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摘要：人源单克隆抗体具有免疫原性低、半衰期长等优势，成为了体内应用中不可或缺的生物制剂。人类抗体库为人源单克隆抗体的制备提供了丰富的来源，人B细胞永生化是获得人类抗体库的潜在有效方法，可应用于人源单克隆抗体的制备。由于各平台均有亟待解决的问题，基于人B细胞永生化的抗体制备尚局限在实验室研究阶段，且目前尚缺乏一篇系统综述以明确现有的人B细胞永生化抗体制备平台的优劣及其可行性分析。因此文中就基于人B细胞永生化方法制备人源单克隆抗体的研究展开综述，以期为人源单克隆抗体制备技术的进一步发展提供参考。
关键词：B细胞永生化，人源单克隆抗体，体外诱导培养，囊泡
【引言】
人源单克隆抗体(HuMAb)是指完全由人类基因编码表达的单克隆抗体，已经成为未来抗体发展的主要方向。HuMAb具有更丰富的表位、更低的免疫原性、更长的半衰期、更佳的生物活性，在体内应用中表现良好，如体内诊断、传染病预防、抗体疗法和疾病预后判断等。自SARS-CoV-2引起的新冠肺炎(COVID-19)疫情爆发以来，全球面临着巨大的公共卫生安全威胁，诊断试剂、抗病毒药物和疫苗的研发迫在眉睫，HuMAb制备技术可以为高效建立新型病毒疫情快速响应平台提供有力的支持。【HuMAb制备技术】
目前，HuMAb的制备主要基于4种技术，分别是转基因动物、抗体库展示、单细胞克隆和B细胞永生化(表1)，各技术可独立进行或者联合使用。![]()
通过转基因动物和抗体库展示技术制备HuMAb已有诸多临床转化的成功实例，但这类抗体不能称之为真正的全人源抗体。直接从人B细胞中获得目的抗体是一种高效快捷的方法，因为前期无需抗原制备和免疫过程，且天然的抗体库比随机配对的抗体文库具有更高的敏感性和特异性，从受感染者中制备的HuMAb可以提供有关人抗体表位的信息，这些表位对于疫苗的开发以及潜在的治疗应用至关重要。虽然抗体库展示、单细胞克隆和B细胞永生化技术均可利用人B细胞获得HuMAb，但三者差异明显。抗体库展示技术的主要局限如前所述，单B细胞克隆需要先进行繁琐的抗体异源重组表达后才可进行鉴定筛选，B细胞永生化可先进行功能鉴定，直接对抗原特异性阳性的细胞池进行克隆化，与前者相比目的性更强、工作量小、筛选周期更短。综上，与传统方式相比，人B细胞产生的天然抗体经过人类免疫系统选择，是HuMAb的最佳来源，而B细胞永生化则是获得HuMAb的潜在有效方法。通过B细胞永生化技术获得的单克隆抗体在生产制备和应用方面具有以下优势：1) 筛选周期短，可实现抗体的快速筛选；2) 具有更低的免疫原性，体内应用良好；3) 可以获得更多高亲和力抗体；4) 可以从受感染者中获得针对未知抗原的抗体，应对突发疫情。【人B细胞永生化方法】
使离体培养B细胞有效增殖和活化是获得天然人源抗体最直接的方式，然而由于B细胞的数量少、分泌抗体量不足以及体外培养存活时间短、仅能进行有限增殖等问题，限制了下游鉴定和分离操作的进行。目前，B细胞永生化方法主要有人类B细胞杂交瘤技术、EBV转化、慢病毒介导的遗传修饰以及CD40L联合多种细胞因子的体外诱导培养等(图1)，各方法可单独或并行使用。![]()
图1 人B细胞永生化制备人源抗体的方法示意图
1、制备人-鼠/人-人杂交瘤细胞
将B细胞与骨髓瘤细胞融合是获得分泌抗体的永生化B细胞最常用的方法。目前人类杂交瘤技术的相关方法存在着融合效率低、亚克隆易丢失、工作量大、抗体产量低等缺陷，应用于人类抗体的产生极为困难，无法成为挖掘人类抗体库的首选方法。2、病毒感染维持增殖细胞中端粒稳态
端粒是保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期的重要结构，端粒维持机制可以抵消DNA复制过程中端粒缩短以及由此引发的DNA损伤反应、细胞周期停滞和凋亡，EBV基于端粒维持机制的激活而使宿主细胞永生化。利用EBV转化的方法，研究者已成功获得了鉴定识别HIV、H1N1流感病毒等的人类中和单抗。此外，有研究报道SV40、HBV感染也可能成为转化B细胞永生化的潜在方法。病毒一般仅感染特定的宿主细胞，使用EBV介导的B细胞永生化效率低，需要筛选大量的B细胞以获得具有所需特异性的非常罕见的B细胞克隆，且B细胞的长期生长和永生化可能与染色体畸变有关，细胞在基因突变过程中往往伴随细胞表型的改变，或是传代过程中表现出染色体的不稳定性，这均导致难以进行B细胞单克隆化筛选。不仅如此，用于生成体内应用抗体的细胞不能含EBV和其他人类病毒，基于病毒转化的人类抗体的分离纯化难度更高。3、遗传修饰以促进抗凋亡因子表达
原癌基因BCL-6属于抗细胞凋亡家族，具有转录抑制功能，可促进B细胞增殖，同时抑制B细胞向浆细胞分化，BCL-xL作为BCL-2家族成员蛋白，通过与促凋亡蛋白的拮抗作用从而抑制细胞凋亡。Kwakkenbos等利用逆转录病毒转导系统将BCL-6和BCL-xL基因导入从人外周血单个核细胞(PBMC)分选的CD27+记忆B细胞中，创建了B细胞永生化平台——AIMSelect，并成功进行了多个物种B细胞永生化。miRNAs介导的细胞转化也可能实现B细胞永生化，某些宿主和病毒编码的人类miRNA直系同源基因控制着B细胞的细胞生长和存活，或可在不久的将来作为永生的手段进行尝试。通过遗传修饰的方式可促进某些抗凋亡因子的表达从而获得永生化B细胞，但是这种方法制备抗体的效率低，主要是因为B细胞是一种难转导的原代细胞，在为数不多的永生化B细胞中，最终获得阳性克隆的数量极少。4、体外诱导B细胞自发永生化转化
CD40-CD40L是特异性免疫反应中重要的共刺激分子，其在调节初级和/或次级体液免疫反应后的B淋巴细胞活化中起作用。通过向生长培养基中添加CD40L和细胞因子，可以促进B细胞存活和增殖，延长体外培养的时间。随着B细胞离体培养技术研究的不断深入，不依赖病毒感染和遗传修饰的体外培养诱导B细胞永生化已成为可能。Wiesner等在环孢素A和IL-4的存在下，将PBMC与过表达人CD40L的饲养细胞共同培养，获得永生化的B细胞，成功观察了1650d，且B细胞具有恒定的表型，随着时间的推移稳定或增加了其端粒长度。Neron等也基于CD40-CD40L相互作用模型，外源添加多种细胞因子，在大约50d内，从PBMC中分选的IgG+和IgA+记忆B细胞发生了1×106倍扩增，并可用于人多克隆IgG生产。不依赖病毒感染或者遗传修饰的B细胞体外诱导培养操作也可以使B细胞永生化或者近永生化，具有制备HuMAb的应用潜力。但是通过体外刺激培养诱导B细胞自发进行永生化转化，涉及到CD40L和多种细胞因子的协调作用，而相关作用机制尚不明朗，在初始B细胞种类的选择和培养条件中各组分的形式(可溶性、膜结合型等)、添加量、添加时机等方面还需要进行更深度的探索。传统的B细胞体外培养条件中，经X射线辐照饲养细胞层后饲养细胞的状态存在不稳定性，对B细胞的离体培养造成明显影响。已有研究利用细胞膜囊泡展示功能性蛋白，构建人CD40L囊泡，通过外源添加的方式取代饲养细胞支持B细胞体外培养，解决了之前存在的培养条件不稳定的问题。【总结与展望】
直接从分泌天然抗体的人B细胞中获得HuMAb，是理论上简单有效但技术上存在困难的方法，因为B细胞在体外培养的寿命有限，且无法无限增殖，在细胞数量和抗体分泌量极少的情况下，难以检测和分离获得抗原特异性B细胞，而B细胞永生化则从根本上解决了细胞丰度低的问题，为后续鉴定和分离操作提供了有利条件。基于B细胞永生化技术的抗体研发平台可以在难以获得免疫原和未获得抗体时进行功能性鉴定和筛选，目的明确、工作量更小、筛选周期短，其在疾病的治疗、预防及体内诊断方面具有良好的应用潜力，特别是肿瘤、慢性病和未知传染性疾病。基于B细胞永生化技术制备HuMAb虽有若干种方法，但仍停留在实验室研究阶段(表2)。![]()
综上所述，理想的B细胞永生化技术应该具备高永生化效率和高筛选效率两个重要特征。已经有研究表明，人B细胞可以仅通过外部刺激的方式自发进行永生转化，这种方式不依赖癌病毒感染和基因操纵，在操作简便性和安全性方面都更具优势。而微流控平台、单细胞分析、荧光光谱法、细胞表面荧光免疫吸附测定等先进技术的涌入、发展和联合为分离抗原特异性B细胞提供了更高效的方法。随着B细胞永生化研究的不断深入和技术的不断成熟，分泌天然人抗的永生化B细胞将进一步为制备HuMAb奠定基础，使其在生物医药研究和临床应用中发挥更广泛的作用。【原文出处】
钟周玥,于思远,葛胜祥. 人B细胞永生化研究进展[J]. 生物工程学报, 2021, 37(1): 30-39
原文链接：https://cjb.ijournals.cn/cjbcn/article/abstract/gc21010030?st=search
指导教师：王战辉
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