【摘要】
酶联免疫吸附法（ELISA）是目前应用最广泛的一种免疫分析方法，但是由于其高度依赖于不稳定的生物酶，使其检测灵敏度和稳定性较差，限制了其在复杂检测条件下对痕量分析物的检测应用。本团队提出了一种由二氧化锰纳米片（MnO₂ NSs）和碱性磷酸酶（ALP）组成的纳米酶-生物酶级联催化增强的比率荧光传感平台。在此平台中，多功能的MnO₂ NSs作为一种强大的类氧化物纳米酶可催化无荧光的Amplex Red（AR）转化为荧光产物试卤灵，并同时作为荧光猝灭剂猝灭碳点（CDs）的荧光。考虑到ALP可以催化磷酸抗坏血酸酯（AAP）生成抗坏血酸（AA），而AA进一步将MnO₂ NSs还原为Mn2+，导致AR荧光减弱，CD荧光恢复。因此，MnO₂ NSs对AR和CDs荧光强度的调节可与ALP触发的水解反应级联，构建纳米酶-生物酶级联催化增强的比率荧光传感平台。所建立的比率荧光传感平台对ALP的检测限可达0.037 mU mL-1。受比率荧光传感平台优良性能的启发，进一步用于莱克多巴胺（RAC）高灵敏检测的级联催化比率荧光ELISA，最低检出限为0.029 ng mL-1，可用于多种样本中的RAC精准检测。
原理图：纳米酶−生物酶级联催化增强比率荧光免疫传感平台检测示意图
【研究内容】
MnO₂ NSs和CDs的合成与表征
通过MES还原法快速地合成了MnO₂ NSs。如图1所示，所制备的MnO₂ NSs能够稳定地分散在水中，其溶液在日光下溶液呈棕色。利用紫外-可见光谱、透射电镜、元素能谱、傅里叶变换红外光谱以及X射线光电子能谱（XPS）对制备的MnO₂ NSs进行表征，证明MnO₂ NSs已成功合成，可用于后续实验。
图1：合成的MnO₂ NSs表征。MnO2的(A)紫外-可见光吸收光谱和溶液实拍图像(B)透射电镜图像 (C)元素能谱(D)红外光谱 (E)全扫描XPS光谱和 (F) Mn2p的高分辨率XPS谱。
利用高压溶剂热法合成了蓝色荧光CDs。透射电镜表征CDs的形貌和尺寸，结果表明合成的CDs分散良好，呈现为均匀的球形纳米颗粒，平均尺寸为2.6 nm。进一步以荧光光谱、XPS对合成的CDs进行了表征验证CDs合成成功且具有强蓝色荧光。
图2：CDs的表征。CDs的(A)透射电镜图像 (B)荧光光谱和在紫外光照射下的图像 (C) 全扫描XPS光谱，以及(D) C1s、(E) O1s和(F) N1s的高分辨率XPS光谱。
纳米酶-生物酶级联催化增强比率荧光传感体系可行性验证
如图3A所示，MnO₂ NSs能够将无荧光的AR催化为在585 nm处有最大发射峰的荧光产物试卤灵，证明了其具有类氧化物酶活性。此外，进一步考察了MnO₂ NSs对一系列不同浓度AR的催化（图3B）。随后，通过稳态动力学测定研究了MnO₂ NSs的类氧化酶活性，其对AR的米氏方程如图3C所示。此外，在空气和氧气体系中，MnO₂ NSs对AR的催化和产物荧光显著增强，证明了溶解氧在MnO₂ NSs催化过程中起着重要作用。同时，在MnO₂ NSs催化稳定性考察中，MnO₂ NSs在较宽的pH范围、高温、高离子强度等极端条件下均展现出较好的催化稳定性，证明其有潜力作为HRP的理想替代品。
由于MnO₂ NSs的紫外-可见光吸收光谱与CDs的荧光激发和发射光谱有高度重叠，CDs和MnO₂ NSs混合溶液的荧光强度明显弱于单独的CDs，表明MnO₂ NSs能够显著猝灭CDs的荧光（图3E）。随后，我们进一步探究了MnO₂ NSs猝灭CDs的荧光的具体机制。如图3F所示，CDs和CDs与MnO₂ NSs混合物在360 nm处有相似的吸收峰，且整体未出现峰位移以及新峰的形成，排除了静态猝灭过程的发生。此外，Zeta电位结果表明MnO₂ NSs和CDs同带负电荷，排除了荧光共振能量转移过程发生的可能性。进一步测定了MnO₂ NSs加入前后CDs的荧光寿命变化，结果表明在MnO₂ NSs加入前后CDs的荧光寿命基本不变，表明MnO₂ NSs对CDs的荧光猝灭是由于内滤效应（IFE）。基于上述结果，MnO₂ NSs可作为类氧化物纳米酶将AR催化为荧光产物试卤灵（发射波长585 nm），同时作为猝灭剂猝灭CDs（发射波长460 nm）的荧光（图3I）。鉴于ALP能够将AAP水解为AA，而AA可将MnO₂ NSs还原为Mn²⁺导致MnO₂ NSs的类氧化酶活性和猝灭效应减弱，进一步致使AR的荧光减弱，CDs的荧光恢复。因此，可以基于MnO₂ NSs对AR和CDs荧光的调控与ALP触发的催化反应进行级联，构建一种级联催化增强的比率荧光传感平台。
图3：纳米酶−生物酶级联催化增强比率荧光传感平台的构建。(A) MnO₂ NSs的催化AR的荧光光谱 (B) MnO2NSs催化一系列浓度AR的荧光光谱 (C) MnO₂ NSs对AR底物的米氏方程(D) MnO₂ NSs分别在氮气、空气和氧气条件催化AR的比较(E) MnO₂ NSs的紫外−可见光吸收光谱与CDs的荧光光谱之间的光谱重叠情况(F) CDs、MnO₂ NSs、CDs和MnO₂ NSs的混合物的紫外−可见光吸收光谱，MnO₂ NSs和CDs的(G) zeta电位(H) MnO₂ NSs加入前后CDs的荧光寿命变化，以及(I) MnO₂ NSs催化AR和猝灭CDs荧光的原理示意图。
为验证所提出的级联催化增强比率荧光传感平台的可行性，研究了该系统中包括MnO₂ NSs、CDs、AA以及AR在内的其他组分对荧光信号的影响。如图 4B所示，当在360 nm激发时，CDs在460 nm处有较强荧光，加入AR对CDs荧光没有影响。引入MnO₂ NSs后显著猝灭了CDs的荧光。此外，MnO₂ NSs和AR的混合物在360 nm激发下在585 nm处显示出强发射峰。当向该混合物中加入CDs时，只能看到585 nm处的荧光，CDs的荧光被显著猝灭，证明MnO₂ NSs既能催化AR的氧化，又能作为猝灭剂猝灭CDs的荧光。当将AA引入AR+MnO₂ NSs、CDs+MnO₂ NSs以及CDs+AR+MnO₂ NSs体系中时，AR的荧光减弱，CDs的荧光恢复，从而产生了F585/F460的比率荧光响应。这些结果证明可以成功构建所提出的级联催化比率荧光传感平台。在最优工作条件下，评估了所构建的比率荧光传感平台用于ALP检测的实际性能。如图4A所述，比率荧光传感平台可基于调节MnO₂ NSs对AR和CDs的作用，并与ALP触发的反应形成级联，从而应用于ALP的定量检测。如图4C、D所示，随着ALP活性的增加，CDs在460 nm处的荧光强度缓慢升高，AR在585 nm处的荧光强度则逐渐降低。与以往的研究相比，所开发的比率荧光传感平台对ALP具有相对更低或相当的检测限。
图4 用于ALP检测的级联催化比率荧光传感平台的实际性能 (A)比率荧光传感平台用于ALP检测的示意图 (B) CD、AR、AA和MnO2的不同组合下的荧光光谱 (C) CD和AR对于不同ALP的荧光光谱响应和(D)不同ALP浓度下的 (E)比率荧光信号的校准曲线。
用于RAC检测的纳米酶-生物酶级联催化增强比率荧光ELISA的建立
基于所提出纳米酶-生物酶级联催化比率增强比率荧光传感平台检测ALP的优异性能表现，我们通过引入ALP标记的二抗和RAC的特异性抗体，构建了一种用于RAC检测的级联催化增强比率荧光ELISA。经过条件优化，所开发的级联催化比率荧光ELISA在0.03-1.0 ng/mL的较宽线性范围内对于RAC的检测限为0.029 ng/mL（3σ/S）（图5C）。传统ELISA的检测RAC的标准曲线如图5D所示，其线性范围为0.1-1.0 ng/mL，检测限为0.16 ng/mL（3σ/S）。这些结果表明，所提出的纳米酶-生物酶级联增强比率荧光ELISA与传统ELISA相比灵敏度提高了近5.5倍，并且对RAC有良好的特异性。采用加标猪肉和牛肉样品进行回收实验。经提取并用Tris - HCl缓冲液40倍稀释后，利用级联催化比率荧光ELISA进行定量检测。加标样品的回收率在87.6% - 96.3%之间，相对标准偏差低于13.3%，证明所提出的级联催化比率荧光ELISA能够准确测定实际肉类样品中的RAC。
图5.纳米酶-生物酶级联催化比率荧光ELISA检测RAC的性能。不同RAC浓度下(A) CDs和 (B) AR的荧光光谱的变化 (C)比率荧光信号（F585/F460）随RAC浓度对数的变化 (D) 传统比色ELISA校准曲线 (E) 开发的比率荧光ELISA对RAC的检测特异性
综上，本研究提出了一种由MnO₂ NSs和ALP组成的纳米酶-生物酶级联增强比率荧光传感平台，并进一步将该平台与传统ELISA相结合，开发出了一种高灵敏、高稳定的级联催化比率荧光ELISA用于RAC检测。得益于两次紧密的酶促信号放大以及高灵敏度和高稳定的比率荧光信号读数，所提出的级联催化比率荧光ELISA用于RAC检测的检测限为0.029 ng/mL，比基于相同RAC抗体的传统ELISA低约5.5倍。总之，该方法为RAC检测提供了一种有效的定量手段，并为其他化合物的痕量鉴定提供了一个灵敏且可靠的传感平台。
【原文出处】
Liang Luo, Chaochao Chen, Jincheng Xiong, Yanton Pan, Qiang Li, Xiaonan Wang, Sihan Wang, Jianzhong Shen, and Zhanhui Wang※. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2024 72 (47), 26504-26513
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.4c08869
指导老师：王战辉
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