摘要：金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）是一种通过交联主要组织相容性复合物II（MHC II）与T细胞受体（TCR）形成三元复合物，发挥超抗原作用的强毒素。本研究发现两株SEB特异性单抗（mAb）联用可显著增强中和效力而其单独使用时无明显效果。通过X线衍射和核磁共振（NMR）技术确定了SEB抗体的结合表位并揭示了抗体联用的解毒机制——通过Fc受体（FcR）介导的毒素清除，以及诱导SEB变构进而干扰三元复合物的形成。最后使用结构信息准确预测了这些抗体对其他结构相似超抗原的交叉结合能力。
【引言】
SEB曾被美国列为生物战剂，原因在于其毒性强烈，可交联MHC II与TCR形成三聚体进而广泛激活T细胞导致中毒性休克综合征。基于mAbs 的解毒疗法被认为是SEB中毒后唯一的治疗选择。尽管目前已有多株SEB中和mAb被报道，但由于缺乏精确的表位映射，这些抗体的解毒机制尚不明确。为优化SEB解毒疗法，应对这些抗体的识别表位进行解析。
本研究通过X线衍射、NMR和生物膜干涉（BLI）等实验解析了三株SEB抗体：mAb 20B1、6D3和14G8的精确识别位点及其联用时的解毒机制。结果表明：20B1与14G8组合的解毒机制为增强FcR介导的清除机制，而14G8与6D3组合的解毒机制为二者同时结合SEB后引起其构象变化，抑制SEB-MHC II-TCR三元复合物形成。此外，本研究还表明构象表位的精细映射可用于识别非同源蛋白中的共享表位，并成功预测了抗体的交叉反应性。本研究为优化SEB中毒的抗体组合疗法提供了结构与机制见解。
【内容简介】
SEB中和实验
通过T细胞增殖抑制实验与小鼠致死性休克（SEBILS）保护试验验证了14G8、20B1和6D3三株mAbs的SEB中和效力。结果表明mAb 14G8与6D3或20B1联用在相同浓度下比单独使用任一抗体能更有效地抑制T细胞增殖（图1 A）；单独使用14G8无SEBILS保护效果，而14G8与6D3联用能显著降低SEBILS的发生率，20B1与14G8联用在低剂量下也能降低SEBILS发生率（图1 B）。因此认为特定mAbs的组合使用能提高对SEB的中和效果。
图1：mAbs的SEB中和实验
亲和力测定
用BLI测定了mAb 20B1、14G8和6D3的SEB结合亲和力。结果表明，这些mAbs与SEB的解离常数（Kd）均在nM级别（图2 A），此外任意两株mAbs都可同时与SEB结合，产生显著高于单一mAb的响应信号（图2B）。因此认为这些mAbs对SEB具有高亲和力且可能识别SEB的不同表位。
图2：mAbs对SEB的亲和力
抗体联用增强SEB的清除作用
通过小鼠血清ELISA实验验证抗体联用的SEB中和机制。结果表明注射SEB并用14G8和20B1的组合治疗的小鼠SEB的清除率显著提高，而14G8和6D3联用则无效（图3 A&B）；进一步比较了FcR缺陷型小鼠（FcR−/−RIIB−/−）的初级腹腔巨噬细胞与相应野生型（WT）小鼠在一种或多种SEB特异性mAb存在下对SEB的摄取能力，结果与ELISA一致（图3 C-F）。因此认为通过FcR介导的摄取和清除是14G8与20B1联用增强SEB中和效力的机制之一，然而无法解释14G8与6D3联用的增强机制。
图3：mAbs增强了SEB的清除率
20B1，14G8和6D3识别位点分析
分别制备SEB-20B1Fab（图4 A）、SEB-14G8Fab二元复合物和SEB-14G8Fab-6D3Fab（图4 B）三元复合物的晶体，用X线衍射解析其结构，分析mAbs的SEB结合点。结果表明，每个Fab片段都结合到SEB表面的一个独特构象表位上且结合表位的关键残基彼此没有重叠（图4 C&D），一株mAb结合SEB后不会阻碍其他mAbs的结合，与前述的BLI结果一致。
图4：SEB与mAbs复合物的晶体结构
具体而言，在SEB-20B1Fab复合物中：SEB与抗体结合后主链原子RMSD（均方根偏差）=0.53 Å，未发生显著的构象变化（图5 A），但观察到一些侧链的重排（图5B）；复合物中SEB和20B1Fab分别埋藏的溶剂可及表面积为932 Ų和929 Ų，其中轻链和重链分别贡献18%和82%；SEB与mAb 20B1的相互作用主要来自分子间的氢键网络和多种疏水-疏水相互作用。在SEB-14G8Fab复合物中：SEB主链原子RMSD=0.62 Å，未发生显著构象变化（图5 C&D）；复合物中SEB和14G8Fab分别埋藏的溶剂可及表面积为941 Ų和928 Ų，轻链和重链分别贡献36%和64%；SEB-14G8Fab的相互作用可归因于广泛的分子间氢键网络和盐桥。在SEB-14G8Fab-6D3Fab三元复合物中：SEB-14G8Fab二元复合物与SEB-14G8Fab-6D3Fab三元复合物中SEB与14G8Fab共同主链原子的RMSD=0.99 Å。apo（无配体） SEB与三元复合物中SEB分子的主链RMSD为0.67 Å（图5E），三元复合物中SEB未发生显著的构象变化（图5 E&F）；SEB与6D3的总溶剂可及面积埋藏为835 Ų，其中轻链和重链分别贡献43%和57%；SEB与6D3的主要相互作用为氢键与盐桥（上述相互作用详见图6 &表1）。
图5: apo-SEB与SEB与Fabs复合物的晶体结构的比较
图6:SEB-mAbs的结合界面
表1:SEB-mAbs的相互作用残基
与SEB-受体复合物结构的比较
将SEB-Fab复合物的结构与SEB-TCR和SEB-MHC的结构进行了比较。发现20B1与TCR在SEB上的结合位点高度重叠（11 AAs相同）；20B1与MHC II的SEB结合位点无重叠，但20B1的SEB结合位点有两个残基与MHC结合位点较近，可能会影响SEB与MHC的结合（图7 A）。14G8和6D3的结合位点与TCR和MHC的结合位点较远（35 Å左右），所以即使这两株抗体亲和力较高，单独使用时SEB中和效果较弱（图7 B&C）。
图7: SEB与受体、mAbs的复合物结构比较
受体结合抑制实验
用BLI测定了三株mAbs对SEB与TCR、MHC II结合的抑制作用，结果表明：20B1单独存在可显著降低TCR与SEB的结合响应信号，说明结合水平降低，符合结构解析结果，而14G8或6D3单独存在TCR结合减少了34%，与基于结构的预期不符（图8 B&D）；20B1、14G8和6D3单独存在时分别使MHC与SEB结合降低37%、41%和48%，此外14G8和6D3同时结合SEB时其与MHC的结合降低66%（图8 C&E）。上述结果表明，与mAbs结合可能导致SEB的微小构象变化，进而影响TCR和MHC的结合。
图8: mAbs对SEB与MHC、TCR结合的影响
NMR分析
通过1H-15N HSQC和CRINEPT NMR技术探究了 SEB与mAbs 20B1、14G8 和 6D3的结合对TCR和MHC结合位点的影响。（HSQC 用于记录 SEB 游离态的主链化学环境信息，CRINEPT 用于记录 SEB-mAbs 复合物的主链化学环境信息，通过比较两者差异，找到因mAbs 结合而导致化学环境发生变化的SEB残基。）结果表明 20B1、14G8 和 6D3的结合分别导致 SEB 关键残基化学环境的改变，尤其是20B1和 TCR 共享 SEB 的相同结合表位（图9 A-C）。此外，与 MHC 结合相关的残基也受到了三种mAbs 结合的影响（图9 D&E）。说明mAbs不仅可以通过直接阻断关键表位和引发构象变化改变 SEB 的功能，与结合抑制实验结果一致。
图9:mAb与SEB结合时的NMR化学位移扰动
交叉保护实验
为验证 mAb 20B1同源超抗原SEC-1 （与SEB 共享20B1 结合位点中的14个AAs，66%同源，图10 A）的中和效力，进行了ELISA 实验和小鼠致死性中毒保护实验。结果表明20B1 对SEC-1 的亲和力较高，而不结合SEC-2、SEC-3 和 SSA（同源残基分别为 11 和 10 个）（图10 B）；动物实验表明，20B1 能有效保护 BALB/c 小鼠免于SEC-1中毒（图10 C）。综上所述，20B1对 SEC-1 具有交叉保护作用，有作为广谱超抗原中和抗体的潜力。
图10:20B1对SEC1的交叉保护
【小结】
本研究探讨了mAbs对SEB的中和机制，发现单一抗体的保护效力有限，而抗体联用能显著提高中和效果。20B1能够通过竞争性阻断SEB与TCR的结合，表现出极强的中和能力；相比之下，14G8和6D3单独使用时效果较弱，但在联合应用时通过诱导构象变化以及促进Fc受体介导的毒素清除，增强了整体保护效力。结构分析表明，抗体间的相互作用不仅依赖于特定表位，还通过引起SEB变构间接降低了其毒性。此外，研究进一步提供了mAbs在SEB及其相关毒素（如SEC和SSA）中的交叉反应性依据，突出显示了抗体鸡尾酒疗法在超级抗原毒性干预中的重要意义。这一发现为未来的治疗策略开发提供了重要参考。
【原文出处】
Dutta, K. et al. Mechanisms Mediating Enhanced Neutralization Efficacy of Staphylococcal Enterotoxin B by Combinations of Monoclonal Antibodies. Journal of Biological Chemistry 290, 6715–6730 (2015).
DOI:10.1074/jbc.M114.630715
指导教师：王战辉
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