【摘要】
表征适配体结合的一个关键步骤是测量其对靶分子和非靶分子的结合亲和力。解离常数 （Kd） 是表征适配体结合的最常用值。本文综述了可结合小分子靶标适配体的均相测定方法，包括无标记方法，例如等温滴定量热法、目标分子的内在荧光、DNA 染色染料和核酸酶消化测定，以及标记方法，例如链置换反应，和某些不推荐使用的方法，例如基于金纳米颗粒聚集和从纳米材料中解吸荧光团标记的 DNA的方法。本文强调了测得的表观 Kd和真正的 Kd的差异。此外，还讨论了避免滴定方案和注意达到平衡所需的时间。最后，重要的是要包括突变的非结合序列作为对照。
适配体在多个领域引起了广泛关注，包括分析生物传感器、药物开发、靶向药物递送、分离技术和纳米技术等。DNA适配体因其稳定性强、易于修饰、可编程结构以及经济高效的合成方法，成为研究的重点。DNA适配体的分离通常采用指数富集配体系统进化（SELEX）方法。自 1990 年以来，报告了许多适配体，首先是通过实验室中的 SELEX，后来是从自然界中发现的核糖开关。适配体与其靶标的结合亲和力可以通过解离常数（Kd）来表示，Kd值的测量可以作为了解适配体的选择性并通过突变研究鉴别关键的核苷酸的一种方式。适配体可以选择性地与靶分子结合，不同类型的靶标适用于不同的结合测量方法。例如，表面等离子体共振光谱（SPR）常用于蛋白质结合适配体的测定，流式细胞术则多用于细胞结合适配体。小分子结合适配体的测量方法具有最大的灵活性，本文建议采用均相分析，如无标记和标记方法。测量机制可分为基于热量、荧光、颜色和其他光学甚至电化学输出的产生。本文重点介绍了图1中用相似文库设计分离的适配体，讨论了测量适配体经验Kd值的大多数方法，并且指出哪些方法并不推荐。图1.A） 腺苷（两个靶腺苷分子以紫色表示）、B） L-乳酸、C） 氯霉素、D） 尿苷、E） 脱氢异雄酮-3-硫酸盐 （DIS） 和 F） 土霉素及其各自靶标的适配体的二级结构。
【内容介绍】
1.适配体的解离常数Kd
Kd表示两个相互作用物复合体解离成各自物质的倾向。对于以1:1摩尔比结合的物质，结合平衡可以表示： ![]()
（1）其中，A是适配体，T是目标分子，A·T是它们的复合物。Kd的值可以通过下列公式计算：
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（2）
其中，[A]free和[T]free分别是游离适配体和目标分子的浓度。然而，实际操作中，通常难以直接测量每种组分的浓度，且靶分子浓度通常远高于适配体浓度。为了简化计算，通常假设靶标浓度足够高，以便忽略其对适配体浓度的影响。此时，结合靶标的分数（F）可通过以下公式确定：
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（3）
在实验期间，使[T]free = [T]total成立，目标的浓度必须保持远高于适配体的浓度。由于仪器对荧光或吸光度测量的灵敏度有限等原因，目标的活性浓度可能并不总是足以做出此假设。在这些情况下，使用更复杂的完整方程：
（4）
如果 [A] >> Kd、Kd在上式中可以忽略不计，则公式简化为 Kd= 1/2[A]total，这被认为是“滴定制度”。 但在实际测定时，要避免仅依赖滴定法，因为它可能导致偏差。此外，表观Kd 可能与Kon和Koff 有关，因为
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（5）
为了获得准确的Kd值，必须确保系统达到平衡。如果实验没有给予足够时间让反应达到平衡，可能会导致Kd的测定不准确，尤其是在适配体浓度较低时。在本文讨论的所有测定方法中，除非另有说明，Kd的确定均采用公式（3）。
硫黄素 T （ThT） 存在下腺苷滴定腺苷适配体，腺苷靶标的滴定诱导适配体结合的 ThT 的释放，导致荧光降低。在这种情况下，适配体的浓度保持在 100 nM，明显低于其表观Kd，可以将数据拟合到公式（3）中确定，通过该测定法测定为 9.5 μM，ITC 获得的值为8.2 μM，与 ThT 测定一致。图2.A） 使用腺苷作为靶标的 ThT测定示意图。B） 随着添加腺苷量的增加，ThT 与经典腺苷适配体结合的荧光反应。C） ThT 荧光减少作为腺苷浓度增加的函数。
2.等温滴定量热法（ITC）
ITC 被广泛认为是适配体Kd测量的金标准方法。通过将目标分子逐渐滴定到适配体溶液中，测量释放或吸收的热量，并与参考池的热量变化进行比较，可以获得热力学常数（如Kd）等重要参数。通过对热量变化的积分，可以计算热力学常数。Johnson组发表了ITC的详细步骤，本文对几个关键的部分进行讨论。
图3.A） ITC 示意图和可以从中获得的热力学参数。将氯霉素滴定为其适配体的 ITC热谱图 B） 不退火和 C） 适配体退火。
适配体浓度：为确保准确测量，适配体浓度通常需要大于其Kd值。对于Kd低于500 μM的适配体，ITC可以有效验证其结合。乳酸适配体由于其结合亲和力低，作者不得不使用 300 μM 的适配体浓度，这一结果证明了获得适配体Kd的初始估计值的重要性，以便可以使用适当的适配体和目标浓度。此外，目标浓度应高于适配体浓度，以确保滴定过程中完成结合。如果观察到的配体-适配体化学计量（N）远小于1，假设靶标和适配体浓度都是正确的，这可能是由于适配体的错误折叠，导致其不能有效结合目标分子。错误折叠可能源于聚合物的形成或折叠成不结合的稳定构象。通过加热并缓慢冷却样品至室温对适配体进行退火后，相同的实验产生了更多的热量和 N 值接近 1。对于某些适配体，可以在不退火的情况下获得接近 1 的 N 值。为了获得一致的结果，作者建议在每次实验前对适配体进行退火处理。缓冲成分：为确保实验的准确性，进样注射器和样品室应使用相同的缓冲液成分和pH值。目标溶液的pH值应调整为接近缓冲液的pH值，以避免pH差异引起的非预期热量干扰结合信号。对目标溶液进行缓冲液滴定，以减去由目标稀释引起的热量，从而提高Kd测定的准确性。温度：ITC实验通常在20°C或25°C进行。 由于结合反应通常具有负熵变，因此在较低温度下结合通常更有利。对于低亲和力适配体，使用低温有利于信号的产生。局限性：仪器昂贵、实验速度慢且清洁过程繁琐。对于低亲和力的适配体，所需的DNA浓度可能非常高，因此对于Kd值在毫摩尔级别的适配体，ITC的成本较高，且DNA可能形成分子间复合物，这使得ITC在这些情况下不太适用。由于这些限制，ITC主要用于验证结合和获得热力学数据，而系统地研究适配体与目标结合的影响因素（如盐、pH值、突变等）通常使用其他方法。3.无标记染料法
通过使用非荧光染料标记适配体，并监测在加入靶分子后的荧光变化来测定适配体与靶分子的结合。这种染料在不存在DNA时通常是非荧光的，但能与适配体非特异性结合后增强荧光信号，靶分子结合时可能会释放染料，从而降低荧光。某些情况下，适配体结合反而增强荧光，因其可能形成特定的二级结构。这种方法的主要优势是成本效益高，不需要修改适配体，便于测试核苷酸突变。使用染料法测定的表观Kd可能与真实的Kd有所不同，因为染料可能与适配体发生竞争性结合。若染料与适配体的相互作用较弱，则表观Kd会接近真实Kd。图4.A） 删除了 A35 的 R10G2 适配体和突变体的二级结构。B） Kd使用 ThT 荧光光谱法测定 R10G2 适配体和带有鸟嘌呤的 ΔA35 突变体。C） Kd的比较通过 ThT 测定和ITC 确定的不同适配体的值。每个符号代表不同的适配体。
通过对R10G2适配体与鸟嘌呤的结合进行滴定，测得Kd为0.2 µM，而删除A35突变体后，荧光变化较小，Kd增至322.1 µM。这个突变实验作为对照，确保了荧光变化来源于适配体与靶分子的特异性结合。在染料法中，适配体浓度可以低至50 nM，比典型的ITC实验（通常使用10 µM以上浓度的适配体）低200倍。使用的染料包括SYBR Green I（SGI）、噻唑橙和 G-四链体 （G4） 结合染料（ThT）。实验中发现ThT表现最好，特别是对于非G四链结构的适配体，其对适配体结合的干扰较小，得到的Kd更接近真实值。对于一些对ThT反应不强的适配体，可能需要使用较高浓度的DNA。染料为阳离子，容易与负电荷表面（如微孔板和比色皿）发生非特异性吸附。在实验中，使用石英比色皿可减少染料的干扰。染料法的测定结果可能与ITC法有所差异，大多数适配体的Kd值在这两种方法中相差不超过2倍，但在一些极端情况下，差异可能更大。例如，某些适配体在ThT法中的Kd为5.7 µM，但在ITC中为46.1 µM，说明ThT法可能显著增强了适配体与靶标的结合。4.无标记比色法
除了荧光检测外，还开发了无标记比色检测。3,3′-二（3-磺丙基）-4,5,4′，5′-二苯并-9-甲基-硫卡-硼花青素（MTC）是一种带负电的有机染料，不像传统的阳离子DNA染料那样与DNA结合。该方法利用MTC在不同聚集状态下的光学性质变化，尤其是在可见光范围内的吸光度变化。MTC 浓度的增加与 655 nm 处吸光度的增加成正比，表明 J 聚集体形成。当与适配体结合时，MTC 单体吸收 585 nm 处的光。添加靶标后，MTC 被置换，在溶液中，它在 655 nm 处形成强烈吸收的 J 聚集体，允许对靶标结合进行简单的光谱监测。图5：A） 使用 MTC 进行聚集体状态依赖性染料置换测定的示意图。B） MTC 染料的构及其在 655 nm 处的浓度依赖性吸光度。C） J 聚集体和单体 MTC 的吸光度与 SCA2.1 适配体浓度的关系。D） 655 nm 处的信号增益作为MDPV 滴定到 SCA2.1 适配体-MTC 复合物中的函数;插图显示了低靶标浓度下的信号增益。E） 将 MDPV 添加到适配体-MTC 复合物中的剂量依赖性颜色变化。此方法可以通过肉眼观察比色反应，且无需复杂设备。通过滴定MDPV靶分子，监测 J 聚集体的形成，得到了与适配体结合的曲线。然而，由于实验在滴定范围内进行，适配体浓度（2 µM）远高于该适配体的Kd（50 nM），因此无法准确测定Kd值。尽管该方法适用于快速靶分子检测，但由于需要较高浓度的DNA才能产生可靠的比色反应，这限制了其广泛应用。对于具有较弱结合力的适配体（Kd> 10 µM），可以避免滴定范围，从而测定Kd值。由于大多数有机染料的消光系数约为10⁵M-1 cm-1，需要使用低微摩尔浓度的染料，这使得适配体浓度也需要较高。为了克服这一点，使用金纳米粒子（消光系数 > 10⁸M-1 cm-1）可能是一种有吸引力的替代方法，但金纳米粒子也存在一些挑战。5.无标记核酸酶消化方法
当适配体与靶分子结合时，可以折叠成紧凑的结构，阻止部分核酸酶（如Exo III和Exo I）对适配体的消化。通过添加DNA染料（如SYBR Gold），可以对凝胶或溶液中剩余适配体进行染色，很容易观察到适配体的消化情况，从而评估适配体与靶分子的结合。Exo III和Exo I分别水解双链和单链DNA，其活性对结构变化敏感，结合靶分子会影响消化过程。
图6.A） 在存在和不存在 DIS 靶标的情况下，DIS-37 适配体的 Exo III 和 Exo I 核酸酶消化示意图。B） 对应于 DIS 浓度增加的 DIS-37-SYBR 复合物的荧光响应。C） 从 （B） 中的荧光响应得出的校准曲线。在不同浓度的 DIS 存在下，对 D） DIS-37适配体和 E） DIS-37-M 核酸外切酶消化产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳。F） 根据 DNA 分子量标准强度作为DIS 浓度的函数计算的 （D） 和 （E） 所得产物的量。
通过监测消化过程中的荧光变化，得到了DIS-37适配体与其靶分子（去氢异雄烯醇-3-硫酸盐）的结合曲线，并通过荧光反应确定了Kd值。实验中，通过ITC测得DIS-37适配体的真实Kd为3.4 µM，而核酸酶消化法测得的表观Kd约为25 µM。差异主要由于部分消化产物（适配体与靶分子结合后被保护）导致适配体变短，从而影响其结合能力。核酸酶消化法受目标结合动力学影响较大，较大的Koff 值可能导致更快的消化速率，从而影响Kd的测定。此方法需要较高的适配体浓度（如1 µM），这使得适配体的Kd测量通常处于滴定范围，可能导致Kd值的高估。且低亲和力的适配体可能会因较高的Koff 值导致实验结果不准确。使用凝胶电泳进行染色时，较低浓度的DNA难以被检测，因此需要较高浓度的适配体，这限制了该方法的普遍适用性，尤其是对于高亲和力的适配体。核酸酶消化法适用于低亲和力的适配体（较大的Kd值）。对于高亲和力的适配体，因其可能处于滴定范围内，不能提供准确的Kd值。6.基于荧光增强或猝灭的适配体结合检测方法
某些目标分子本身具有荧光，而适配体与目标分子的结合可能会增强或抑制其荧光。例如，孔雀石绿的荧光可以在与其RNA适配体结合后增强超过1000倍。通过监测荧光的变化，可以便捷地测定Kd值。土霉素（OTC）与其DNA适配体（OTC5）结合后，荧光强度显著增加。通过拟合荧光强度与适配体浓度的关系，得到了Kd值为98 nM，与ITC测得的Kd值（0.15 µM）相符，通过使用OTC5适配体的突变体，发现该突变体不能增强OTC的荧光，证明荧光增强是由特定的适配体结合引起的。图7.A） 使用四环素的内在荧光测量 Kd 。B） 在各种浓度的 OTC5 适配体存在下，使用 370 nm 激发的 100 nM OTC 荧光光谱。发射峰值为 530 nm。C） 随着 OTC5 适配体和非结合适配体突变体浓度的增加，100 nM OTC 的荧光强度。将数据拟合到单位点结合曲线。这种方法通过滴定DNA而不是目标分子，这要求注意DNA本身具有固有的荧光，可能会影响测量结果。当激发波长约为 300 nm 至 350 nm 时，观察到的荧光增加可能是由于添加的适配体的固有荧光，而不是与目标分子结合。当添加的 DNA 浓度较高（例如 >5 μM）时，这一点尤其值得关注。当在 260 nm 附近激发时，观察到的荧光下降可能是由于 DNA 吸收光的内滤效应。对于弱荧光靶标，可能需要使用高浓度的靶标（例如 1 μM）。该方法特别适用于那些具有明显荧光变化的目标分子，如四环素（OTC）。它为低亲和力目标分子的适配体结合提供了一种快速、有效的检测方式。链置换反应是一种基于荧光标记的标记法，通过结合荧光探针和猝灭探针来监测适配体与目标结合的反应。具体而言，一个短的猝灭探针（quencher-cDNA）与带荧光标记的适配体（如Lac201）结合时，会使荧光信号被猝灭。当适配体结合目标分子时，猝灭探针被置换出去，荧光信号恢复。为了促进该反应，适配体通常会延伸一些碱基对，以便适配体能更容易与目标结合，从而达到置换探针的效果。图8.A） 荧光团 （F） 和淬灭基团 （Q） 标记的 DNA 杂交导致淬灭荧光的示意图。与 L-乳酸结合后，荧光增强。B） 在不同浓度的 L-乳酸存在下荧光动力学变化。C） 传感器对 L-和 D-乳酸的校准曲线。D） FAM 标记的适配体在不同浓度的淬灭基团-cDNA 链滴定后的荧光变化。
通过对荧光信号随不同浓度的乳酸变化的反应动力学（图8B）进行监测，可以绘制出标定曲线（图8C）。通过滴定猝灭探针并测量荧光变化，可以计算表观Kd。进一步分析适配体与目标结合反应的Kd值，可以得到适配体的真实Kd值。该方法是可靠的，已被用于许多适配体的Kd测定，并且可以作为灵敏的生物传感器。但是，由于方法涉及到荧光标记和链置换反应，每个突变体都需要进行荧光标记，这使得进行突变分析时成本较高。但是，由于方法涉及到荧光标记和链置换反应，每个突变体都需要进行荧光标记，这使得进行突变分析时成本较高。但是，由于方法涉及到荧光标记和链置换反应，每个突变体都需要进行荧光标记，这使得进行突变分析时成本较高。该方法计算过程较为复杂，涉及到多个反应方程。8.1 金纳米颗粒（AuNP）比色法
此方法通过利用金纳米颗粒（AuNP）与单链DNA（ssDNA）的相互作用来测定适配体结合的Kd值。ssDNA能快速吸附到AuNP上，保护其免受盐诱导的聚集。当适配体与靶分子结合时，适配体的结构变化抑制了其对AuNP的吸附，从而导致AuNP聚集，颜色从红色变为蓝色。该方法未考虑靶分子对AuNP的直接吸附，这可能强烈影响AuNP的胶体稳定性，导致观测到的颜色变化并非仅由适配体与靶分子结合引起。因此，该方法无法可靠地用于测量适配体的Kd值，尤其是在靶分子可能与AuNP发生竞争吸附的情况下。不推荐使用该方法来验证新选择的适配体或准确测量适配体的Kd值，除非能通过设计对照序列来避免非特异性相互作用。8.2 氧化石墨烯（GO）解吸法
荧光标记的适配体吸附到氧化石墨烯（GO）表面，结合靶分子后，适配体从GO表面解吸，导致荧光信号增加。这种方法假设适配体与靶分子的结合使其从GO表面解吸，从而产生信号。该方法涉及竞争性反应，靶分子与适配体结合需要与适配体吸附GO表面竞争，因此观察到的表观Kd与实际的适配体结合Kd可能不同。此外，靶分子可能通过非特异性吸附改变GO表面的状态，导致解吸信号并不总是由适配体与靶分子的特异性结合引起。这种方法的问题在于其竞争性性质和非特异性吸附效应，使得它不适合用于准确测量适配体的Kd值。8.3 其他方法
微量热泳（MST）：通过监测游离适配体与结合适配体之间的扩散速率差异，MST可以用来测量Kd值，尤其适用于复杂样品（如血清）。然而，它需要荧光标记的适配体或靶标。 质谱（MS）和核磁共振（NMR）：这两种方法能够提供适配体结合后的构象变化信息，但由于对样品的要求较高，尤其是对DNA浓度要求较大，通常仅适用于高浓度样品。高效液相色谱（HPLC）：通过不同亲和力的保留时间分离适配体与靶标的结合复合物，但容易受到非特异性相互作用的干扰。干涉测量法和表面等离子共振（SPR）：这两种方法可以用于高灵敏度的Kd测定，适合用于蛋白质等大分子的测定，但对小分子靶标的敏感性较差。毛细管电泳（CE）和荧光偏振（FP）：这些方法在分离适配体、靶标和复合物时具有高效性，但通常需要荧光标记的样本。9.注意事项
9.1 控制措施的重要性
无论使用哪种适配体Kd测定方法，适当的控制措施都至关重要，尤其是在仪器设置、DNA质量、靶标浓度和缓冲液条件方面。即使方法本身可靠，也可能因这些因素而导致错误。非结合性适配体突变体作为控制方法非常有效。通过突变适配体的保守区域，能确保其二级结构和碱基组成基本不变，但破坏适配体的结合能力。若方法在测试不同突变体时总是给出相似的Kd值，那么这种方法可能无效。
根据目标分子的结构，可以估计适配体的Kd范围。例如，像乙醇胺这样的简单分子，适配体的Kd值通常不会低于nM范围；而葡萄糖适配体的Kd为5 mM，乳酸适配体为0.4 mM，这些较高的Kd值是合理的，因为这些小分子缺乏强的相互作用表位。通过系统研究不同适配体对目标分子的亲和力，可以深入了解预期的Kd值范围。如果实验中测得的Kd值明显偏离这一范围，可能是方法存在问题的信号。
在滴定实验中，探针分子的浓度应显著低于目标分子的Kd值，以确保适用简化的Kd拟合方程。如果探针浓度过高，测得的Kd值可能会是探针浓度的一半。确保系统处于平衡状态非常重要。在大多数均相分析中，适配体与小分子的结合速度较快，一般在短时间内即可达到平衡。因此，系统应在测量前充分混合并达到平衡状态。
对于一些适配体，尤其是那些结合动力学较慢的适配体（如某些土霉素适配体），可能需要较长时间才能达到平衡。在这种情况下，系统可能需要10分钟或更长时间才能稳定下来，尤其是在荧光信号的链置换反应中。因此，检查结合反应的动力学是很重要的，这有助于确保结果的准确性。不同的缓冲液组成、pH值、离子强度和温度等因素可能会影响适配体的结构和结合动力学。本文总结了在实验室中测量适配体与小分子结合亲和力（Kd）值方面大多数便于操作的方法。在未来的研究中，作者预计对于新研究的适配体，确定Kd值将成为一个必要步骤。在方法开发方面，作者预计这些方法将继续在实验室中占据主导地位。随着越来越多通过不同方法测得的适配体Kd值，未来可以对这些数据进行汇总，以探究不同方法之间Kd值差异的原因。基于新物理原理和不断改进的硬件，可能会有全新的测量方法出现。例如，使用下一代DNA测序（NGS）和数字技术等方法，这些方法具有很大的潜力。适配体结合可能会引起质量变化、热量释放、局部折射率变化等。这些都可以用于Kd测量，尽管由于实施成本较高，新的方法的广泛应用可能会比较缓慢。
Stangherlin, S., Ding, Y., & Liu, J. (2024). Dissociation Constant (Kd) Measurement for Small-Molecule Binding Aptamers: Homogeneous Assay Methods and Critical Evaluations. Small Methods.https://doi.org/10.1002/smtd.202401572抗体故事分享基于抗体的分析方法研究进展，欢迎投稿！
