amp-C β-内酰胺酶而获得的。治疗产ESBL肠杆菌科感染的措施很少，静脉注射碳青霉烯类抗生素可能是其中之一。
肺炎克雷伯菌的多糖为疫苗开发提供了多种靶点，其中由荚膜多糖衍生的K抗原（77种血清型）和由脂多糖衍生的O抗原最有前景。该领域正在研究多种策略来设计针对肺炎克雷伯菌的新型疫苗，包括传统提取的多糖、合成策略和生物缀合物。这将产生多种具有巨大潜力的疫苗候选物（表10）。
表10.针对肺炎克雷伯氏菌的碳水化合物结合疫苗
2.4 鲍曼不动杆菌
鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是一种在医院环境中极易传播的共生革兰氏阴性菌。其特别之处在于，它经常出现在医疗机构中。它是呼吸机相关性肺炎、血液感染、伤口感染和尿路感染的主要原因，同时它天生对各种抗生素具有耐药性，且容易获得新的耐药性。对于侵入性感染，尤其是碳青霉烯类耐药菌株的感染，其死亡率很高。一些鲍曼不动杆菌菌株已对所有抗生素产生了耐药性。因此，它们被列为所有抗菌药物耐药性优先级列表的首位。尽管总体上碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的比率有所下降，但其他物种之间的基因转移使它们能够产生碳青霉烯酶，这已成为一个日益严重的问题。鲍曼不动杆菌的多糖结构具有极大的多样性，已描述的有40多种不同的血清型。表11中描述了几种代表性的研究。
表11.针对鲍曼不动杆菌的碳水化合物结合疫苗
2.5 铜绿假单胞菌
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）为革兰氏阴性菌，是一种机会致病性的医院病原菌。它被列为免疫功能低下患者（包括肺病患者）肺炎最常见的病因之一。特别是囊性纤维化、HIV-1和癌症患者，往往因铜绿假单胞菌感染而并发慢性肺部感染。2%至3%的铜绿假单胞菌菌株携带碳青霉烯酶，使其对碳青霉烯类药物产生耐药性。这种耐药性尤其增大了血液感染患者的死亡率风险，且治疗选择非常有限。铜绿假单胞菌携带的O-多糖是脂多糖（LPS）的一部分，是重要的可变区和毒力因子。通过应用国际抗原分型方案，可以进一步对血清型进行表征。根据O-多糖的结构，铜绿假单胞菌可分为20个标准O血清型（O1–O20）。在烧伤伤口感染中，O5、O6和O11血清型最为常见，而在肺炎中，O6和O11血清型最为普遍。针对铜绿假单胞菌疫苗研究见表12。
表12.针对铜绿假单胞菌的碳水化合物结合疫苗
大肠杆菌（Escherichia coli）属于肠杆菌属的一部分，是一种革兰氏阴性共生菌。在大多数国家，大肠杆菌的耐药性报告日益增多，且致死率较高。通过产生超广谱β-内酰胺酶（ESBL）或Amp-C β-内酰胺酶，大肠杆菌已对第三代头孢菌素产生耐药性。大肠杆菌分布广泛，是社区获得性和医院获得性尿路感染、血液感染、呼吸机相关性肺炎感染以及腹泻疾病的主要原因。由于耐药性，其治疗选择非常有限。大肠杆菌的血清型分类基于其表面保护性的荚膜多糖。大肠杆菌具有显著的多样性，已报告有超过180种不同的O抗原和约80种K抗原。针对大肠杆菌疫苗研究见表13。
表13.针对大肠杆菌的碳水化合物结合疫苗
【总结】
该文全面而深入地概述了糖结合疫苗在载体蛋白与多糖抗原方面的最新进展，包括传统载体蛋白的应用情况、新型载体的开发进展，以及抗原的提取、化学合成和生物偶联技术等关键领域的发展现状。此外，文章还讨论了这些新型载体和抗原在糖结合疫苗中的应用前景和挑战，为未来疫苗的研发、优化和应用提供了参考。
【展望】
结合疫苗已经证明其能够通过激发针对传染病的功能性抗体来预防疾病并提供保护。新型载体的引入对于提供足够的灵活性和选择来特别针对特定疾病和AMR靶点至关重要。预计目前正在研究的新型载体将进入临床试验。未来几年内，将开发出这些载体的大规模且可靠的生产工艺。
现有多糖抗原的可用性和质量的改进将主要取决于两个平台。生物偶联和人工合成的多糖都显示出最大的潜力。生物偶联和化学合成途径各有缺点，但两个平台都消除了繁琐的多糖提取和纯化的需求。因此，将生产出更可靠且一致性的生物偶联物。此外，将出现新的大规模生产合成寡糖的途径，但需要在成本效益方面进行经济评估。目前已有基于多糖的抗原和新型载体的最新进展，能够帮助人们迅速设计出针对AMR和其他可通过疫苗预防的疾病的新型糖结合疫苗。最后，结合疫苗在抗击癌症和神经退行性疾病方面也具有巨大的发展潜力。
【原文出处】
Robert M.F. van der Put, Bernard Metz, Roland J. Pieters. Carriers and Antigens: New Developments in Glycoconjugate Vaccines[J].Vaccines, 2023, 11, 219. https://doi.org/10.3390/vaccines11020219
