摘要：本研究优化了一种基于肽载体的尼古丁疫苗的设计。该肽载体由固相蛋白合成技术制备，包含B细胞和T细胞表位，并去除了载体中与疫苗功能无关但具有高度免疫原性的序列。
本研究通过优化T细胞表位域的氨基酸序列以提高疫苗活性，同时测试了多价疫苗设计中结构不同的半抗原对抗体反应的累加效果。结果表明三价疫苗在小鼠体内诱导的抗体浓度比吸烟者血液中的尼古丁浓度高100倍，并显著降低了大鼠的急性尼古丁毒性。
本研究探讨了肽载体与传统重组载体的两点区别。首先，这种肽载体引发的抗载体反应较少，从而降低了对疫苗活性的抑制作用。其次，采用固相合成技术制备的半抗原化肽无需依赖传统的化学偶联工艺，简化了生产流程，提高了疫苗抗原的效率和一致性。
【引语】
药物成瘾是一种慢性复发性脑疾病，表现为强迫性渴望、控制能力丧失以及在意识到负面后果的情况下仍持续使用。然而，由于开发能够安全抑制或调节特定神经通路的药物存在巨大挑战，目前有效的成瘾治疗药物非常有限。一种替代治疗策略是利用抗体阻止或减缓药物进入大脑，从而减弱药物摄入带来的强化作用。许多抗药物疫苗和单克隆抗体的动物试验表明，它们能够有效减少与成瘾相关的生理和行为反应。然而，在人类临床测试中，由于偶联疫苗未能在大多数受试者中诱导足够浓度的抗体，研究进展受阻。
本研究开发了一种尼古丁疫苗，以合成短肽为载体替代传统重组蛋白载体。载体的前35个氨基酸（AA）形成一个两亲性α螺旋结构，用于介导卷曲线圈的组装，从而实现高密度的半抗原偶联和抗原展示。此B细胞表位肽载体连接普适性CD4 T细胞表位（TCEs），能够与不同物种和人群中的主要组织相容性复合体II（MHC II）等位基因结合。在之前的研究中，该团队已验证GLA-SE佐剂在提高抗体反应中的重要作用，以及结构特异性半抗原和双价设计在调节抗体浓度和亲和力中的作用。本研究进一步通过优化TCE域组成和设计含有三种结构不同半抗原的疫苗来最大化疫苗性能。这种优化后的疫苗在小鼠体内诱导的抗体浓度比吸烟者体内的尼古丁浓度高100倍，并减少了大鼠的急性尼古丁毒性。此外，本研究还发现了肽载体与重组载体的两个优势：对载体的抗体反应较少，从而降低了载体抑制的可能性；固相合成的半抗原化肽，简化了生产并提高了抗原活性。
【内容介绍】
1．T细胞表位域的优化
在构建多价疫苗之前，筛选了几种普适性T细胞表位的活性。表1列出了7个在啮齿类动物、猴子和人类中表现出广泛反应的表位。第一个实验测试了含单一（P12和P13）或融合（P9）TCE的载体活性差异。这些肽与半抗原10偶联（图1），与GLA-SE佐剂配制后注射CD-1小鼠。实验结果显示，P12和P13分别诱导了3.0 × 10⁵和1.5 × 10⁵的平均抗体效价，而P9则刺激了9.5 × 10⁵的抗体效价，这一效价显著高于两者的简单相加效果（图2A）。这几种肽诱导的尼古丁抗体的相对亲和力无显著差异。随后，测试了其他TCE融合是否能进一步提高抗体反应，分别使用P10、P14和P15与半抗原30偶联（图3）。尽管有显著的序列重叠，半抗原30-P10相较于其他肽诱导了更高的抗体效价和亲和力。
图1.该研究中使用的尼古丁半抗原
表1.通用T细胞表位
图2.该研究中使用的尼古丁半抗原TCE融合物协同改善抗体应答。半抗原10与P9、P12或P13偶联(表1)。用5 mg肽加佐剂免疫小鼠(n=10/grp)。在D56天收集血清并测定抗尼古丁Ab滴度
图3. P10载体选择。将肽P9、P10、P14和P15（表1）与半抗原30偶联，并用5 mg每种肽加佐剂免疫小鼠。使用D56血清通过ELISA测定抗体滴度
2．P10肽诱导的抗载体抗体反应有限
重组蛋白载体通常包含与疫苗功能无关但具有高度免疫原性的序列，会诱导抗载体抗体反应，从而在免疫加强过程中抑制疫苗活性。例如，CRM197（一种用于肺炎、脑膜炎和Hib疫苗的商业载体）在疫苗接种后会显著降低尼古丁疫苗的功能活性。在选择P10肽后，比较了P10和CRM197作为载体的抗原活性。两种疫苗在诱导抗尼古丁抗体效价和亲和力上表现相似（图4A和4B）。然而，半抗原10-CRM197诱导的抗载体抗体效价与抗尼古丁抗体效价相当，而半抗原10-P10诱导的抗载体抗体效价比抗尼古丁抗体低3-4个数量级（图4C）。这些结果表明，与传统载体相比，P10的序列复杂性较低，因此不易引发载体抑制。
图4.与CRM197相比，P10肽诱导显著更低的抗载体抗体滴度。用10 mg用GLA-SE佐剂的10-P10或10-CRM197免疫小鼠（n=8）。使用D56血清通过ELISA测定抗尼古丁抗体滴度
3．多价疫苗的选择
研究表明，多价尼古丁疫苗使用结构不同的半抗原可以独立激活不同的B细胞群体，从而刺激累加的抗体反应。首先评估了4种结构不同的半抗原的免疫原性，这些半抗原在连接臂长度和尼古丁结合点上存在差异（图1）。实验结果显示，4种半抗原在抗体效价上相当，但除了半抗原4外，抗体亲和力和尼古丁结合能力也相近（图5）。随后，评估了这些半抗原的抗血清交叉反应性。数据显示，半抗原10、30和6之间的交叉反应率小于10%，而半抗原30和4之间的交叉反应率约为50%。这表明，半抗原10、30和6可以独立激活不同的B细胞群体，而半抗原30和4的B细胞激活模式显著重叠。
接着，测试了多价疫苗对抗体浓度的影响。小鼠分别接种单价（30）、双价（10+30、10+4）和三价（10+30+4、10+30+6）疫苗，并测定第56天血清中的尼古丁结合能力（图6）。结果显示，双价设计疫苗10+30和10+4的结合能力比单价疫苗30提高了约1.75-2倍。而三价疫苗10+30+4由于半抗原30和4之间的抗体交叉反应，其结合能力仅略高于双价疫苗。然而，三价疫苗10+30+6的抗体浓度达到5.2 mg/mL，比单价疫苗30提高了约2.5倍，并且是吸烟者血液中尼古丁浓度（20-60 ng/mL）的100倍。这些数据验证了多价疫苗在提升抗尼古丁抗体浓度方面的策略有效性。
图5.与CRM197相比，P10肽诱导显著更低的抗载体抗体滴度。用10 mg用GLA-SE佐剂的10-P10或10-CRM197免疫小鼠（n=8）。使用D56血清通过ELISA测定抗尼古丁抗体滴度
图6. 与CRM197相比，P10肽诱导显著更低的抗载体抗体滴度。用10 mg用GLA-SE佐剂的10-P10或10-CRM197免疫小鼠（n=8）。使用D56血清通过ELISA测定抗尼古丁抗体滴度
4．抑制大鼠的尼古丁毒性
在小鼠试验的同时，还测试了10+30+4疫苗在大鼠中的免疫原性。第56天血清中，免疫组的平均抗体效价为2.8 × 10⁵，尼古丁结合能力为3.2 mg/mL。在记录基线运动活动一周后，对照组和免疫组大鼠分别注射大剂量的尼古丁（3 mg/kg）。实验显示，对照组大鼠在注射后几分钟内出现从轻微失衡到癫痫发作的症状，而免疫组大鼠的急性反应显著减轻（图7A，P < 0.006）。此外，尼古丁暴露后对照组大鼠的活动距离显著减少（P = 0.006），而免疫组大鼠的活动水平保持不变（图7B）。随后的一次尼古丁注射表明，免疫组大鼠血清中尼古丁浓度显著升高，而大脑中的尼古丁含量减少了60%（图8，P < 0.001）。这些结果表明，免疫组大鼠体内产生的抗体能够有效将尼古丁隔离在血液中，从而抑制急性毒性。
图7. 尼古丁注射后大鼠的行为反应。在注射PBS一周后，注射3.0 mg/kg尼古丁
图8. 尼古丁在对照和接种疫苗的大鼠中的药代动力学。向动物注射0.3 mg/kg尼古丁，5分钟后收集组织。通过LC/MS测量脑和血清中的尼古丁水平。
【小结】
吸烟者动脉血中的尼古丁浓度通常在20至60 ng/mL之间。本研究中提出的新型疫苗设计能够在啮齿动物中产生3000–6000 ng/mL的尼古丁结合能力，这一浓度远远超出在人类中达到疗效所需的理论浓度（100倍以上）。
【原文出处】
Zeigler DF, Roque R, Clegg CH. Optimization of a multivalent peptide vaccine for nicotine addiction. Vaccine.
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X1930180X
指导教师：王战辉
抗体故事分享基于抗体的分析方法研究进展，欢迎投稿！
长按下图识别图中二维码，轻松关注！
