摘要
HIV-1的gp120中氨基酸残基421-436(缩写为I)是相对保守的决定簇，参与宿主细胞CD4受体的结合。本研究合成了Cys-gp120（421-436）并通过血蓝蛋白(KLH)的氨基制备KLH–I。在gp120 (421–436)的N端引入破伤风类毒素T细胞表位蛋白(T)，制备了T–I。比较了两种免疫原KLH–I和T–I在两种不同类型的小鼠中的免疫原性（non-autoimmunemice，ALB/cstrain 和 Fas-defective autoimmune mice，MRL/lpr strain）。研究发现两种免疫原都能引发高滴度的抗体(Abs)，通过ELISA都能检测到固定在微孔板上的BSA-I结合。但KLH-I免疫小鼠的Abs能与全长gp120结合，而T-I免疫小鼠的Abs则不能，同时，两种抗体与gp120序列无关的蛋白质不结合。可溶性的I和T-I均不能与BSA-I竞争KLH-I制备的Abs，但是能跟T-I制备的抗体产生竞争，顺序为BSABSA-I>T-I>>I。研究结果表明载体蛋白对合成多肽I的Abs特异性有重要影响。在未免疫的MRL/lpr小鼠血清中可检测到低水平的BSA-I和gp120结合Abs。但是在KLH-I和T-I免疫后，MRL/lpr和BALB/c小鼠的Abs结合滴度和特异性相似，说明。MRL/lpr中pre-existing immunity to gp120 不会改变抗体应答的强度和特异性。
引言
感染HIV的个体中，体液免疫反应主要是针对gp120可变域（V）的抗体（Abs）。但很少有抗体与gp120的保守片段反应，包括与宿主细胞CD4受体结合的保守结合位点。合成肽gp120（421-436）即I（如图1）包含某些与CD4结合相关氨基酸残基，之前因其可作为T细胞辅助表位促进gp120的V3环抗体生成而被用于合成疫苗配方（synthetic vaccine formulations），同时它也可作为B细胞表位。短的合成肽例如I可用于制备与天然gp120中的线性决定簇反应的抗体，但短肽状态无序，与天然蛋白的三维结构中相应决定簇状态不同，所以需要研究确定合成肽产生的抗体能否识别同源蛋白。作者通研究了含I的两种免疫原所引发抗体的不同结合特异性，两种免疫原都能引发强烈的抗I反应，但只有KLH-I免疫原诱导的抗体能够结合全长gp120，并且BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠的抗体特异性和强度相似，表明MRL/lpr小鼠中预先存在的对gp120的免疫不影响对外源免疫原的反应。
图1短肽I的氨基酸序列以及各免疫原的连接方式
内容简介
1.材料与方法
一、免疫原制备
用自动化肽合成仪合成在N-末端带有T表位（来自破伤风类毒素）的
gp120（421-436）（T-I），通过反相高效液相色谱纯化至＞98%纯度，并用氨基酸分析和电喷雾电离质谱表征。
制备N-末端为Cys的I（m/z 2014），生物素化I（Bt-I，m/z 2308）。将Cys-I与KLH和BSA的氨基采用N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺分别制备KLH-I和BSA-I。
二、动物免疫
选用5 - 6周龄雌性BALB/c和MRL/lpr小鼠。用T-I或KLH-I分两次腹腔注射免疫，初次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫用不完全佐剂。制备与无关肽（表皮生长因子受体294-310残基）结合的KLH，并免疫MRL/lpr小鼠。从眼眶后丛采血制备血清用于ELISA研究。
2. 结果
一、免疫原性
图2 KLH-I (A和B组)和T-I (C和D组)在MRL/lpr和BALB/ C小鼠中的免疫原性。
二、全长gp120结合
用KLH-I免疫BALB/c和MRL/lpr小鼠产生的抗体可与全长gp120结合，但结合水平低于BSA-I抗原；而用T-I免疫产生的抗体不能与全长gp120结合。这种差异在使用全血清或纯化IgG作为抗体来源时均存在，免疫印迹结果也证实了这一差异（如图3）。未免疫的MRL/lpr小鼠的IgG在一定浓度下不与全长gp120结合，用KLH与无关肽段（EGFR残基294-310）免疫的对照小鼠的IgG不与gp120或BSA-I结合，表明抗-KLH-I抗体反应不是由于载体蛋白中的表位。电泳凝胶的免疫斑点显示通道1：gp120被合并的抗KLH-I血清染色;通道3:gp120没有被MRL/lpr小鼠(1:50稀释)的抗T-I血清染色，通道2:gp120被非免疫MRL/lpr血清染色(1:50);通道1:gp120用单克隆抗gp120抗体(8 μg/ml)染色。
图3 A组:KLH-I(第49天，第5号小鼠)或T-I(第28天，第4号小鼠)免疫后的BALB/c血清。B组:KLH-I(图1第49天，第5只小鼠)和T-I(第28天，第4只小鼠)免疫后MRL/lpr血清中纯化的IgG。C组:SDS
三、肽特异性
图4。抗体对KLH-I (A组)和T-I (B组)具有不同的肽结合特异性。
讨论
一、载体蛋白对抗体特异性的影响
本研究中，位于T-I的N末端的15个残基T表位，能使小鼠产生与KLH-I免疫小鼠相当的抗-I抗体。但两种免疫原诱导的抗体特异性存在明显差异，抗-T-I抗体不能结合全长gp120，而抗-KLH-I抗体可以。并且可溶性T-I和I仅被抗-T-I抗体识别，而BSA-I可被抗-KLH-I和抗-T-I抗体等效识别。这种抗体特异性在正常BALB/c小鼠和自身免疫MRL/lpr小鼠中相似。MRL/lpr小鼠自发产生低水平能结合BSA - I和gp120的抗体，用KLH-I和T-I免疫后，其BSA-I结合反应强烈，但并不比同等免疫的BALB/c小鼠更强，说明MRL/lpr小鼠预先存在的对I和gp120的免疫不会放大对免疫原的抗体反应，也不会使抗-T-I抗体反应偏向识别全长gp120。
载体蛋白影响合成肽的抗体反应幅度已有研究，但本研究首次明确表明载体蛋白会影响合成肽抗体的特异性。从理论上讲，抗-T-I和抗-KLH-I抗体的特异性可能是由于KLH偶联的I与N末端带有T表位的I所采用的构象不同导致的（如图6）。短肽通常处于无序状态，与溶剂或其他多肽相互作用可形成更有序结构。I与KLH的共价结合可使肽靠近KLH的各种残基，通过非共价相互作用影响I的构象，多个I分子与单个KLH分子偶联，这也可能是I三维结构形成的潜在机制。
总之，KLH-I结合物中的一个或多个I分子必须充分模拟全长gp120中I的结构，才能产生抗-gp120的抗体。抗体活性位点在结合抗原过程中具有构象灵活性，这可能影响抗-I抗体结合全长gp120的程度。
图5Ab抗体特异性依赖载体的假设模型。
二、免疫原诱导抗体与HIV-1感染的关系
用全长gp120免疫主要诱导针对V3环的抗体生成。gp120的421-436残基区域是CD4结合位点的组成部分，针对该区域的免疫反应可能对HIV-1感染有保护作用。虽然抗-KLH-I抗体能结合全长gp120，但不能确保其能识别HIV表面的三聚体gp120，因为单体gp120中的I结构与病毒表面蛋白中的结构可能不同。有研究表明，针对I的单克隆抗体能识别HIV中和表位，但多克隆抗体虽能结合全长单体gp120且抑制单体gp120与可溶性CD4的结合，但缺乏HIV中和活性，还需要更多研究来明确是否与对天然三聚体gp120的抗体反应性差有关。此外，含I免疫原诱导的抗体与鼠和人狼疮中天然存在的抗-I抗体在特异性上可能存在差异，目前还无法推断狼疮抗-I抗体的精细特异性和HIV识别特征，因为狼疮抗-I抗体形成的免疫刺激因素尚不清楚。
原文出处
Karle, S., Nishiyama, Y., Taguchi, H., Zhou, Y-X., & Luo, J.. (2003). Carrier-dependent specificity of antibodies to a conserved peptide determinant of gp120. Vaccine, 21(11-12), 1213-8.
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X02005042
DOI:10.1016/s0264-410x(02)00504-2.
指导教师：王战辉
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