摘要：单克隆抗体(mAb)是一类重要的生物制剂，可用于治疗和诊断。单B细胞技术是一种新型的mAb制备技术，但记忆B细胞的体外培养分化和昂贵的细胞分选仪限制了其广泛应用。本研究开发了一种基于磁流体技术和线性表达框技术的快速制备人源重组单克隆抗体的方法，在10天内成功从恢复期COVID-19患者外周血中的单个抗原特异性抗体分泌细胞（ASC）获得了SARS-CoV-2的刺突（S）糖蛋白特异性人重组mAbs，并对其进行了功能性分析。该方法省时省力，在疫苗和抗体药物研发方面具有广泛潜力。
【引语】
单克隆抗体（Monoclonal antibodies，mAbs）是一类重要的生物制剂，可用于治疗和诊断。人mAb可通过多种方法产生，如用EB病毒使B细胞永生化、杂交瘤技术、将其它物种的抗体进行人源化、噬菌体展示、单B细胞技术等。这些方法均具有不同的局限性。其中，昂贵的细胞分选仪限制了单B细胞技术的应用，且分离出的抗原特异性记忆B细胞需要进行体外培养后才能分化为抗体分泌细胞（ASCs）。ASCs是血清中高质量抗体的来源，但与记忆B细胞不同的是，ASCs表面不表达或仅表达少量B细胞受体（BCR），这使得难以通过BCR来分选出ASCs，因此需要开发一种新方法来筛选抗原特异性ASCs。
磁流体是一种含有纳米级磁颗粒的胶体流体。其中的颗粒通常由氧化铁等材料制成，其表面涂有防止颗粒之间发生凝集结块的表面活性剂。磁流体具有特殊的超顺磁性，当暴露在外部磁场中时可表现出强磁性。与微珠相比，磁流体的纳米颗粒要小得多，其更大的表面积使得其与抗体或配体的结合能力增强，从而提升了其从样本中捕获靶细胞的效率。
本研究应用磁流体技术对人外周血单核细胞（PBMC）进行磁性分选，回收CD138阳性ASCs群体，然后通过检测细胞培养上清液对分泌抗原特异性抗体的细胞进行筛选，再结合线性表达框技术以快速表达和分析目标抗体，在10天内成功获得了具有中和活性的SARS-CoV-2的刺突（S）糖蛋白特异性人重组单克隆抗体。
【内容介绍】
1、 利用磁流体技术富集血液中ASCs并鉴定特异性的ASCs
采集SARS-CoV-2感染恢复期成年献血者血液样本（约40 mL/人），用ELISA检测血清抗体（图1），并分离外周血单个核细胞（PBMC）。用含有缀合了磁流体颗粒的抗人CD 138抗体的缓冲液稀释PBMC，将其置于四极磁分离系统中进行三轮孵育温育以富集CD 138阳性的ASCs，然后去除细胞结合的磁流体颗粒，最终获得高度富集的CD 138+细胞的细胞群。如图2所示。使用该方法可以平均从1 mL血液中获得5×103个CD 138阳性的细胞。将富集的细胞进行计数，并以50个细胞/孔进行细胞培养，用ELISA鉴定细胞上清液并筛选抗原特异性阳性孔，试验结果显示4%的上清液IgG分泌量超过200 ng/mL；通过有限稀释将阳性孔重新铺板，保证每孔仅有一个细胞，再通过ELISA鉴定出抗原特异性ASCs。本研究从4.4×105个CD 138阳性细胞中鉴定出了132个刺突糖蛋白特异性的ASCs。
图1. （A）献血者信息及血清滴度。（B）不同献血者血清抗体ELISA滴定曲线图。
图2. 使用CD 138磁流体技术富集血液ASCs的关键步骤示意图。（A）献血者血液样品采集。（B）密度梯度离心分离PBMC。（C）加入CD 138磁流体等试剂。（D）与（E）孵育。（F）去除CD 138-的细胞。（G）去除磁流体纳米颗粒。（H）收集富集的ASCs。
2、获取抗体可变区，构建线性表达框及质粒载体并表达重组抗体
裂解单个抗原特异性ASC，进行RT-PCR，通过两个巢式PCR反应扩增抗体重链（IgH）和轻链（IGκ和IGλ）基因的可变区。本研究从58个抗原特异性ASCs中获得了36对配对的重链和轻链可变区基因（比例约为60%）。为了评估该方法对冷冻样本的适用性，本研究对来自同一供体的新鲜和冷冻PBMC的抗原特异性ASCs进行了相同的处理。研究结果表明，从冷冻和新鲜PBMC样本中得到抗体可变区的比例相当，证明此方法可应用于冷冻PBMC样本（图3）。
随后构建由人巨细胞病毒（hCMV）启动子、IG可变区（VH或VL）、含有多聚腺苷酸信号序列的恒定区顺次连接而成的线性DNA片段（mini基因,即线性表达框），此方法省去了克隆步骤，简化了抗体表达过程。同时将抗体可变区构建至质粒载体。（图4A）
用成对的线性表达框或编码克隆抗体的质粒DNA瞬时转染到Expi-HEK 293 F ™细胞中以产生用于验证筛选的重组抗体，在转染后第3天和第6天收集细胞上清液。（图4B）
图3. 来自同一个体的新鲜和冷冻PBMC中单个抗原特异性ASC的抗体重链和轻链可变区回收率的比较。两种样品的扩增条带频率和强度相当。
图4. （A）抗体可变区的扩增及线性表达框和质粒载体的构建。（B）线性表达框转染Expi-HEK 293细胞，并检测细胞上清。
3、重组单克隆抗体的性能鉴定及遗传表征分析
用ELISA对细胞上清液进行鉴定。试验结果表明，本研究成功表达出36种针对刺突蛋白的重组单克隆抗体，抗体产量范围为0.1-100 μg/mL，均表现出特异性结合能力（图5A），其中23种抗体的结合灵敏度如图5B所示。
选择22种的重组单抗进行倍比稀释，分别与等体积的SARS-CoV-2 WT毒株、Delta毒株及Omicron毒株混合，在37℃下孵育，再加入Vero E6细胞悬液并孵育。于显微镜下观察细胞病变效应（CPE）并计算中和试验的几何平均滴度（GMT）。试验结果如图6所示，在进行测试的22种抗体中，两种（9%）抗体对SARS-CoV-2 WT毒株和Delta毒株具有良好的中和活性，但所有抗体均不具有对Omicron毒株的中和活性。
对这22种抗体的可变区进行测序并分析VH基因库和H-CDR 3的长度。结果如图7所示，IGHV 1 -69、IGHV 3 -33和IGHV 6 -1为IGHV的高频使用基因，JH 4为IGHJ的高频使用基因；抗体H-CDR 3的长度范围为12-24个氨基酸（aa），大多数（86%）为15-20个aa，略多于其他研究中报道的氨基酸数量。
图5. 线性表达框瞬时转染细胞获得重组单抗。ELISA测定抗体的（A）结合能力，（B）灵敏度。
图6. 22种重组单抗对三种SARS-CoV-2毒株的中和活性。
图7. 22种重组单抗VH区的分析：（A）VJ基因的使用情况统计，（B）CDR 3序列氨基酸长度统计。
【小结】
本研究建立了基于磁流体的ASCs分离与线性表达框技术的重组单克隆抗体快速高效制备方法。在短短10天内从COVID-19康复个体的血液样本中富集鉴定SARS-CoV-2的刺突（S）糖蛋白特异性ASCs，并构建线性表达框以瞬时表达了36种重组单克隆抗体，经鉴定，有2种重组抗体对SARS-CoV-2 WT毒株和Delta毒株具有良好的中和活性，对COVID-19感染的临床治疗有一定意义。本研究为重组单克隆抗体的快速制备开辟了一条低成本、高效率的新途径，在新兴病原体的疫苗和抗体药物研发方向具有广阔的应用潜力。
【原文出处】
Strazza V, Rossi M, Avati A, Tiseo G, Falcone M, Cusi MG, Menichetti F, Ricciardi-Castagnoli P, Tinti C, Pileri P. Rapid generation of human recombinant monoclonal antibodies from antibody-secreting cells using ferrofluid-based technology. Front Immunol. 2024 Apr 18;15:1341389. doi: 10.3389/fimmu.2024.1341389. PMID: 38698845; PMCID: PMC11064063.
原文链接：https://www.frontiersin.org/journals/immunology/articles/10.3389/fimmu.2024.1341389/full
指导教师：王战辉
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