摘要
1.介绍
单克隆抗体(mAb)是一种高度特异性结合蛋白，是对抗疾病的“灵丹妙药”，也是诊断和研究的重要工具。这些应用只有在单克隆抗体的制备技术出现后才有可能。杂交瘤技术彻底改变了抗体在治疗和研究领域的应用，因此获得了1984年诺贝尔生理学或医学奖。这篇综述探讨了杂交瘤技术的演变过程，以及与此后出现的其他方法相比的优势和局限性。
2.杂交瘤技术
杂交瘤技术由Georges Köhler和Cesar Milstein于1975年成功开发(图1)。其基本路线主要包括：抗原免疫动物，特异性B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。产生的杂交细胞，称为杂交瘤，然后通过克隆获得稳定的单克隆细胞系。B淋巴细胞-骨髓瘤细胞通常通过聚乙二醇(PEG)进行细胞融合，可能具有一定的细胞毒性，并可能发生非预期的融合。同样可以使用一些病毒替代PEG进行融合，如仙台病毒和水泡性口炎病毒，但现在已很少使用。另一种是电融合法，这种方法在电场和激光辐射的帮助下进行融合。用脉冲激光束照射接触细胞表面，在细胞膜上形成一个小穿孔，增加了促进细胞融合的机会。尽管此方法比PEG介导的方法更有优势，但仍无法选择性地控制特定细胞融合。
杂交瘤技术该技术的优点是可以获得高重复性的单抗，可保存抗体可变区和恒定区基因组合的天然配对以及体内抗体亲和成熟(表1)。随着临床需求的提高和技术进步，单克隆抗体的开发经历了不同的形式。
图1 单克隆抗体产生过程中重要事件的时间轴。(A)与杂交瘤技术相关的里程碑(绿色框)和获得与人类产生的单克隆抗体相似的单克隆抗体(灰色框)。(B)与杂交瘤技术替代相关的里程碑：展示库技术(橙色框)和单B细胞技术(紫色框)。
（1）小鼠单克隆抗体。Muromonab-CD3是美国食品和药物管理局（FDA）于1986年批准的首个用于人类治疗的mAb。这是一种从小鼠杂交瘤细胞产生的抗体，靶向成熟外周T细胞上的CD3，以避免器官移植排斥反应。然而，人抗鼠免疫反应限制了小鼠mAb在人类中的临床应用。最合适的获得治疗性mAb的策略可能是使用人类杂交瘤细胞，但由于其遗传不稳定性无法获得这些杂交细胞。另一方面，随着技术进步，可以对抗体分子进行结构修饰。
（2）嵌合mAb。早期的方法是去除抗体中的小鼠特征序列，产生嵌合mAb。这些嵌合mAb包含小鼠抗体轻链和重链的可变区片段，连接到人类抗体恒定区。嵌合mAb由转染嵌合基因的小鼠骨髓瘤细胞产生，具有人类特征，同时保持与原小鼠抗体相同的抗原特异性。Abciximab（c7E3 Fab）是FDA于1994年批准的首个嵌合抗体，用于抑制高危血管成形术中的血小板聚集。
（3）人源化mAb。将非人源抗体的互补决定区（CDR）移植到人类抗体框架中。1997年，FDA批准了第一种人源化抗体Daclizumab，用于预防接受肾移植患者的急性器官排斥反应，随后也被批准用于治疗成人复发性多发性硬化症。
（4）全人源mAb。利用转基因动物生成全人源mAb，将人类免疫球蛋白基因位点稳定地整合到小鼠基因组中，同时使内源性小鼠免疫球蛋白基因失活。其他转基因动物，如牛、兔子和大鼠，也可以用于生物生产人类抗体。基因工程操作使得用目的抗原进行转基因动物免疫，产生分泌人类mAb的小鼠杂交瘤成为可能。第一个从转基因动物中分离出的杂交瘤来源的人类mAb——Panitumumab，于2006年获得批准用于治疗。
杂交瘤技术一直是mAb制备的主要方法，超90%的治疗性抗体基于此产生，多为嵌合或人源化抗体。但该方法效率不高，存在筛选周期长、难以优选特异性单克隆抗体分泌细胞、早期验证不足等问题。为提高效率，已开发出B细胞靶向和立体特异性靶向等技术变体。
2.1B细胞靶向（BCT）
B细胞靶向(BCT)方法，也称为脉冲电场(PEF)，由Lo等人于1984年首次提出(图1)。该技术基于两个步骤：首先，预选抗原特异性的B淋巴细胞，随后通过直流电脉冲使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。其主要流程是：
（1）首先B细胞与生物素标记的抗原结合形成复合物；
（2）其次，将这些B淋巴细胞与生物素标记的骨髓瘤细胞共培养，特异性的生物素标记抗原结合到相应的B淋巴细胞上，然后通过链霉亲和素回收，形成B淋巴细胞-抗原-生物素-链霉亲和素复合物；
（3）接着，这些B淋巴细胞复合物与生物素标记的骨髓瘤细胞共培养，并通过直流电脉冲（PEF）促进两者融合，通过在平行电极间形成强电场，引导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞沿电场排列，便于膜融合。电场介导的细胞融合比PEG更有效，提高了融合细胞数量和杂交瘤生长速度，效率是PEG的5到10倍。但融合效率通常不超过20%，且BCT技术比传统方法复杂。
BCT方法还可在同一只小鼠上同时产生针对多个抗原的单克隆抗体，减少工作量和所需动物数量。通过小鼠免疫多种抗原，然后选择特定抗原特异性的B淋巴细胞。缺点是多种抗原免疫可能导致免疫抑制(表1)。
表1 单克隆抗体制备技术的优缺点
2.2立体特异性靶向（SST）
20世纪60年代的研究中首次发表了构象特异性单克隆抗体，它们能特异性识别特定化合物的立体异构体。这类抗体在诊断和治疗中有很高的应用价值，但难以制备，尤其是针对结构复杂的靶标，如多跨膜蛋白的胞外环或膜结合受体。因此提出了立体特异性靶向(SST)方法(图1)，该方法包括四个阶段。
（1）第一步是在动物免疫阶段进行改进。①将免疫原以DNA形式进行肌内注射，使抗原在宿主体内自然表达，增加了功能性单克隆抗体的产生机率。其优势在于，与蛋白质接种相比，基因免疫可以测试多种免疫原，无需纯化蛋白质，还可通过编码不同蛋白质或同一蛋白质的不同亚基的多种核酸序列进行免疫，获得针对多种蛋白质的抗体。DNA免疫虽然免疫原性有限，但可使用免疫增强剂增强免疫反应。②此外，脾内注射DNA可能更有效，并减少免疫周期和成本。不过，异源抗原的糖基化差异、免疫耐受和抗DNA抗体产生是潜在的问题。③腹腔注射表达靶抗原的细胞，可以增强体液反应和B细胞成熟，提高血清抗体滴度(表1)。
（2）对识别构象表位的B细胞进行预选。将分离的脾脏细胞与转导了抗原基因载体的骨髓瘤细胞培养，形成B细胞-骨髓瘤细胞复合物。
（3）细胞融合用电脉冲促进细胞融合。
（4）使用细胞表面的抗原靶标筛选分泌所需mAb的杂交瘤。可选步骤是利用部分变性的重组蛋白筛选掉不需要的克隆。SST方法提供了超过50%的B细胞-骨髓细胞融合率，并且超过24%的生成的克隆可以分泌所需的mAb。
3.噬菌体展示技术
1990年首次报道的抗体噬菌体展示技术，是生成mAb的强有力工具之一(图1)。该方法基于George Smith在1985年提出的噬菌体展示概念，包括开发组合抗体噬菌体文库即大量展示抗体片段的噬菌体，以及随后筛选抗原特异性的抗体。
构建抗体噬菌体文库时，抗体基因被克隆到载体中。M13丝状噬菌体和噬菌粒结合了质粒和噬菌体的特点，可以被用作载体，载体通过电穿孔转化大肠杆菌。获得文库后，通过生物筛选展示抗体的载体。抗体通常以单链可变片段(scFv)或抗原结合片段(Fab)形式展示。
抗体展示库分为免疫、天然、半合成和合成四种类型。免疫文库源自免疫动物或人，主要用于发现癌症抗原靶标或针对感染性病原体的抗体。天然文库源自未经免疫的供体的B细胞，合成文库则完全基于计算机设计。半合成库是使用自然和合成（计算机模拟）随机CDR创建的，在这种文库类型中，可以重新设计天然CDR以提高找到具有高特异性和亲和力的抗体的机会。
噬菌体展示库的构建至关重要，库的大小与找到特定抗体的概率成正比关系。新一代测序（NGS）有助于分析文库的变异性、序列组成和大小。尽管构建噬菌体展示文库成本高于杂交瘤技术，但筛选步骤更快捷、经济。通过噬菌体展示发现的第一个抗体以及批准用于治疗的第一个人抗体是阿达木单抗(Humira®)(图1)。它是一种IgG1单抗，能结合肿瘤坏死因子-α (TNF-α)并阻止其与受体的相互作用。用于治疗包括中度至重度类风湿关节炎在内的多种自身免疫性疾病。
噬菌体展示文库虽然具有潜力，但也存在一些局限性。噬菌体文库的多样性受限于细菌的转化效率，通常只能达到1010-1011个变体抗体的库容量。可以通过mRNA和核糖体展示策略来克服这一限制，这些无细胞方法能实现更大的文库大小和更高的抗体展示多样性(1014的库容)。噬菌体展示技术是在大肠杆菌中产生的单抗，因此不具有糖基化，而使用酵母和哺乳动物表达系统等真核生物展示平台可以解决这一问题。噬菌体展示方法的其他缺点是容易产生有偏差的库和丢失抗体的天然配对(表1)。
当前已经提出了多种从杂交瘤中产生单克隆抗体的技术平台，这些方法通常需要将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。技术的进步允许从原代细胞群中检测和分离单一功能的B淋巴细胞，并扩增和克隆抗体基因，而无需永生化抗体分泌细胞(ASC)。这些单B细胞方法显示出在多种应用中快速产生中和单克隆抗体的潜力。例如，利用这种技术已成功获得针对病毒(如HIV、登革热、MERS-CoV和SARS-Cov-2)引起的感染的mAb。下文简要介绍了单B细胞抗体技术的基本概念和优点(图1)。
筛选ASC可分为随机选择或抗原特异性选择两种形式。随机筛选时，B细胞可通过流式细胞术或显微操作提取。特异性选择则常用多参数流式细胞术或液体方法。由于抗原特异性IgG+B细胞在循环细胞中比例低，需要用表面标记物抗体来鉴定、分离。利用多种抗体检测不同发育阶段的人类B细胞，是单B细胞技术相较于杂交瘤技术的优势，但用于非人类抗体的分离时则有所不同。针对小鼠B淋巴细胞，有特定的抗体标志物，如CD45R和CD19。但对于大多数其他物种，由于缺少相应的标志物抗体和B细胞抗体库，难以从这些物种中筛选B细胞。需要指出的是分选设备大多较为昂贵，需要考虑此方法的成本问题。除了流式细胞术，还可以使用其他策略，如抗原包被磁珠、基于细胞的微阵列和用于微雕刻的软光刻方法，不过这些技术同样昂贵或需要专业的技术。
4.2单细胞免疫球蛋白基因扩增、克隆和表达
分离出单个B细胞后，需要扩增免疫球蛋白基因。首先裂解单个B细胞，通过总mRNA逆转录合成cDNA，利用PCR扩增抗体轻链和重链可变区和恒定区基因。获得的片段被克隆到线性表达载体中，进行真核或原核表达。抗体通常以Fab形式表达，也可以全长IgG和单链可变片段(scFv)形式表达。
总之，单B细胞抗体技术相较于杂交瘤技术有更多显著优点（表1）。单B细胞技术能从免疫个体和自身免疫病患者中提取中和单克隆抗体，通过高通量筛选ASC库来分析，加快寻找治疗性中和抗体，并指导疫苗设计。
获得抗体的方法是需求导向的。虽然杂交瘤技术首次证明了单克隆抗体的分离，但将其转化为适用于治疗的人单克隆抗体仍面临挑战，需要通过嵌合抗体、人源化或转基因动物等策略。这些过程成本高、耗时长且技术难度大。此外，杂交瘤技术还面临融合效率低、细胞分离困难、培养污染风险以及细胞系遗传不稳定性等问题。
自20世纪80年代中期以来，为克服这些局限性，开发了BCT和SST等方法提高融合效率，但技术更复杂。噬菌体展示技术作为替代方案，能分离出针对有毒和非免疫原性抗原的单克隆抗体，且无需使用实验动物，但需要已知的目标抗原。
杂交瘤技术不断改进，抗体展示、嵌合和人源化策略也有所发展，单B细胞抗体技术也取得了重大进展。它不依赖B细胞培养和实验动物，能快速产生具有治疗潜力的单克隆抗体，无需事先获得靶标。这种技术有望分离出针对难以模拟的构象决定的功能性单克隆抗体，但目前与杂交瘤技术相比，仍处于起步阶段。
杂交瘤技术至今仍然是一种重要的单克隆抗体制备方法。尽管新技术不断涌现，杂交瘤技术依然流行。例如，一些FDA批准的最成功的抗体，包括免疫检查点抑制剂nivolumab(抗程序性细胞死亡蛋白1，PD-1)和atezolizumab(抗程序性细胞死亡蛋白配体1；PD-L1)，就是通过小鼠杂交瘤技术发现的，可以被用于治疗非小细胞肺癌、头颈癌、黑色素瘤、肾细胞癌等多种肿瘤疾病。尽管出现了制备单克隆抗体的有前景的新技术，但到目前为止，它们似乎都无法引发技术转变，基于杂交瘤的策略仍然处于领先地位。
Moraes JZ, Hamaguchi B, Braggion C, Speciale ER, Cesar FBV, Soares GFDS, Osaki JH, Pereira TM, Aguiar RB. Hybridoma technology: is it still useful? Curr Res Immunol. 2021 Mar 22;2:32-40. doi: 10.1016/j.crimmu.2021.03.002. PMID: 35492397; PMCID: PMC9040095.
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2590255521000056
指导教师：王战辉
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