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摘要：Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety：金黄色葡萄球菌肠毒素(SEs)是金黄色葡萄球菌的主要毒力因子，通过在生产、加工、销售和市场的不同阶段渗透到食品供应链中，引起广泛的食物中毒并严重威胁人类健康。金黄色葡萄球菌的显著流行需要有效、快速和灵敏的方法来早期检测SEs。本文综述了被污染食品中SEs的危害、SEs的特点和世界范围内的法规，以及SEs的各种检测方法，主要包括生物检测、基因检测、质谱检测和生物传感器，并对各种方法的优缺点进行了广泛的比较和讨论。重点介绍了基于抗体、适配体、分子印迹聚合物、和T细胞受体的用于筛选SEs的生物传感器，如光学、电化学和压电生物传感器。最后，本综述分析了生物传感器对SEs监测的挑战，总结了新型生物传感器的发展趋势。
1 介绍
微生物毒素是由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌产生的有害代谢产物(Rajkovic等人，2020)。在合适的湿度和温度条件下，细菌在食物上生长，然后释放各种毒素，如肉毒杆菌神经毒素(Smith等人，2018年)、产气荚膜梭菌肠毒素(Rood等人，2018年)、溶血素BL (Jessberger等人，2019年)和金黄色葡萄球菌肠毒素(SEs) (Breckinridge & Bergdoll，1971年)。在这些毒素中，SEs是一个超过10种类型的超家族(Hennekinne等人，2012)，是金黄色葡萄球菌在食品安全中的主要毒力因子。它们的潜伏期很短，毒素进入胃肠道后几分钟到几小时内引发一系列症状，如恶心、呕吐、腹痛、痉挛、腹泻，甚至死亡(Hennekinne等人，2012年)。目前，可获得的数据显示，SEs仍然是世界性的公共卫生问题。从2003年到2017年，中国报告了10174起污染引起的食源性疾病爆发，占细菌引起的疾病的10.2%(李等，2020)。如图1a所示，根据疾病控制和预防中心的统计数据，从1998年到2020年，美国共有12139例由金黄色葡萄球菌引起的疾病(CDC，2021)。SEs可以通过许多途径进入人类消费的食品。各种食物样本可以成为金黄色葡萄球菌的良好生长培养基，包括水果、蔬菜、牛奶、肉类等(Hennekinne等人，2012；Necidová等人，2022年)。动物携带或感染金黄色葡萄球菌是污染生肉和牛奶等食品的最常见方式之一(Ren et al .，2020)。例如，金黄色葡萄球菌是牛、绵羊、山羊和奶牛场中乳腺炎的常见原因(Campos等人，2022；Merz等人，2016)。此外，一项研究发现，在90个分离株中，超过90%的分离株具有产生肠毒素的能力，其中70.1%的分离株能够产生两种类型的肠毒素(王等，2018)。感染大部分人口和食品加工者的金黄色葡萄球菌是SEs污染的主要原因之一(Wattinger等人，2012年)。金黄色葡萄球菌很容易在皮肤和各种粘膜表面定居，并永久定居在高达30-40%的人群的鼻腔中(Kock等人，2016年)，其中鼻腔携带菌株中SE基因的频率约为82-93%(Becker等人，2003年；LawrynowiczPaciorek等人，2007年)。产肠毒素性金黄色葡萄球菌携带者是通过接触、呼吸道咳嗽、或打喷嚏造成污染的主要来源，因此产生了金黄色葡萄球菌食物中毒的持续风险。由于这些原因，快速和准确地早期检测食品样品中的SEs是食品工业和监管机构弥补巨大健康和经济损失的最大要求。迄今为止，已有几篇关于生物样品中SEs检测方法的综述。吴等(2016)简要总结了2016年以前SEs的检测方法，包括生物检测、基因检测、质谱(MS)和基于抗体和核酸适配体的生物传感器。Abril等(2020)描述的SEs检测方法仅限于乳制品行业和乳腺炎，包括生物学检测、遗传学检测、免疫学检测等。Rajkovic等人(2020)最近报告了对包括金黄色葡萄球菌在内的革兰氏阳性菌引起的食源性疾病的检测。然而，该综述仅介绍了涉及SEs检测的部分生物检测、免疫检测、质谱检测和基因检测，信息有限。随着检测技术的创新和进步，在过去十年中，检测SEs的报告数量显著增加(图1b)。由于食品样品中的SEs对食品安全和人类健康造成了极大的危害，因此有必要对SEs进行系统而全面的研究。在此，我们对过去20年间食品样品中SEs的检测进行了重点综述。研究了SEs检测方法的现状，特别关注经典和新兴方法，即生物检测、基因检测、质谱检测和具有光学、电化学和压电换能器的生物传感器，重点放在它们在实际应用中的优缺点。最后，本文讨论了目前面临的挑战，并对新的检测方法的发展前景进行了展望。![]()
图1（a）1998年至2020年美国由食源性病原体金黄色葡萄球菌引起的疾病数量（FDA 2021）。（b）2000-2021年期间SES和检测方法的出版物数量（至2021年12月）。绿线代表“SES，检测”与“SES”的出版物数量的比例。“ 数据是通过在Web of Science（2023）中搜索“葡萄球菌肠毒素”和“金黄色葡萄球菌肠毒素（Staphylococcus enterotoxins）”作为黄色栏，或者“葡萄球菌肠毒素”、“金黄色葡萄球菌肠毒素”和“检测”作为蓝色栏获得的。
2 SEs的特征与监管体系
SEs由大约168-261个氨基酸组成，分子量为19-29 kDa。SEs的一级肽序列和三维结构之间存在显著程度的相似性(Swaminathanetal ,1995)。根据国际葡萄球菌超抗原命名委员会制定的规则，在灵长类动物模型中通过口服途径证明具有催吐活性的被命名为SEs (Thomas等人，2007)。值得注意的是，仅20-100纳克的少量SEs即会引起食源性疾病的爆发(Asao等人，2003年)。此外，SEs具有显著的稳定性，包括热稳定性(在100℃处理6小时后仍保持活性)和酶水解稳定性(Hu等人，2017年)，如胃蛋白酶和胰蛋白酶。因此，即使经过加热处理和摄入后胃肠道消化，它们仍保持活性(Dinges等人，2000；Ostyn等人，2011年)。SEA、SEB、SEC、SED和SEE等经典SEs造成了∼95%葡萄球菌性食物中毒 (王、刘等人，2016)。SEA是最常见的SEs，在包括美国、英国、日本、韩国、法国和巴西在内的许多国家中约引起80%葡萄球菌性食物中毒(Asao等人，2003；Casmanetal。,1967;Wieneke等人。, 1993).SEA的致病阈值低于0.5纳克/ml(Evenson等人，1988年)。非经典SEs包括SEG、SEI、SER、SES、SET等(胡& Nakane，2014)。SEs的呕吐反射的靶标可能位于腹部内脏，此处可能存在SEs的细胞受体。然而，缺乏确定的受体增加了食物中毒发病机制中早期事件的不确定性(Hu & Nakane，2014)。由于SEs具有高毒性、稳定性和低致病剂量，许多国家和地区制定了严格的检测标准以确保食品安全。由于SEs主要由凝固酶阳性葡萄球菌(CPS)产生(Bianchi等人，2013年；Hennekinne等人，2012)，许多国家、地区制定了食品中CPS计数和SEs限量的食品安全标准(Tallent & Sheehan，2018)。欧盟在2005年欧盟委员会法规中创建了两套标准，即食品安全标准和加工卫生标准。根据食品安全标准，每25克食品样品，如奶酪、奶粉和乳清粉，凝固酶检测结果必须呈阴性。与此同时，为包括牛奶和奶制品以及水产品在内的几类食品制定了一个加工卫生标准。如表1所示，不同种类的乳制品有四个独立的标准。根据标准，当CPS计数超过标准中规定的数量时，必须进行SEs检测。美国美国食品药品监督管理局(FDA)规定了金黄色葡萄球菌的检测标准(Tallent & Sheehan，2018年)。一般来说，含有100000 CFU/mL(g)或以上的金黄色葡萄球菌的食品样品将被进一步检测SEs。此外，根据联邦食品、药品和化妆品法案(FFDCA)第402(a) (1)节规定，在食品中发现的任何SEs都是非法的。中国法规GB 29921-2021要求检测食品中的金黄色葡萄球菌。在诸如奶粉、配方奶粉、用于特殊膳食用途的食品(例如婴儿配方奶粉、用于较大婴儿和幼儿的配方食品)等食品中，金黄色葡萄球菌的最大检出量不超过1000 CFU/mL(g)。对于某些食品，如巴氏杀菌奶、改良奶和发酵奶，每25 mL(g)样品中的金黄色葡萄球菌检测必须呈阴性。SEs对人类健康和食品安全有着巨大威胁，对食品中SEs进行高灵敏、快速、准确的检测具有极其重要的意义。表1一些国家和组织目前的SEs法律限制。
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3 生物检测
生物检测是一种检验毒素对活生物体影响的试验。这是最早用于SEs检测的方法之一。生物检测包括动物检测和细胞培养检测，它们基于可疑食物的提取物在动物身上引发症状的能力，如呕吐、腹泻和/或细胞培养中的超抗原作用。生物检测提供了类似毒素对人类的影响的可能性，更重要的是，它可以区分具有威胁的SEs的生物活性形式和没有威胁的非活性形式。3.1 动物检测
一些动物（包括猫、猴子、猪、麝鼠等）已经通过皮肤试验或管饲法实验性地用于SEs的检测。1936年初，Dolman & Wilson引入了检测葡萄球菌滤液中与食物中毒有关的肠毒素的猫试验(Thatcher & Robinson，1962)。豚鼠皮肤试验也被用于SEs的检测，对SEB的灵敏度可达0.1到1.0 pg(Scheuber等，1983)。1988年，Bergdoll (1988)发表了SEs检测的金标准——猴子喂食检测。SEs (SEA、SEB、SEC和SEE)使恒河猴呕吐的半数有效量(ED50)约为每只猴子5-10 μg，SED ED50为10-20μg。猪比猴子更能抵抗SEA的催吐作用。据报道，断奶仔猪体内SEA的半数致死剂量在40至50微克之间(Taylor等人，1982年)。此外，Hu等人(1999年)研究了SEA对麝鼠的催吐作用，发现经口半数致死剂量为32 μg /kg，腹腔给药的半数致死剂量为3 μg /kg。值得注意的是，并不是所有的动物都对SEs易感。小鼠、大鼠、兔和猫对SEs不太敏感，或者它们对SEs的反应与非人灵长类动物和家养麝鼠没有特别的区别(Bergdoll，1988；胡特尔。,2003).脑干神经系统成分的缺失很可能导致啮齿目动物无法呕吐(Horn等人，2013年)。动物检测可以识别、测定SEs的存在，提供关于它们的毒性、生物完整性和相关剂量/反应的信息。不幸的是，这种方法受限于成本高，实验动物供应短缺，伦理问题和个体差异。此外，该方法不能准确定量、再现性差、检测时间长、灵敏度低不能满足快速、准确和灵敏地检测食品样品中SEs的要求。3.2细胞培养检测
除胃肠毒性，SEs还可作为超抗原绕过抗原呈递细胞的正常加工，形成T细胞受体(TCR)、II类主要组织相容性复合体(MHC)和SEs三元复合物。这个过程刺激t细胞增殖、分化和细胞因子分泌。通过Alamar蓝的颜色变化和[3H]胸苷的摄取来测量金黄色葡萄球菌增殖过程中的T细胞代谢和DNA合成，可以在2-5天内在牛奶、土豆沙拉、蘑菇和热狗中检测到浓度为1 ng/mL的SEs(Rasooly等人，1997年)。在活化的T细胞反应元件的核因子的调节下表达报告荧光素酶的基因工程T细胞Jurkat细胞系与淋巴母细胞样B细胞系Raji联合用于SEs检测(Rasooly等人，2016；Rasooly等人，2017年)。因此，可以通过检测荧光素酶产生的信号来测定SEs。对于SED和SEE，这种定量生物发光检测的检测限(LOD)在5小时内分别为100 ng/mL和1 fg/mL。随后，该团队基于相同的测量原理，将生物发光检测与半导体电荷耦合器件(CCD)相机设备相结合，用于SEs检测(Rasooly等人，2018年)(图2a)。他们利用低成本的冷却CCD相机进行拍摄，结合这种基于工程细胞的检测技术对SED进行定量测量，实现了1 ng/mL的较低LOD。然而，上述细胞培养检测策略都不能识别特定的SEs。由于不同的SEs结合不同T细胞亚群的不同TCR(Thomas等人，2009)，该特征可用于细胞培养检测中SEs的特异性测定。2019年，Rasooly等人(2019年)开发了一种特异性SEA检测方法，该方法利用CCRF-CEM T细胞在其表面表达的能与SEA特异性结合的Vβ9蛋白，可在2小时内检测到浓度范围为0.1pg/mL至1000ng/mL的SEA，且未显示出与SEB、SED或SEE的交叉反应性(CR)。该团队随后开发了一种新的细胞培养检测方法，该方法基于T细胞表面TCR的SEB识别特异性Vβ5.3蛋白，SEB结合该蛋白导致T细胞剂量依赖性分泌白介素-2。因此，SEB可以用10pg/mL的LOD进行定量，而与SEA、SED和SEE没有CR(raso oly等人，2021年)。SEs除了具有超抗原活性外，还能诱导细胞毒性T淋巴细胞裂解携带SEs的细胞，称为SEs依赖性细胞毒性。Hawryluk与Hirshfield (2002)利用这一现象建立了一种SEA检测方法。用CytoTox 96细胞裂解检测试剂盒比色测定靶细胞死亡，该方法显示出对低至120 pM SEA的强响应。总之，细胞培养检测是灵敏的，并允许表征生物活性SEs。然而，细胞培养法对食品样品中SEs的检测存在一定的局限性。如耗时、难以定量，对前处理有较高要求（如去除细菌），难以满足高通量检测的需要等。
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图2 SE的生物检测和基因检测示例。(a) SEE的生物检测（Rasooly等人，2018年）。将SEE与B细胞系（Raji）细胞和基因工程T细胞系（Jurkat）报告细胞在黑色96孔板中孵育。Raji细胞通过MHC II类分子将SEE呈现给Jurkat报告细胞的TCR，该报告细胞包含荧光素酶基因。SEE的测量可以完成由一个CCD摄像机记录从荧光素酶催化荧光素反应的光子强度。(b) SEB的基因检测（Mondal等人，2018年）。在PCR扩增过程中，以SEB的靶DNA为模板，将DNA酶序列整合到双链PCR产物中。当Hemin存在时，PCR产物生成G-四链体/Hemin复合物，该复合物在H2O2存在下催化氧化TMB生成蓝色溶液，可通过目视或分光光度法进行定性和定量检测。
4 基因检测
近年来，基因检测凭借高灵敏度、高通量、对样品纯度要求低等优点，被广泛用于SEs的检测(赵等，2016)。SEs的基因检测主要涉及三种方法：核酸杂交、多聚酶链反应(PCR)或相关的核酸扩增技术以及全基因组测序(WGS)。其中，核酸杂交作为最早的基因检测之一，由于耗时、复杂、有定量限制且有假阳性的可能，现在很少用于分析SEs基因。从金黄色葡萄球菌菌株中提取的基因被变性并暴露于基因特异性核苷酸探针，然后进行杂交和测量。早在1990年，Neill等人(1990)合成了用放射性元素32P标记的不同探针，并开发了一种核酸杂交分析，靶向编码SEA、SEB和SEC1的金黄色葡萄球菌菌株的基因。结果显示，除了SEC1 (64%)之外，核酸杂交法和酶联免疫吸附试验(ELISA)之间具有极好的相关性(≥93%)。与核酸杂交检测相比，PCR相关检测具有明显的优势，包括：快速、灵敏度高和样品用量小。使用寡核苷酸作为引物，PCR相关的检测可在几个小时内产生大约1000亿个DNA拷贝。Wilson等(1991)描述了一种基于两套引物的巢式PCR检测，可在8小时内检测脱脂奶粉中SEB的SEC基因和SEB基因，LOD约为105 CFU/ml。然而，金黄色葡萄球菌菌株可以产生不止一种的外毒素(Dinges等人，2000)。因此，需要更有效的，尤其是同时检测所有外毒素基因的策略。目前已有一些多重PCR (mPCR)方法用于检测和区分食品中的多种产肠毒素性金黄色葡萄球菌。Nagaraj等人(2014年)在补充了丙酮酸钠的改良甘露醇盐肉汤中选择性富集金黄色葡萄球菌后，开发了一种针对五种产肠毒素基因(SEA、SEB、SEC、SEG和SEI)的mPCR检测。该方法能够在生鸡肉、蛋糕和米饭中106 CFU/ml的细菌量下检测所有的目标基因。然而，包括巢式PCR、mPCR等的常规PCR方法需要在扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，费时且费力。后来，用于同时检测多种肠毒素的基因(SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI和SEJ)的实时PCR (RT-PCR)被开发出,该方法可以直接观察结果，无需进行琼脂糖凝胶电泳(Letertre等人，2003)。该RT-PCR检测的LOD估计为SEA、SEB、SEC、SEJ的每个PCR 5个拷贝，SEE的每个PCR 25个拷贝，SEH的每个PCR 250个拷贝，SED和SEG的每个PCR 1300个拷贝，SEI的每个PCR 2500个拷贝。RT-PCR可以快速有效地区分产肠毒素性和非产肠毒素性的金黄色葡萄球菌，4h内的Tm值在75.55±0.5到78.95±0.5oC之间。与常规PCR相比，RT-PCR实现了从定性到定量的飞跃，并且可以快速筛查大量样品。然而，RT-PCR需要昂贵的荧光探针和用于读取结果的仪器，这两者只存在于专业实验室。上述缺点鼓励研究人员创造更经济、快速和简单的检测方法来鉴定PCR结果。脱氧核酶作为荧光探针的替代物可以模拟过氧化物酶来鉴定PCR产物。蒙达尔等人(2018年)设计了一种基于脱氧核酶的比色基因检测方法，用于检测食品和临床样本中的SEB(图2b)。该检测使用DNAzyme互补序列整合正向引物，在免疫捕获金黄色葡萄球菌后扩增SEB基因。含有SEB基因的金黄色葡萄球菌的在2-3h内的可视LOD约为100 CFU/ml。环介导等温扩增(LAMP)具有操作简单、检测时间短、灵敏度高等优点，更适用于临床检测，可作为上述PCR的替代方法。反应在60-65℃的恒温下进行，结果可在60分钟内读取。2007年，Goto等人(2007)开发了针对SEA、SEB、SEC和SED基因的LAMP检测。以焦磷酸镁沉淀法读取结果，该方法可以在60分钟内检出920 CFU/ml的SEs。然而，早期LAMP检测的精度可能受沉淀物形式的影响。Srimongkol等人(2020年)设计了一种基于金纳米粒子(AuNPs)探针或苯乙烯基染料(STR)的新型LAMP，用于快速、灵敏、特异性和可视化检测SEA LAMP扩增子。基于AuNPs和基于STR的LAMP可以分别检测低至3.2个SEA拷贝和7.2个SEA拷贝。其中，基于AuNP的LAMP可以在27分钟内检测到低至10 CFU/g的猪肉和牛奶。通过分析80份猪肉和牛奶样本，LAMP-AuNP显示出100%的灵敏度、97-100%的特异性和97.5-100%的准确性。规则间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)和相关的核酸酶(Cas)系统的发现提高了基因检测的快速性，当与LAMP整合时可进行即时检测。在使用LAMP进行预扩增后，Habimana等人(2023)引入了基于CRISPR/Cas12a的多模式通用报告基因，用于SEA的现场检测。该方法利用双模式报告系统，结合实时荧光计、管内荧光和侧流试纸读数，能够在牛奶样品中实现10 CFU/ml的LOD。由于SEs的DNA扩增子具有相似的长度，mPCR(包括LAMP)难以区分扩增产物。Yin等人开发了用于现场同时检测SEA和SEB的多重LAMP检测与测流分析(m-LAMP/LFA)相结合的检测方法(Yin等人，2016年)。SEA和SEB的生物素化扩增子分别用地高辛配基或异硫氰酸荧光素(FITC)标记。使用以中性链亲和素标记的AuNPs (NA-AuNPs)作为检测试剂的多重LFA来识别不同的扩增子。LFA的检测线1、检测线2和质控线分别涂有抗地高辛抗体、抗FITC抗体和生物素化牛白蛋白。该方法可以在8小时内检出牛奶、苹果汁、奶酪和大米中低至1 CFU/ml的金黄色葡萄球菌。确切地说，基于PCR的检测易被污染，且可能出现假阳性。同时，当使用不适当靶向保守区域的引物对时，基于PCR的SE基因谱检测经常出现遗漏。因此，现有的基于PCR的方法不能检测所有的SEs，尤其是不太流行的或新出现的肠毒素。相比之下，全基因组测序（WGS）通过分析了整个细菌基因组，可对分离株进行彻底的基因型表征。最近，Nouws等使用WGS调查金黄色葡萄球菌污染情况。(Nouws等人，2021年)。不同于基于PCR的SE基因检测，WGS可以得到SE基因的完整图谱。此外，这项研究也向公众提供了一个具有定制数据库和应用参数的在线用户友好数据共享界面。该研究表明，WGS是一种可靠的替代和/或额外的爆发调查技术。此外，WGS可用于鉴定新的SEs。Suzuki等人(2020年)利用WGS发现了一个名为SE02的新SE基因，该基因属于SEB族，并被证明具有超抗原和致吐活性。应考虑到基于毒素基因的诊断可能导致假阳性和假阴性结果。假阳性结果由存在于细菌污染的样品中但未转录成RNA的基因引起。因此，为了评估从食物中分离的菌株的潜在毒性，研究人员们开发了提取可获得的细菌RNA的有效方法(Derzelle等人，2009；Duquenne等人，2010年)。虽然这些方法证明了这些基因可能被转录，但它们并不能表明这些菌株是否能够在食物中产生可检测或有毒水平的肠毒素。另一方面，由于加热裂解细菌后肠毒素仍存在，常出现假阴性结果。此外，假阳性和假阴性的可能性分别由于SE(假)基因和SE变体的引物结合位点突变之间的高度序列相似性而增加。此外，基于基因的检测需要专业的操作者，并且检测前的细菌富集过程使该方法非常耗时。5 MS检测
用于蛋白质和肽的MS检测已经快速发展，并且越来越多地用于识别SEs。MS技术根据每种生物分析物固有的质荷比(m/z)为其提供了独特的生化特征，MS通常与毛细管电泳、气相色谱和液相色谱(LC)等各种分离技术结合使用，以改善同量异位素和异构体的分离并减少离子抑制。两种软电离技术，即电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸/电离(MALDI)的发展，使得对大分子如毒素的分析成为可能，这些大分子通常是蛋白质或肽，而没有广泛的断裂(Rajkovic等人，2020)。质量分析仪是MS技术的关键，包括四极杆、飞行时间(TOF)、离子阱和傅立叶变换离子回旋共振。理论上，基于MS的高通量检测可以检测复杂样品中的任何SE，由于MS提供了高度灵敏的鉴定、结构分析和定量的可能性，其被广泛地应用于毒素研究。几乎所有的蛋白质MS检测都分为三个阶段:(1)从生物来源中分离蛋白质样品，并进行消化、分级分离。在最终的蛋白质样品被消化后，对所得的肽样品被进一步分级分离。(2)进行完整蛋白质或肽的定性、定量MS检测。(3)利用软件工具分析产生的大量数据集，以确定氨基酸序列，如果需要，还可对蛋白样品进行定量。检测SEs的MS分析方法的每一步对于获得准确的结果都至关重要。由于在分析前需要对样品进行提取和/或净化以消除基质效应，该过程通常会占用整个质谱分析时间的61%(Wang等人，2017年)。用于SEs检测的基质可以含有多种蛋白质、脂质和影响定量结果的其他分子。从食品样品中提取SEs的过程通常涉及一系列技术，包括有机溶剂提取、固相提取、过滤和免疫亲和富集。例如，牛奶样品具有高脂肪和蛋白质含量，中提取SEs的过程常使用酸和有机溶剂对牛奶进行处理，以使牛奶蛋白质变性(Sospedra，Soler等人，2012年)，最常用的两种有机溶剂是二氯甲烷和三氯乙酸(Koike等人，2019年；Sospedra等人，2011年；索斯佩德拉，索勒塔尔，2012)。Andjelkovic等(2016年)描述了一种基于固相萃取的LC–ESI–MS/MS，用于检测和定量牛奶和缓冲液中的SEA和SEB。该方法对SEA和SEB的LOD分别约为8和4 ng/g。过滤也是食品样品或生物样品中SEs的常用提取工艺(Bao等，2012；Callaghan等人，2006年；Gilquin等人，2017；Muratovic等人，2015；Sospedra，Marin等人，2012年)。Muratovic等人(2015年)结合pH控制沉淀和过滤分级，去除多余的蛋白质。对于SEA和SEB，牛奶中的定量限(LOQ)和虾中的检出限(LOD)均为2.5ng/g。常使用凝胶或长时间的免疫亲和纯化，获得用于后续的高灵敏度检测高纯度样品(Alam等人，2017年；Dupre等人，2015年；Dupuis等人，2008年；列斐伏尔等人，2021；Sospedra等人，2011年)。最近，一种利用免疫亲和富集的LC-MS/MS成功用于同时定量测定八种最常见的SEs，包括A-I型及其变体(Lefebvre等人，2021年)(图3)。该方法可以直接定量食品样品中痕量水平的SEs，乳制品中的LOQ低至0.1ng/g。同时定量八种SEs能在食物中毒爆发在实验室中确定有毒样品。蛋白质绝对定量(AQUA)策略用于蛋白质及其修饰状态的绝对定量，该策略利用结合了稳定同位素的合成肽作为理想的内标，来模拟SEs检测过程中蛋白水解形成的天然肽(Andjelkovic等人，2016；Koike等人，2019；Muratovic等人，2015年)。用于SEs检测的多反应监测分析AQUA策略，是最有效的定量方法之一。最近，有人报告了一种基于AQUA的质谱检测方法，用于识别和定量牛奶和虾样品中的SEA和SEB，该方法利用每种肠毒素中的胰蛋白酶肽和相关的C13标记合成内标肽作为目标分析物(Muratovic等人，2015年)。虽然该方法可定量低至ng/g水平的SEA和SEB，但食品样品中的回收率低于10%,牛奶和虾的相对重复性标准偏差(CV)分别为8-30%和5-41%。Koike等人(2019年)使用同位素标记的SEA肽作为内标，开发了一种基于AQUA的LC–MS/MS检测。LOQ为10 ng/g时，该检测的CV和准确度分别提高了13-14%和80-82%。在基于AQUA的检测中可以观察到目标蛋白的定量偏差，这主要是由蛋白水解消化效率或分析物纯化回收率的显著变化造成的。利用体外合成的同位素标记的全长蛋白质，已经提出了用于标准蛋白溶液(PSAQ)的MS检测程序来克服这种可变性的影响(Dupre等人，2015；Dupuis等人，2008年；Gilquin等人，2017)。在进行样品处理之前，在复杂基质中加入SEs的同位素标记蛋白类似物，避免内标和目标蛋白之间的消化产量差异。Dupre等人(2015年)开发了一种基于PSAQ的新型多重免疫液相色谱-质谱/质谱检测，用于同时和特异性定量分析人类生物体液和食品样品中包括SEB的三种潜在生物战剂。因此，在PBS缓冲液和加标样品中，以0.5和1 ng/mL的浓度测定准确度为80-120%的LOQ。使用2和15 ng/mL的对照样品成功验证了SEB的重复性，CV低于9%。与要求MS AQUA使用肽标准品AQUA策略相反，PSAQ策略允许使用全长蛋白质进行高度准确的定量。同时，由于合成AQUA蛋白的成本较高，这种策略对需要快速、实惠和简单程序来处理常规食品分析的实验室来说不太有吸引力。总之，基于MS的检测对于SEs鉴定十分可靠。然而，在MS检测之前进行高效的样品制备对于抵消复杂环境或生物样品多样性中的离子抑制/基质效应至关重要。因此，基于抗体的亲和富集利用强大的纯化和浓缩能力可以实现高度灵敏SEs的MS检测。MS检测中采用的大多数提取程序耗时且成本高，因此建议对基于MS的SEs鉴定和表征进行简化的样品预处理。LCMS/MS目前是SEs的主要MS检测方法，而MALDI–TOF MS作为一种新兴的检测方法，已经用于SEs的检测(Tonacini等人，2019)，然而该方法似乎不适合定量分析，这点仍需改进。因为目前MS检测的灵敏度大多在ng/g水平，不如生物检测和生物传感器，所以仍然需要开发更灵敏的MS检测。
图3 SE的MS检测的示例（Lefebvre等人，2021）。食品样品经初步酸沉淀后，以可溶状态保留的SE被捕获并从酸上清液中免疫富集，然后通过透析浓缩，随后通过洗涤。捕获的SE被胰蛋白酶消化成SE肽，然后提交LC-MS/MS自下而上的SE分析。
6 生物传感器
生物传感器是快速检测食品样品中SEs的一种简单而廉价的工具。根据国际纯粹与应用化学联合会的定义，生物传感器是“一种独立的集成设备，能够使用与传感器直接空间接触的识别元件提供特定的定量或半定量分析信息”(Kirsch等人，2013年)。理论上，任何可以识别SEs的分子或组件都可以被定义为SEs的识别元件。检测SEs最常用的识别元件是抗体，其次是适配体、分子印迹聚合物(MIPs)和TCR。作为通过识别元件将SEs的结合信号转换成可量化响应的分析装置，产生主要包括光学信号、电化学信号和压电信号的用户友好的显示。下文将首先介绍SEs的识别元件，然后分别概述SEs检测中的光学生物传感器、电化学生物传感器和压电生物传感器。6.1 SEs 传感器使用的识别原件
6.1.1 抗体
抗体是免疫系统产生的一种糖蛋白，能够以高特异性和亲和力识别抗原(Crivianu-Gaita & Thompson，2015)。最常用的检测抗体是来源于小鼠和兔的免疫球蛋白G(IgG)(Dou等，2022)。标准IgG包含四条多肽链，即两条相同的重链(各50 kDa)和两条相同的轻链(各25 kDa)。重链包含一个可变区(VH)和三个恒定区(CH1，CH2，CH3 ),而轻链由一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)组成。轻链和重链的可变区(VL和VH)结合形成负责抗原识别的抗原结合区。目前用于检测SEs的抗体主要有兔多克隆抗体(pAb)和鼠单克隆抗体(mAb)。由于pAb能识别更广泛的表位，通常比mAb具有更高的亲和力。Clarisse等人(2013)比较和分析了各种抗SEA抗体，包括pAb、抗肽pAb和mAb，用于夹心ELISA的捕获和/或检测步骤。他们发现pAbs与mAbs或抗肽pAbs相比具有更高的亲和力。在这种情况下，pAb可以定量SEA，LOD为32 pg/mL（缓冲液）、64 pg/mL（牛奶）。然而，pAb与其他SEs和结构相关的靶标的高度交叉反应会影响生物传感器的特异性。Leeetal.(1980)发现SEB诱导的pAb可以在凝胶扩散平板和放射免疫测定中与SEB、SEC1和SEC2反应。由于其高度同一性、同质性和稳定性，单克隆抗体理论上比pAb有更高的的再现性。Kuang等(2013)建立了一种基于单克隆抗体的夹心ELISA 检测SEA。在最佳条件下，该方法的LOD为28 pg/mL，SEB、SEC、SED和SEE的CRs可忽略不计。目前，包括商业试剂盒在内的免疫分析主要使用来自小鼠、兔和山羊的抗体。然而，这些抗体的特异性受葡萄球菌蛋白A (SpA)的影响，该蛋白分泌自大多数金黄色葡萄球菌(Goding，1978)。SpA可以与可结晶片段(Fc)结合，并且来自几种动物物种如小鼠和兔的IgG的一小部分Fab片段可能产生假阳性结果。可通过用胃蛋白酶处理抗体来去除IgG的Fc解决这类问题。然而，这一过程很耗时，并总是导致免疫分析灵敏度的损失(Freed等，1982)。随着抗体工程的发展，更小的抗体片段被开发出，如由VL、VH、CL、CH1和仅含有VH和VL结构域的单链Fv (scFv)组成的抗原结合片段(Fab)。其中，scFv作为Fv片段的修饰类型，已被应用于检测SEs (He et al .，2015；Singh等人，2010年)。尽管scFv可以避免SpA的非特异性结合，但由于实践中表达产量低和稳定性差，它们的应用已被证明是有问题的(Glockshuber等，1990)。来自鸡的IgY抗体和在骆驼或鲨鱼中发现的重链抗体(HcAbs)已被证明可以减轻SpA引起的免疫测定中的交叉干扰反应。IgY不与SpA结合，可以避免SEs检测过程中的非特异性结合。此外，IgY在生产力和动物福利方面具有优势。因此，IgY可以作为IgG的有力替代物来构建用于SEs检测的免疫测定法。Mizutani等人(2012年)对用于检测SEA的捕获抗体-检测抗体的几种组合进行了比较。当抗SEA IgG用作捕获和检测抗体(IgG-IgG ELISA)时，浓度为0.01 ng/mL的SpA显著提高了空白孔的吸光度值。然而，当抗SEA IgY用作捕获抗体(IgY–IgG ELISA)时，1000 ng/mL的SpA不影响空白孔的吸光度值，显示SEA的LOD < 0.25 ng/mL。Jin等人(2013年)使用抗SEs IgY用作捕获抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗SEs IgY作为ELISA中的检测抗体，为牛奶中的SEA提供了2 ng/ml的LOD，且对SpA无CRs。然而，应该注意的是，基于IgY的免疫分析的检测灵敏度通常低于基于其他抗体的免疫分析的检测灵敏度(表2)，这不能满足检测要求。HcAbs重链可变区也称为纳米抗体(Nbs)，是最小的重组基因工程抗体(∼15 kDa) (Muyldermans，2021)。与其他抗体相比，Nbs表现出如下几个突出的特性(Muyldermans，2021): (1)有长且突出的CDR3，可以到达隐藏和凹陷的表位。(2)具有独特的物理和化学特性，如对温度、蛋白酶、溶剂和pH的高耐受性。(3)易于大量表达并具有遗传可操作性。Nbs的这些特性为开发用于SEs检测的基于Nbs的免疫分析提供了多种可能性。Ji等(2020)开发了一种夹心ELISA，使用Nbs作为捕获抗体，噬菌体展示的Nbs作为检测抗体，用于检测SEs。在最佳条件下，该方法对定量范围宽至1到512 ng/mL，LOD为0.3 ng/mL，并且在SpA为10 μg/mL时未出现CR。尽管抗体作为SEs检测中的识别元件具有包括高特异性和灵敏度的许多优点，其也具有显著的缺点，如生产过程耗时、在高温、极端pH下易变性以及与抗体制备动物实验相关的伦理问题。表2 2002-2022年报道的检测食品中SEs的光学生物传感器总结![]()
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6.1.2适配体
适配体包括核酸适配体和肽适配体，其中核酸适配体最常被提及。在上下文中除额外说明“适配体”指核酸适配体。适配体是一类可用作亲和识别元件的特殊功能性单链核酸，自1990年报道以来，它们被认为是最有前途的抗体替代品(Tuerk & Gold，1990)。核酸适配体是通过指数富集(SELEX)技术或修饰的对应物在体外通过配体的系统进化而产生的。适配体与其他识别元件相比，具有许多引人注目的性质。首先，它们是单链寡核苷酸，折叠成独特的三级结构用于特异性识别；因此，可以方便和可控地调节适配体亲和力。其次，SELEX的灵活性使得能够产生用于不同SEs检测的不同适配体。第三，适配体是化学合成的，并在特定位点用功能部分进行修饰，使得各种生物传感器得以发展。迄今为止，一些适配体已经通过改良的SELEX进行SEs筛选。Bruno和Kiel (2002)首先发现了SEB的单链DNA (ssDNA)适配体，但是没有公开该适配体的序列。随后Purschke等人(2003)描述了SEB的镜像SELEX。选择对应于SEB 89113位的25聚体肽序列作为适配体筛选的靶，其解离常数(Kd)约为420 nM。FluMag-SELEX是一种改良SELEX，将DNA的荧光标记与磁性分离相结合，用于选择SEs的ssDNA适配体。经过12轮筛选过程后，产生高亲和力和特异性结合SEA的适配体，其Kd值低至48.57 nM (Huang et al .，2014)。另一种改进的SELEX涉及将适配体固定在溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B亲和层析凝胶上，以分离适配体(Ch等人，2016年)。Ch等人(2016年)发现了一组对SEB具有良好特异性和优异亲和力的适配体，用根据竞争性ELASA测得其Kd为0.02 nM，在人血清中的LOD为50 ng/mL。为了进一步提高适配体对SEs的特异性，Sedighian等建立了一种称为交错靶SELEX的新的改良方法，以识别针对具有高序列相似性的多种蛋白质的特异性适配体(Sedighian等人，2018)。这种方法，在用SEE对SEA进行计算机分析后，用SEA的特定肽进行交错靶SELEX。得到的适配体的Kd值为7.44 nM，与其他SEs无CRs。肽适配体是由20个随机氨基酸组成的短肽，其作为生物传感器中的新型识别元件越来越受欢迎(Mascini等人，2012)。从技术上讲，肽核酸适配体的选择与核酸适配体的筛选有很大不同。但是肽适配体技术的基本概念如文库、选择和扩增，与核酸适配体类似。组合技术被用来产生多样性和建立肽适配体候选池。尽管目前肽在生物传感器中的使用有限，但一些研究利用噬菌体对完整肽适配体进行展示，而游离肽仅在少数SEs检测研究中用作识别元件(Dudak & Boyaci，2014；Temur等人，2012年)。由于适配体、肽适配体即使在变性后也可以在体外重新获得它们的分析物结合能力，并且它们的亲和力可以通过多轮SELEX和counter-SELEX来提高与抗体相比，与抗体相比，适配体对动物更友好、更稳定、更具特异性。然而，为得到优秀的适配体往往需要花费数万美元，这在很大程度上要归咎于SELEX长达数周乃至数月的耗时(Crivianu-Gaita & Thompson，2016)。相比抗体，能用于SEs检测的适配体的总数仍然较少。此外，适配体的高亲和力和特异性在某些情况下（如：高盐环境）可能会改变(Zhou等，2010)。6.1.3 分子印记聚合物
SEs的另一个重要识别元素是MIPs，当目标模板存在于聚合物中时，可通过生成分子识别位点合成MIPs(Ahmad等人，2019)。聚合过程保留了功能单体和模板分子如SEs在空间排列中的互补连接。因此，MIPs能够选择性识别模板衍生位点中的靶标，并且可在某些情况下取代生物传感器中的抗体。相比蛋白质和核酸，分子印迹聚合物可以耐受非常苛刻的环境，如高温、高压、化学溶剂、极端pH值。另外，不使用动物降低了MIPs的合成成本。然而，由于分子印迹聚合物通常在疏水性有机溶剂中表现最佳(Gao等人，2020)，关于基于分子印迹聚合物检测SEs的研究报道有限。SEs中极性溶剂的存在可能会干扰印迹过程中预聚复合物的形成，并破坏分子印迹聚合物和SEs之间的相互作用，这可以解释在报道的研究中大多数分子印迹聚合物对SEs的识别亲和力较低。Yao等人(2014)通过反相悬浮聚合法合成了蛋白质印迹聚丙烯酰胺凝胶珠，用于低灵敏度的SEB检测，在生物传感器中实现了8.4mg/g的高检测限。Liu等(2012，2014)将有机硅烷与SEs蛋白结合在压电石英晶体(PQC)金电极表面，通过原位固定化，构建了一种二维分子印迹溶胶-凝胶薄膜涂层石英晶体微天平(QCM)，用于SEs的检测。该方法对SEA和SEB的检出限分别为7.97 μg/mL和2.25 ng/mL，灵敏度较低，不能满足SEs检测的要求。随后，Gupta等人(2010a)通过在裸金芯片上原位电聚合3-氨基苯基硼酸制备了一种MIPs，同时伴随有SEB，制备出报道中最灵敏的MIP膜之一，其LOD为0.05 fM，用于通过表面等离子体共振(SPR)进行SEB检测。结果表明，改进的分子印迹聚合物制备方法与SPR传感器相结合，可以大大提高基于分子印迹聚合物识别元件的生物传感器的灵敏度。6.1.4 T细胞受体
SEs可以通过特异性结合TCR-Vβ并形成TCR-Vβ–SE复合物来刺激T细胞，其中TCR-Vβ可以作为SEs检测的识别元件。然而，正常的TCR-Vβ–SE相互作用在微摩尔范围内亲和力相当低。Buonpane、Mattis等通过酵母展示在皮摩范围内工程化了几个具有高亲和力的TCR-vβ(Buonpane等人，2007；Mattis，2013).在此基础上，Tallent等人(2013年)利用与工程化肠毒素特异性TCR-Vβ偶联的微磁珠，开发了一种基于荧光的夹心生物传感器来检测SEB。该生物传感器的LOD为 0.1 ng/mL。这些工程化的TCR-Vβ类似于基于适配体的生物传感器，有可能实现更高的灵敏度，并减少动物的使用。6.2 用于SEs检测的传感器的信号转换器
在过去的几年中，对使用上述识别元件和各种信号转导途径的SEs检测用生物传感器的兴趣显著增长。本节讨论了许多用于检测SEs的生物传感器，这些传感器通过信号转换器进行分类，重点论述了光学生物传感器。6.2.1 光学生物传感器
光学生物传感器可将识别元件与其目标的相作转化为可量化的光信号。它们的简单、灵敏、稳定和快速的特点一直吸引着人们的兴趣。基于凝胶扩散和乳胶凝集的血清学试验是应用于SEs检测的早期光学方法。尽管基于乳胶凝集的商业检测试剂盒，oxoid SET反向被动乳胶凝集(RPLA) (Thermo Scientific)，仍用于定量检测食品样品中的SEs(Nia et al .，2016)，但由于繁琐的操作和需要训练有素的人员，很少有人继续研究它。随后，五种基于光信号转换系统的SEs生物传感器被开发出，包括:比色、荧光、化学发光、表面增强拉曼散射(SERS)和SPR生物传感器。在表2中总结并比较了2002年至2022年报道的用于检测SEs的光学生物传感器的检测性能。比色生物传感器
比色生物传感器的优点包括操作简单，不需要复杂的仪器和信号输出肉眼可见。酶促或化学过程带来的颜色变化，以及纳米粒子天然具有的光学性质，已经在比色生物传感器中得到大量研究。ELISA和LFA是用于SEs检测的两种最常见的比色生物传感器。ELISA是一种基于微孔板的技术，其中抗体/抗原在与未标记的抗原/抗体反应之前与酶连接，提供了高灵敏度、特异性和准确性。夹心ELISA通过捕获抗体和检测抗体来测量SEs，捕获抗体和检测抗体识别SEs的两个不重叠的抗原表位，是SEs检测的主要方法。酶与检测抗体(直接夹心ELISA)或二抗(间接夹心ELISA)偶联。Kuang等人(2013年)建立了一种检测SEA的直接夹心ELISA方法，其LOD为0.028 ng/ml。Nagaraj等人(2016年)开发了一种间接夹心ELISA，用于检测牛奶样本中的SEG，检出限为1ng/ml。同时，竞争性ELISA也用于检测食品样品中的SEs，样品中的SEs与固定的SEs竞争酶标(直接竞争性ELISA)或非酶标(间接竞争性ELISA)检测抗体。Liang等(2015)开发了一种间接竞争酶联免疫吸附试验，使用抗rSEAGepis pAbs作为检测抗体。rSEAGepis是一种串联排列的多表位肽，由来自SEA和SEG(SEA 156–163 SEA 166–173–SEA 211–218–SEG 37–46 SEG 120–127–SEG 141–149)的六个线性B细胞表位组成，用作免疫原来产生抗SEA和SEG的pAb。牛奶样品中SEA和SEG的间接竞争ELISA检测限均为0.52 ng/mL。据报道，加薪ELISA比竞争法更敏感(Clarisse等人，2013年；Gholamzad等人，2015年)。Gholamzad等人(2015)比较了用于SEB检测的两种ELISA检测的灵敏度，结果显示夹心法的灵敏度比使用相同单克隆抗体的竞争法的灵敏度高25倍。在夹心ELISA中，抗体对的选择会影响检测灵敏度。Singh等人(2022年)进行了一项比较研究，涉及两种夹心ELISA，采用兔pAb和小鼠mAb检测SEA。当使用小鼠单克隆抗体作为捕获抗体和兔pAb作为检测抗体时，他们声称获得了显著更高的灵敏度，在肉类样品中观察到的LOD为0.75 ng/mL。这可能是由于pAb上的多个互补位点放大了检测信号。然而，该研究没有给出兔pAb作为捕获抗体和小鼠mAb作为检测抗体时夹心ELISA的LOD。基于抗体-抗原结合的ELISA具有很高的灵敏度和准确性。然而，反应需要至少1 h，比较费时，且不适于现场快检。相比之下，LFA，也称免疫层析试验或试纸，利用纳米材料作为标签和抗体-抗原结合反应，可进行紧急的现场检测。它可以是用临界值进行定性检测；或光度读数器定量检测。LFA因其快速、低成本、高稳定性、用户友好和商业化潜力好的独特优势而受到极大关注。除了抗体，纳米材料标记是决定LFA检测SEs的灵敏度和定量能力的主要因素。目前，AuNPs由于其尺寸可控、稳定和成本低，是LFA最常使用的标签(Chun，2009)。Upadhyay和Nara (2018年)设计了一种夹心LFA，利用AuNPs标记的单克隆抗体进行SEA检测。在牛奶中达到1 μg/mL的可视LOD，由于的抗体亲和力差，该方法不能满足SEA检测的要求。相反，Rong-Hwa等人(2010年)开发了一种夹心LFA，使用aun PS–pAbs在大约5分钟内检测牛奶中的SEB，检测限为10纳克/ml。结果表明，针对SEs的单克隆抗体并不总是确保开发出具有相同标记的足够灵敏度的生物传感器。在某些情况下，具有更高灵敏度的生物传感器的pAbs可能是单克隆抗体的更合适的替代品。近年来，用于SEs检测的比色生物传感器的改进主要集中在灵敏度提高和多分析物检测两个方面。为提高ELISA检测SEs的灵敏度，研究人员引入了生物素-链霉亲和素系统。该系统利用链霉亲和素的四聚体构象，提高了检测灵敏度，可用于基于ELISA的SEs检测。在生物素偶联的检测抗体与包被在微孔板上的SEs结合后，形成的免疫复合物用链霉亲和素偶联的过氧化物酶处理。Sasaki等人(2005)制备了抗SEs单克隆抗体，并建立了用于检测SEA、SEB和SEC的抗生物素蛋白-生物素夹心ELISA。对于每种SE，这些抗生物素蛋白-生物素夹心ELISA的LOD在鼠血清、脱脂乳和原料乳中为0.78 ng/mL。Rudenko等（2018）基于一种新制备的单克隆抗体构建了一种用于检测SEH的亲和素-生物素夹心ELISA。在该检测中，血清和食品中SEH的LOD为0.2 ng/mL。通过生物素-链霉亲和素为基础的系统提高灵敏度的ELISA检测适用于SEs的临床灵敏度检测。此外，使用人工酶代替天然酶也是提高检测灵敏度的策略之一。HRP是免疫测定中最常用的标记，其次是碱性磷酸酶(ALP)。已经发现人工金属酶具有独特的催化活性，而没有酶的操作稳定性低、环境条件差以及制备和纯化成本高的缺点。受益于蛋壳膜模板金纳米团簇(Au-ESM)的过氧化物酶样性质，Tan等人(2019)基于Au-ESM催化活性的调节开发了一种用于检测的比色生物传感器。在这项研究中，H2O2可以将HAuCl4还原成AuNPs，从而产生肉眼可见的颜色读数。此外，H2O2被催化AuESM分解。通过基于Au-ESM的生物传感器，可以在缓冲液中以0.12 ng/mL的LOD检测SEB。除了金纳米粒子之外，其他多种纳米材料也被用于构建比色LFA，以提高检测SEs的灵敏度和定量能力，例如，银纳米粒子(AgNPs)、磁性纳米粒子和铑(Rh)纳米酶。Wu等人(2020)使用柠檬酸盐封端的AgNPs作为检测标记，建立了一种用于SEB检测的LFA。在LFA的情况下，共价固定的捕获抗体和AgNPs检测抗体被用作新的构件。SEB LFA在缓冲液、加标液态奶和粘稠蜂蜜中的LOD分别为125、250和500 ng/mL，检测可在15分钟内完成。显然，基于AgNPs的比色生物传感器的灵敏度不如基于AuNPs的LFA，这可能归是因为相比AuNPs，AgNPs的信号强度较低且背景干扰增加。基于比色信号读数，LFA的主要局限性包括有限的灵敏度和缺乏定量能力。Bragina等利用磁性纳米颗粒的三种功能开发了一种检测平台，用于对食品中的SEB进行灵敏快速的定量检测(Bragina等人，2019年)。磁性纳米粒子在SEs的有效预浓缩和磁性富集中起作用，以及在LFA测试条的整个体积上而不仅仅是从其表面上精确定量SEs。该平台可在3.5级（order）的动态范围内对SEB的各种食品进行定量检测，LOD可低至6 pg/mL，样品预处理最少。铑纳米酶作为一种普遍存在的多相催化剂，具有很强的催化活性，有望更好地提高LFA检测SEs的灵敏度。在Cai等人(2022年)开发了一种Rh纳米酶标记的LFA，在检测SEB时表现出显著的灵敏度，能够在牛奶样品中肉眼检测到低至1.2 pg/ml的SEB。二是满足比色发展中对多种分析物检测的需求。大多数基于ELISA的商业试剂盒检测基本包含经典肠毒素亚型的多个靶标的SEs(表5)。试剂盒TRANSIA R PLATE SEs(BioControl Systems，Inc .，Bellevue，WA，USA)和试剂盒VIDAS R SET2 (bioMérieux)具有最高的灵敏度，在食品样品中的检出限为0.02 ng/mL。为了在一次检测中同时快速分析主要SEs，Wang等人(2016)报告了一种基于AuNPs的多重LFA，它可以使用试纸条阅读器同时检测纯牛奶样品中浓度为5、5、5、5和10 ng/mL的SEA、SEB、SEC、SED和SEE五种主要SEs。随后Tarisse等人(2021)最早开发出SEA、SEB、SEG、SEH和SEI的一个单链和五链LFA。在30分钟内，对于SEA、SEG、SEH和SEI， LFA的检出限分别为0.3、0.01、0.02和0.1 ng/mL。对于SEA、SEB、SEG、SEH和SEI的同时检测，在30分钟内，五联体LFA在缓冲液中的检出限分别为0.3–0.9、0.1、0.1、0.3和0.3 ng/mL，由于反应时间相对减少，其灵敏度低于单联体LFA。用于SEs检测的最常见的光学生物传感器之一是荧光生物传感器，其具有良好的灵敏度、快速响应和自动化的简单性。产生荧光信号的荧光团对于荧光生物传感器的发展至关重要，因为它们能够通过荧光变化对目标SEs进行间接定性或定量分析。常用的荧光团是荧光有机分子，例如FITC、菁和罗丹明的衍生物等；荧光纳米颗粒，例如量子点(QDs)、二氧化硅纳米颗粒(SNs)等等；金属元素，例如银纳米团簇(AgNCs)、铕等；或其他，例如藻红蛋白(PE)。如今，基于不同荧光团的各种荧光生物传感器已经被创造出来，具有突出的检测能力。用于检测SEs的生物传感器包括在表2中。由于响应时间快、可重复性高、成本低，荧光有机分子探针已被广泛用于开发检测SEs的荧光生物传感器。Becheva等人开发了一种用于SEA检测的竞争性和夹心荧光免疫测定法，使用FITC作为荧光团(Becheva等人，2021；Becheva，Ivanov，Mihaylova等人，2021)。在竞争性免疫分析中，抗SEA单克隆抗体被固定在带有氨基的修饰磁性纳米粒子上，SEA与FITC结合。竞争荧光免疫测定法在牛奶中的检测限为4 pg/mL。在夹心免疫测定中，评估了基于单克隆抗体-FITC和F(ab’)2-FITC的两种检测。在免疫测定中使用F(ab’)2片段能够检测到非常低浓度的SEA，牛奶样品中SEA的LOD为0.9 pg/mL，相比之下，完整单克隆抗体的LOD为30 pg/mL。由于F(ab’)2片段比单克隆抗体更小，所以它们更易移动，基于片段的生物传感器也更灵敏。Soto等人(2008)使用与羊抗SEB抗体偶联的Cy5荧光病毒支架作为示踪剂，结合的SEB被滑动微管上携带的兔抗SEB抗体捕获。在30分钟检测时间内，可实现0.5 ng/mL的LOD。Rubina等（2010年）开发了依赖于Cy5的SEA、SEB、SEC1、SED、SEE和SEG的检测，使用基于水凝胶的微阵列来实现高通量分析。在这项研究中，SEs被固定在水凝胶生物芯片表面的单克隆抗体捕获，然后被生物素化的单克隆抗体检测。根据肠毒素的类型，基于Cy5的生物传感器的LOD在0.1和0.5 ng/mL之间。ATTO620是罗丹明的衍生物，常用于检测SEs的荧光生物传感器。Becheva等人(2019年)利用与SEA结合的ATTO620开发了一种用于检测牛奶中SEA的竞争性荧光生物传感器，在加标牛奶样品中实现了0.23纳克/ml的LOD。Han等人(2013年)使用Alexa染料(由氨基香豆素或罗丹明生成的罗丹明衍生物，通过用磺酸或其盐之一取代一个或多个氢而磺化)进行检测。与此同时，他们在芯片上制作了纳米级阵列，构建了光子晶体(PC)，产生了高信噪比，并用于提高基于Alexa 532的SEB荧光生物传感器的检测灵敏度。由于导向模式共振，阵列中PC的纳米结构增强了荧光信号。在这种荧光生物传感器中，SEB被附着在纳米级孔表面的单克隆抗体捕获，并被与Alexa 532缀合的抗血清pAbs检测。与典型的96孔ELISA相比，LOD显著提高了106倍，低至35 aM。除了上述荧光有机分子，另一种荧光生物传感器开发策略涉及利用6-羧基荧光素(6-FAM)，羧基荧光素的异构体，结合了羧酸部分，用于检测(Xu等人，2018)。他们将用于信号放大的杂交链式反应(HCR)引入基于förster共振能量转移(FRET)的荧光生物传感器，通过引入起始单链DNA和立足点介导的链置换，结合两个动态捕获的核酸发夹分子，形成具有长重复单元的DNA纳米结构(图4a)。在SEB的存在下，SEB和cDNA(表示为引发剂)之间的竞争通过两个设计的发夹DNA探针(H1和H2)触发连续的HCR，并分离共价位于H1臂末端的6-FAM和黑洞猝灭剂-1 (BHQ-1)，从而允许6-FAM的荧光团发出荧光。在最佳条件下，SEB的检出限为0.33 ng/mL。Yang等(2008)基于荧光有机分子的HRP催化和荧光变化研制了一种荧光生物传感器，用于食品中SEB的检测。通过静电吸附将抗SEB抗体固定在碳纳米管(CNTs)表面，然后将抗体-纳米管结合到聚碳酸酯膜上以检测SEB。OPD在H2O2和HRP的存在下被氧化，HRP与抗兔IgG结合，产生可被荧光读取器检测的彩色产物和光发射。SEB的线性范围更宽(0.1-100 ng/ml)，检测限为0.1纳克/ml。荧光量子点，也称为半导体纳米粒子，由于其高量子产率、良好的生物相容性和易于修饰的表面，除传统的有机荧光探针，还经常用于荧光生物传感器领域。Wang等人(2019年)报告了一种基于磁性量子点(MagQD)纳米颗粒的新型LFA，用于对食品样品中的蛋白质毒素(包括SEB)进行灵敏和多重检测。MagQD纳米颗粒由160 nm Fe3O4的超顺磁性核、作为正电连接体的超薄聚乙烯亚胺(PEI)壳和作为卫星和抗SEB单克隆抗体修饰位点的密集羧基化QD组成。这种MagQD纳米颗粒用作标记，以开发用于定量检测试纸上SEB的荧光生物传感器，在30分钟内定量检测SEB达到2.86 pg/mL的LOD。Veissi等人(2021年)使用载有抗SEA单克隆抗体的Fe3O4纳米颗粒制备了基于碳量子点(CQDs)-FRET的荧光生物传感器，用于从巴氏灭菌和均质化的牛奶中磁性提取SEA(fe3o 4 @ Ab @ SEA)。因此，通过FRET猝灭cqd是由作为供体的cqd和作为受体的SEA的光谱重叠引起的。除了FRET，CQD和SEA之间的内滤波效应也可能发生并提高基于CQD-FRET的荧光生物传感器的灵敏度。在最佳定量条件下，基于CQDs-FRET的荧光生物传感器提供了 4-2000 pg/mL的宽线性检测范围，检测限为2 pg/mL。随后Kumari等（2019）开发了用于SEB的视觉和荧光检测的荧光生物传感器，其中SEB的适配体与蓝色CQD共价共轭。在这项研究中，SEB的存在导致溶液中吖啶黄(Acf)从CDQs–Acf复合物中释放，并破坏CQD和ACF之间的FRET，导致CQD的荧光恢复。通过荧光光谱分析和视觉检测，该基于CQDs荧光生物传感器的LOD在15分钟内在缓冲液中分别为大约0.5和5 ng/mL。理论上讲，具有双重或多重发射的荧光探针的多重检测效力优于具有单一发射的探针。Sapsford等(2011)利用CdSe/硫化锌QD纳米晶设计了一种具有双重发射的荧光探针，可以实现对SEB和IgY的检测。然而，与其他量子点相比，CdSe/硫化锌QD纳米晶体表现出较差的SEB示踪性能，在该生物传感器中的LOD为7.8 ng/mL。除了可能对抗体的性能产生影响外，双发射量子点CdSe/硫化锌容易发生发射光降解，导致荧光强度降低和荧光峰位偏移，最终影响检测灵敏度。其他荧光材料，包括金属元素、SNs、上转换纳米粒子(UCNPs)、PE等，也被用于发展用于SEs检测的荧光生物传感器。通过整合适配体功能化的DNA-AgNCs和猝灭剂聚吡咯纳米颗粒(PPyNPs)，Zhang等人(2020)开发了一种基于能量转移的荧光生物传感器，用于检测SEA。该传感器中，DNA-AgNCs可以通过强π-π堆积被吸附到PPyNPs上，然后荧光由于能量转导而淬灭。加入目标SEA后，SEA和DNA-AgNCs之间的结合导致DNA-AgNCs从PPyNP表面释放。所提出的荧光生物传感器的检出限为0.3393 ng/ml。Zhao等人(2019年)建立了一种基于放大发光邻近均相酶联免疫吸附检测(AlphaLISA)的荧光生物传感器，在能量转移过程中使用铕作为受体进行SEB检测，缓冲液和样本中的LOD为25和50 pg/mL。AlphaLISA是一种使用亲和包被的硅胶珠的均相检测方法。利用链霉亲和素包被的供体珠在680 nm的激光激发下释放单线态氧，通过能量转移到铕受体珠并随后发射615 nm的光，产生放大的荧光信号。Zhang等（2011）提出了基于荧光SNs的激光诱导毫米波荧光生物传感器阵列用于检测。该生物传感器利用与SNs缀合的检测抗体，有着优秀的SEB检测性能，线性范围宽(50 pg/mL至5 ng/mL)且LOD低至 20 pg/mL。纳米碳管由于其优异的光学性能，如低自发荧光背景、良好的光化学稳定性、大的非闪烁发射和对生物样品的深度穿透，在包括生物传感在内的许多领域引起了人们的极大兴趣。Wu等人(2018)基于内滤效应策略建立了一种荧光生物传感器，其中使用UCNPs作为能量供体，镀铂的金纳米棒(AuNR@Pt)作为能量受体，LOD低至0.9 pg/mL。xMAP技术采用获得专利的荧光微球，这些微球在几种荧光染料的含量上有所不同，并且具有它们的频谱地址，为同时检测各种SEs提供了潜在的优势。Simonova等人(2012年)提出了一种基于xMAP-PE的荧光生物传感器，用于同时检测六种蛋白质毒素，包括SEA和SEB(图4b)。其中与单克隆抗体缀合的微球用作捕获抗体，生物素化的单克隆抗体用作检测抗体，其然后与链霉亲和素缀合的PE相互作用，属于夹心法。基于xMAP-PE的荧光生物传感器对SEA和SEB的LOD分别为0.01 ng/mL和0.1 ng/mL。
化学发光生物传感器
化学发光是一种电磁辐射现象，其中分子通过放热化学反应被激发到单激发态。当它回到基态时，会发射一个主要在可见光和近红外光谱中的特定波长的光子(Al-Mughairy & Al-Lawati，2020)。化学发光酶免疫分析(CLEIA)是最常见的用于SEs检测的化学发光生物传感器。HRP和ALP是CLEIA中催化反应最常用的酶。鲁米诺和草酸酯是开发基于HRP的化学发光生物传感器中常用的物质，而AMPPD，一种1，2-二氧代环己烷衍生物，具有空间稳定性，是基于ALP的化学发光生物传感器中最常用的化学发光底物。为了提高化学发光生物传感器的灵敏度和准确性，研究人员提出了各种方法，包括通过增强捕获抗体的固定化或SEs免疫磁性分离来增加SEs捕获，探索酶的固定化，以及增加化学发光量子产率。Liu等人(2010年)建立了夹心HRP-CLEIA检测的方法，检出限为0.01 ng/ml。它已成功应用于检测各种食品基质中的SEB，如烤牛肉、花生酱、腌制火腿、10%脱脂奶粉、牛奶和橙汁。随后，化学发光免疫分析被用于监测SEA (Zhang等人，2013年)和SEC1 (Luo等人，2006年)在食品样品中，其检出限分别为3.2 pg/ml和0.5 ng/ml。考虑到用于抗体固定的大表面积和在可见光范围内的低吸收，CNT在构建用于SEs检测的化学发光生物传感器方面吸引了广泛关注。Yang等人(2008年)利用碳纳米管在CLEIA中捕获pAb，用于检测缓冲液、豆奶、苹果汁和肉类婴儿食品中的SEB，检出限为0.01 ng/ml。晶片上实验室(LOC)有望在没有实验室的情况下实现现场测试。Rasooly课题组将LOC与CLEIA结合，利用小型化的96孔微孔板(Sun等人，2010年)和八通道微流控芯片(Yang等人，2010年)进行检测。在这两种生物传感器中，抗SEB pAb被固定在CNT上，能够以0.1 ng/mL的LOD检测SEB。随后，他们开发了一种用于SEB检测的模块化自动即时检测（POC)光学CLEIA生物传感器，该生物传感器使用了为基于电渗透的生物传感器开发的流体模块(Yangetal .,2011).使用POC系统，仍可检测到浓度为0.1 ng/ml的SEB。显然，通过CNT增加抗体固定并没有显著提高检测灵敏度，此外CNT有毒且难以管理，因此应研究其他种类的纳米颗粒增加抗体在生物传感器上的固定的能力。Yang等人(2009年)开发了一种基于AuNPs的化学发光免疫分析方法，用于检测食品样品中的SEB。通过物理吸附将抗SEB捕获抗体固定在AuNPs表面，然后使用HRP标记的检测抗体检测SEB。CLEIA检测限约为0.01 ng/ml。与CNTs相似，AuNPs没有显著提高CLEIA对SEs检测的灵敏度，这可能主要是因为捕获抗体的量不是CLEIA灵敏度的决定因素。因此，应从其他方面提高检测灵敏度，如提高SEs的分离度。Nistler等人(2019年)首次将免疫磁分离与基于流动的化学发光免疫分析相结合，用于牛奶中SEB的定量检测。用氧化铁-壳二氧化硅-核磁性纳米复合材料与生物素化的抗SEB单克隆抗体结合捕获、磁泳收集牛奶样品中的SEB。该生物传感器在0.6和100 ml牛奶样品中进行测试，分别得到50和0.39 pg/ml的检测限。这表明该生物传感器适用于100 mL的较大样品体积的富集。也可采用酶固定化策略增加酶的稳定性、改善底物的可及性、提高酶的活性，并最终放大化学发光信号，以提高CLEIA的灵敏度。近年来，由于具有可定制、均匀的孔结构、可功能化的表面和受限的纳米空间而具有固定抗体和酶的潜力，介孔二氧化硅纳米粒子(m-SNs)受到了广泛关注。Chen等（2012）用戊二醛将HRP和抗抗体同时固定到m-SNs的表面，制备了功能化的m-SNs(图4c)。m-SNs的表面积大，为结合物提供了高信号，LOD可达4 pg/mL。为了缩短程序时间，避免报告抗体化学结合过程中抗体活性的损失和批次间的不稳定性，Sun等人(2020)开发了一种用于检测的化学发光免疫分析方法，使用Nb-ALP融合蛋白作为检测元件，LOD为1.44 ng/mL(图4d)。草酸盐化学发光体系与未修饰方法相比，具有更高的化学发光量子产率和更稳定的化学发光。Tao等人(2016年)开发了一种双(2，4，6-三氯苯基)草酸盐(TCPO)H2O 2–咪唑–m-SNs CLEIA，用于检测SEC1，检出限为19 pg/ml。Xue等人(2011年)建立了一种—H2O 2—乙二醛—PHPPA化学发光分析法，用于检测SEB，检出限为3.3 pg/ml。
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图4 用于 SE 的光学生物传感器示例。（a）用于检测SEB的基于HCR的竞争性荧光生物传感器（Xu等人，2018）。在SEB中，SEB与适配体和释放的cDNA结合，作为线性HCR系统中信号放大的引发剂。在没有SEB的情况下，cDNA通过互补配对与适配体杂交，信号被关闭，导致阴性结果。（b）用于检测SE的基于xMAP的荧光生物传感器（Simonova等人，2012）。在加入链霉亲和素-PE偶联物之前，首先将Ab偶联的xMAP微球混合物与SEs和生物素化检测抗体一起孵育。通过荧光检测器读取的PE的荧光强度检测SEs的量。SEs的类型由微球ID检测器确定以鉴定。（c）用于检测SEB的化学发光生物传感器（Chen等人，2012）。以戊二醛为键点，将HRP和SEB抗体（Abs）同时固定在表面，制备了双功能介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）。捕获 Abs 包被在 96 孔板的表面上。MSN载流子的大表面积增加了HRP的量和更高的信号，LOD为4 pg/mL。（d）用于检测SEB的化学发光生物传感器（Sun等人，2020）。融合蛋白Nb37-ALP在构建pET载体后在大肠杆菌原核系统中表达，作为检测抗体，以SEB单克隆抗体为捕获抗体，开发LOD为1.44 ng/mL的夹心CLIA。（e）用于检测SEB的基于纳米壳的SERS生物传感器（Wang等人，2016）。用 4-NTP 修饰 AuNPs，然后涂覆 Ag 壳，然后检测抗体偶联以构建拉曼标签。在微孔板上涂覆捕获抗体，通过拉曼标签检测污染样品中的SEB，并用不同SEB浓度的拉曼光谱仪读取SERS信号强度。值得注意的是，1333 cm−1处的SERS信号强度与SEB浓度的对数函数呈线性相关。（F）用于检测SEB的基于LFA的SERS生物传感器（Hwang等人，2016）。在常规 LFA 条带 （i） 上：在没有 SEB（阴性）的情况下，在控制区中仅观察到一条红色条带，而在存在 SEB（阳性）时出现两条红色条带。使用基于SERS的LFA试纸条（ii）：通过监测SERS峰强度，可以对目标分析物进行高灵敏度定量。
SERS 生物传感器
对于吸附在某些基底上的分子，所观察到的拉曼截面中的SERS效应异常增加，并且提供了由分子振动提供的独特的指纹谱，该指纹谱可用于表征各种目标，同时克服了弱拉曼散射所面临的挑战(Sun等人，2023)。对于具有高灵敏度、多路复用能力和快速的化学和生物检测，基于SERS的生物传感器经历了感兴趣的爆炸。由于基底的特性对SERS的信号效率有显著影响，SEs检测领域的大部分研究致力于SERS基底的修饰。通常，金、银或铜的纳米结构表面是产生有效SERS响应的优异基底。Pekdemir等人(2012年)使用AuNR颗粒作为底物，其中含有5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)的SERS标记分子，与作为检测示踪剂的SEB抗体和作为捕获探针的抗体功能化磁性AuNR颗粒偶联。所开发的SERS生物传感器实现了低至768 aM的LOD。在另一文献中，肽适配体功能化的磁性AuNR被用作SEB检测的底物和清除剂(Temoor等人，2012年)。从基质中分离出SEB后，用肽适配体偶联的DTNB标记的AuNRs进行夹心检测，LOD为224 aM。在2020年，Wu等人(2020)开发了一种用于检测的三通道四聚体生物传感器，其中将与4-巯基苯甲酸(4-MBA)偶联的金用于检测。在该生物传感器中，三种类型的金纳米粒子被SEB核酸适配体和SERS报告分子4-MBA的三种不同的部分互补的DNA序列功能化，而UCNPs被SEB核酸适配体修饰。SEB与适配体的竞争性结合导致AuNPs的释放和SERS信号的降低，实现了低至0.1 pg/mL的LOD。金属有机框架(MOFs)由于其表面积大、具有均匀和可控的纳米结构空腔和优异的化学/热稳定性，在检测领域显示的应用颇具前途。因此，Wang等人(2022)试图在生物传感器中将基底AuNPs封装到高度多孔和热稳定的MOFs MIL-101中。使用Cy5.5适配体修饰的AuNPs@MIL-101，基于SERS信号和荧光信号的变化，LOD分别为0.2和0.5 pg/mL。由于金和银层之间的拉曼分子的显著电磁增强，嵌入拉曼报告子的Au@Ag核壳结构是自支撑纳米材料；因此，Wang等人(2016)将这种结构应用于在生物传感器中检测(图4e)。在这种情况下，用4-硝基硫酚(4-NTP)修饰并涂有厚度为6.6 nm的Ag壳的AuNPs表现出优异的SERS强度，并用于SEB检测，LOD为1.3 pg/mL。由于纳米材料方面的进展，出现了一些关于不同类型的SERS底物用于SEs检测的报道。为了减少仪器和测量环境造成的差异、提高准确度和灵敏度，Zhao等(2021)报道了一种基于持续发光纳米粒子(PLNPs)的双模光信号生物传感器，用于SEC检测。PLNPs能够在停止激发后的一段时间内发光，将其用于生物传感可有效地避免激发光的背景干扰。因此，制备了ZGGO PLNP(znge Gao:Cr，Er，Yb)和Au纳米双锥的组合，以产生可调的持续发光性质和SERS活性，用于SEC检测，SERS信号的LOD为8.9 pg/mL。Hwang等人(2016年)展示了一种开发基于拉曼报告子标记的空心金纳米球(HGNs)的LFA生物传感器的新方法，用于SEB的高灵敏度快速检测(图4f)。这项工作中，所有的测量原理都与传统的LFA相同，但是拉曼报告标记的HGN被用作SERS检测探针。基于SERS的LFA的LOD比LFA的POC低10000倍。基于SERS的LFA生物传感器有很大的潜力，可以用更简单的方法快速准确地检测。因此，应开发一种用于现场诊断的便携式拉曼系统，而不是基于HGNs的比色法。SPR 生物传感器
SPR生物传感器通过利用特殊的电磁波-表面等离子体激元来探测溶液中的分析物和固定在生物传感器表面上的识别元件之间的相互作用(Homola等，2003)。SPR生物传感器具有多种优点，包括无标记、非侵入性、连续和多点检测能力，以及试剂用量低。这些特性使得SPR生物传感器成为实验室仪器的优秀候选。在SPR生物传感器中用于早期SEs识别的信号转导包括波长调解(Homola等人，2001；Homola等人，2002年；Slavik等人，2002)和角度测量(Medina，2003；Naimushin等人，2002年；Rasooly，2001年)。前者是过去十年的研究重点(Ben Haddada et al .，2017；Dudak & Boyaci，2014；Tabasi，2019)。为了提高SPR生物传感器对SEs的检测性能，研究人员从样品预处理、识别元件创新、信号放大、芯片优化等方面进行了一系列研究。SPR生物传感器的灵敏度会受到样品基质的干扰，这种干扰阻碍分析物与SPR表面上识别元件的结合，或者在SPR表面上非特异性结合。为了提高SPR生物传感器的灵敏度，Soelberg等人(2009年)采用了抗体包被的磁珠来快速纯化和浓缩粪便样品中的SEB，这极大地去除了样品基质，并轻松检测到浓度为100 pg/mL的SEB。在识别元件方面，Dudak和Boyaci (2014)开发了一种用于SEB检测的SPR生物传感器，使用肽适配体代替经常使用的抗体作为识别元件。SEB SPR生物传感器最佳条件下的检测限为20 μg/mL，与基于抗体的SPR生物传感器相比，该传感器没有足够的灵敏度。上述结果表明，应进一步提高肽适配体的亲和力，以满足SEB检测的要求。Gupta等人(2010a)将MIPs与SPR平台整合，开发了一种用于SEB检测的SPR生物传感器，其LOD为0.05 fM，该结果表明，MIPs可能是高灵敏度的抗体的潜在替代品。在SPR生物传感器中，分析物-抗体的复合物越大，SPR的信号越大(Belen等人，2021)。因此，为增加信号强度从而提高灵敏度，Belen等人(2021)在用于SEG检测的SPR生物传感器的表面上用更大的分子如抗体偶联的AuNPs或SiNPs代替抗体。较大的AuNPs分子并没有产生比单独的抗体更高的响应信号，这是由AuNPS和芯片金表面产生的渐逝场之间的相互作用导致的。另一方面，抗体SiNPs增强了响应信号，但没有增加SPR生物传感器对SEG的灵敏度。这些结果表明，增加复合物分子量不能有效提高SPR生物传感器的灵敏度。在大多数研究中，SPR芯片层通常是在市售的羧甲基葡聚糖预功能化的金表面上制备的。Tabasi (2019)注意到分子量为40、200和500 kDa的葡聚糖会对SPR芯片层与检测性能相关物理特性产生影响。他们发现，与分子量为40和500 kDa的葡聚糖相比，分子量为200 kDa的葡聚糖导致明显更大的SPR角偏移和更好的SEB检测信号。这使得它成为构建具有更高SEB检测灵敏度的SPR的合适候选者。自组装单分子层技术是SPR生物传感器金表面功能化最常用的方法。为了避免识别分子和目标分析物之间的空间位阻，Tsai和Li (2009)通过具有不同摩尔比的16-巯基-1-己醇(16-MHA)和6-巯基-1-己醇(6-MCH)的硫醇混合物制备了各种混合自组装膜，以获得在SPR芯片表面固定抗血清抗体的最佳表面。在SPR芯片表面上使用16-MHA和6-MCH的1∶20比例混合的SAM，在检测缓冲液中对SEA的LOD为100 ng/mL，结果优秀。随后，该课题组贡献了另一种制备自组装膜的策略，通过吸附不同摩尔比的16-MHA和己硫醇的混合物来检测SEB (Tsai & Pai，2009)。结果表明，1∶10比例的10 mM混合SAMs与16-MHA和6-MCH提供了末端羧酸酯基团的反应位点和空间位阻之间的最佳平衡。通过优化表面功能化，SPR生物传感器可用于检测缓冲液中低至10 ng/mL的SEB。除了传统的SPR平台之外，其他SPR平台也可用于对SEs进行定量和定性分析，如局部SPR (LSPR)生物传感器和SPR-MS生物传感器。传统的SPR使用连续的金膜， LSPR基于在金属纳米结构如纳米颗粒或纳米线中的局部共振现象，被广泛用于表面受体和配体相互作用的无标记、高灵敏度分析。Ben Haddada等（2017）基于AuNPs抗体偶联物区域的局部折射率变化，描述了一种用于SEA的同质、无洗涤的LSPR生物传感器，其LOD等于5ng/mL。在SPR-MS生物传感器中，SPR用于蛋白质和目标的定量和相互作用分析，而MS负责确定蛋白质结构并提供定性信息以提高其检测的准确性。Nedelkov等人(2000年)和Nedelkov和Nelson (2003年)提出了两种SPR-MALDI-TOF MS，可轻松检出食品样品中1 ng/mL水平的SEB。6.2.2 电化学生物传感器
电化学生物传感器是通过生化反应检测生物分子时，将生物信号转化为电信号响应的装置(Shan等，2020)。电化学生物传感器因其高性价比、快速、准确和灵敏的性能而引起了广泛关注。信号转换器是电化学生物传感器的关键部件。基于不同的信号转换器的用于SEs检测的大规模电化学生物传感器已被开发出，分为电流型、伏安型和阻抗型生物传感器。此外，为了增加电化学信号的产生和降低背景噪声，电信号放大领域已经取得了很大的进展，主要使用磁珠、酶、纳米材料如CNT、石墨烯及其衍生物、各种氧化物纳米颗粒和金属纳米颗粒如金、银或金属络合物。这些进展证明了如何提高电化学生物传感器的SEs收集、结合或转导性能，并满足实际临床检测的要求。表3总结了用于SEs检测的电化学生物传感器。表3 用于SEs检测的电化学传感器
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安培生物传感器
电化学生物传感器跟踪在固定时间段内施加恒定电势后电流的变化(Shen等人，2021)。由于HRP或ALP的酶反应能提供高、稳定和可再现的信号放大(Yang，2012)，酶标记常被用在电化学生物传感器中。Pimenta-Martins等人(2012年)报告了一种基于酶促反应的有效的电流型生物传感器，用于检测奶酪中的SEA，检出限为33.9 ng/ml。在被固定在SpA修饰的金电极上的抗体捕获后，用HRP标记的抗体检测SEA。在H2O2和氢醌的存在下，生物传感器的电流信号由HRP产生。Wei等（2017）在玻碳(GC)电极表面自组装固定双层HRP、AuNPs和硫堇壳聚糖复合膜，开发了用于检测SEQ的电流型生物传感器。这种配置中双层HRP提供了信号放大，双层AuNPs除了具有更大的表面积之外，还提供了优异的导电性，这增加了固定抗体的数量。所有这些因素都有助于提高生物传感器的灵敏度。在最佳条件下，该生物传感器对SEQ达到了0.046 pg/mL的极低LOD。除了用于安培信号放大的酶促反应，Chen等人(2019)还描述了一种用于检测SEB的安培生物传感器，该传感器基于树状DNA超结构的HCR来放大电化学信号(图5a)。在生物传感器的过程中，SEB与触发DNA竞争结合适配体，导致树状DNA超结构的形成，该超结构通过静电吸附与六氨合钌(III)阳离子结合并组装到修饰的金电极上。这产生了放大的电化学信号，通过计时库仑法进行测量，显示了3 pg/mL的低检测限，其在检测牛奶中的SEB方面具有潜在的应用。伏安生物传感器
生物传感器的伏安信号跟踪各种电位下的电流变化(Shen等人，2021)。酶也经常在SEs的伏安生物传感器中用作标记。Chatrathi等人(2007年)提出了一种用于检测SEB的伏安生物传感器，基于α-NPP转化为电活性产物α-NP的酶促反应，利用夹心形式的碱性磷酸酶，检测限可达1.0 ng/ml。由于对质子还原的优异电催化活性和效率，Pt纳米颗粒通常用于酶伏安生物传感器的开发。Sharma等人(2014年)利用铂纳米颗粒来修饰用于检测SEB的伏安生物传感器的气相色谱电极。在这项工作中，ALP催化抗坏血酸2-磷酸酶水解为抗坏血酸，抗坏血酸负责将铜沉积在Pt纳米粒子修饰的GC电极上以提高析氢和检测灵敏度。在最佳条件下，伏安生物传感器的检出限为1.0 ng/mL。氧化锆(ZrO2)纳米粒子具有几个有趣的性质，包括表面积大、化学稳定性高和优异的生物相容性，这些性质目前被用于修饰电极以开发酶伏安生物传感器。Deng等人(2014)基于AuNPS–z ro2纳米粒子-壳聚糖纳米复合材料修饰的金电极(AuNPS ZrO 2–Chits/金电极)和HRP开发了一种用于检测SEB的伏安生物传感器(图5b)。该传感器中，SEB核酸适配体的捕获探针被固定在金电极上，具有由AuNPS–z ro2–Chits提供的巨大有效表面积。在SEB的存在下，SEB的适配体从电极上的适配体中释放出来。当生物素化的检测探针与捕获探针杂交并与链霉亲和素-HRP反应时，观察到H2O2的酶催化电化学信号。这种基于氧化锆的酶伏安生物传感器显示出2–512 ng/mL的宽线性范围，检测限为0.24 ng/mL。Tang等（2010）将HRP纳米二氧化硅掺杂的多壁碳纳米管(HRPSiCNTs)用于信号放大，开发了夹心式伏安生物传感器，对具有10 ng/ml的低检测限。与HRPSiCNTs共价结合的抗SEB pAb用作检测抗体，捕获抗体固定在丝网印刷的碳电极上。HRP在硫堇的帮助下催化H2O2的电化学还原，并极大地放大了电化学信号。除了酶标记外，还有带有其他标记的伏安生物传感器。二茂铁通常用作电化学指示剂，用于标记识别元件，用于开发电化学生物传感器。Sharma等人（2016）比较了石墨烯-壳聚糖AuNPs和多壁CNTs-壳聚糖-AuNPs作为基于二茂铁的伏安生物传感器中用于SEB检测的信号放大的有效基质。这种伏安夹心法使用二茂铁标记的抗体作为检测抗体。使用石墨烯-壳聚糖AuNPs固定化系统，可在35 min内轻松检测5 ng/mL SEB，使用多壁CNTs-壳聚糖-AuNPs固定化系统可检测10 ng/mL SEB。在另一项研究中，二茂铁被选为标记在单链DNA 上的信号指示剂，以通过 SEB 存在下的 DNA 构象变化提供“开启”信号（Wang、Da 等人，2022 年）。该生物传感器在真实食品样品（如牛奶样品）中表现出适用性和可靠性，并具有 0.005 至 100 ng/mL 的宽线性检测范围，缓冲液中的 LOD 低至 3 pg/mL。量子点具有良好的电化学和荧光性能，近年来在电化学生物传感器中备受关注。Sharm等人（2015）制备了硫化锌（ZnS）QDs，然后将它们与抗体偶联，作为SEB夹心生物传感器中的捕获探针。采用电化学方波伏安法分析了ZnS量子点溶解的锌离子，LOD为1.0 ng/mL。海胆纳米金来源于AuNPs，但具有更高的表面积，Nodoushan等人（2019）已将其应用于伏安生物传感器中的SEB检测。他们使用电化学标记苏木精在伏安生物传感器中产生电化学信号，用于SEB检测，其中还原氧化石墨烯（rGO）和工作丝网印刷电极上的海胆金的组合增强了灵敏度生物传感器由于表面积大，导电性高。在SEB存在下，由于苏木精与DNA的强插层相互作用，适配体从电极表面分离，降低了差分脉冲伏安峰值电流。在最佳条件下，伏安生物传感器的LOD为0.21 fM。随后，该小组建立了另一种伏安生物传感器，用于基于海胆金、rGO 和苏木精的应用检测 SEA（Nodoushan 等人，2022 年）。该生物传感器的LOD为7.6 fM。与之前的研究相比，此研究的LOD明显更高，这可能归因于适配体亲和力不足。最近，Li 等人（2023 年）开发了一种无标记、超灵敏和快速伏安生物传感器，基于场效应晶体管检测 SEC，使用使用的 CNT 作为半导体。伏安生物传感器在5 min内分别在PBS和巴沙鱼样品中实现了1.25和8.15 fg/mL的超低理论LOD。阻抗生物传感器
另一种用于SEs检测的电化学生物传感器利用了阻抗生物传感器表面的目标结合导致电极阻抗增加的原理(Shen等人，2021)。为了提高阻抗型生物传感器检测SEs的灵敏度，目前研究的主要目标是通过改进抗体固定、优化电极条件和使用适配体来提高电极的导电效率。Rocha等人，（2020)通过使用rGO最大化抗SEA抗体的固定化，制备了用于检测牛奶中SEA的阻抗生物传感器，LOD为0.102 μg/mL。单壁碳纳米管(SWNTs)由于其大的表面积以及独特的电子性质产生的导电性，有着增强抗体固定的潜力。Yang等人(2010a，2010b)描述了一种用于检测的阻抗生物传感器，该传感器通过随机分布的单壁碳纳米管-抗体复合物网络嵌入传感器中(图5c)。抗体-SEs的结合破坏了网络的连续性，导致阻抗生物传感的电阻增加。使用上述改进型阻抗生物传感器可以5 ng/mL的LOD检测SEB。另一种用于检测SEB的阻抗式生物传感器被报道具有低至0.5 ng/mL的LOD，其中纳米金/壳聚糖多壁CNT (Au/CTS-MWNT)功能化的生物传感器表面被用于生物电催化反应的HRP抗体固定(Chen，2008)。Wu等(2013)基于聚苯胺纳米金复合物和1，2-二甲基-3-丁基咪唑六氟磷酸盐离子液体修饰的金传感器，开发了一种用于检测的阻抗式生物传感器。阻抗生物传感器的电流被与磁小体结合的抗抗体阻断(Wu等人，2013)。这使不仅改善了传感器的电子转移和增加了阻抗，还为抗体提供了良好的生物相容性条件，以保持其增强阻抗生物传感器灵敏度的活性，检测SEB的LOD为0.017 ng/mL。最近，Chen等人(2018年)提出了一种阻抗生物传感器，整合适配体、三种巯基化探针和一种辅助探针以检测SEB，LOD为0.17 ng/mL。结果表明，SEB适配体可用于检测SEB，具有足够的灵敏度，尽管核酸适配体的亲和力需要进一步提高以与抗体相当。与电流型生物传感器相比，伏安型生物传感器和阻抗型生物传感器在SE检测领域的研究更多。电化学生物传感器的性能与纳米材料的组成和结构密切相关。因此，探索新的纳米材料和优化纳米材料的结构和组成是SEs检测领域的重要研究方向。此外，SE电化学生物传感器的另一个要求或挑战是在复杂的生物系统中同时检测多个SE。![]()
图 5 用于 SE 的电化学生物传感器示例。（a）用于检测SEB的电化学生物传感器（Chen等人，2019）。通过Au-S键在金电极表面修饰捕获的DNA，然后使用MCH阻断未结合位点。在 SEB 存在下，适配体-SEB 偶联物被迫形成并导致触发 DNA 的释放，随后与捕获 DNA 的部分互补序列杂交，以三个辅助 DNA 序列（称为 H1、H2、H3）触发 HCR。最后，将树突状DNA超结构组装到修饰的金电极上，并辅以放大的电化学信号，通过计时法测量。（b）用于检测SEB的伏安生物传感器（邓等人，2014）。用AuNPs-ZrO2-Chits制成的纳米复合材料对金电极进行了修饰。将捕获的DNA固定在金电极表面，然后与SEB的适配体杂交。在SEB存在下，适配体与SEB结合并从电极中释放出来。将生物素化的检测DNA与剩余的捕获DNA杂交。一旦生物素被SA-HRP识别，使用H 2 O 2 O 2作为酶底物观察到催化信号。（c）用于检测基于SWNTs的SEB的阻抗生物传感器（Yang等人，2010a）。阻抗生物传感器的换能器包含两个电极和随机分布的SWNTs-抗体复合物网络（上图）。没有SEB时，换能器的电阻较低（左），而由于网络连续性的破坏，换能器的电阻在SEB存在时变得较高（右）。通过以直接检测形式监测电导率变化来跟踪 SEB 进样 （i） 及其在 SEB 进样 （ii） 后期间的放大部分。通过以三明治检测格式 （iii） 监测基线信号 （S/B） 来跟踪 SEB 注射和抗 SEB 抗体注射。
6.2.3 压电生物传感器
压电生物传感器是具有信号转换振荡压电谐振器的质量敏感设备(Pohanka，2018)。石英晶体共振频率的变化与芯片表面沉积质量有关的特点使QCM成为使用最广泛的压电器件(Skladal，2016)。压电生物传感器具有实时信号输出、简化的检测过程、低成本和移动的可能性，能以无标记的方式直接监测结合的特点。大多数研究都研究了传感层的加工和优化，特别聚焦于金传感器上识别元件的固定策略。一些研究关注用于制造压电生物传感器的识别元件。表4概括了用于检测SEs的压电生物传感器。共价结合是压电生物传感器中固定抗体的常用方法。Karaseva和Ermolaeva (2015年)在压电生物传感器中使用抗体的氨基和戊二醛的羰基将抗SEA抗体共价固定在电聚合聚吡咯基底上，LOD为0.4 ng/mL。除了共价结合之外，非共价结合方法，例如物理吸附和基于亲和力的方法，也已经被尝试用于在压电生物传感器中固定抗体。SpA作为压电生物传感器中非共价固定抗体的最常用试剂，增加了固定的抗SEA抗体的量，并允许有效控制压电生物传感器表面上抗体的取向(Salmain等人，2012年)。Salmain等人(2011年)设计了一种使用SpA固定抗SEA抗体的压电生物传感器来检测SEA。SpA共价连接到压电生物传感器表面的氨基上，用刚性双官能交联剂1，4-亚苯基二异硫氰酸酯(PDITC)活化压电生物传感器。使用改进的传感层检测SEA的直接形式具有20 ng/mL的LOD。当夹层形式与相同的传感层一起使用时，响应约为两倍高，导致LOD降低至7 ng/mL。后来，该课题组通过SpA制造了另一种固定抗SEA的压电生物传感器(Salmain等人，2012年)(图6)。SpA共价连接到由N，N，N′，N′-四甲基-(N-琥珀酰亚胺基)脲四氟硼酸盐(TSTU)活化的羧酸封端的SAM或由PDITC活化的胺封端的SAM，鉴定最相关的亚层。结果表明，通过PDITC固定化抗体的量比通过SpA固定化抗体的量低一半。这种压电式生物传感器与前者具有相同的灵敏度。Ben Haddada等人(2018年)使用dAuNPs作为SpA固定化的纳米结构化试剂，以改变生物传感器芯片的表面，使SpA在芯片表面的结合位点更容易接近。尽管在纳米结构和平面生物传感器上固定的pAb具有可比的表面密度，但是在SEA与pAb结合期间记录的频移在纳米结构生物传感器上明显高于平面生物传感器。该生物传感器在25分钟内提实现了大约1 ng/mL的最低LOD。与共价固定相比，似乎抗体的非共价固定策略的检测灵敏度更低，这可能是因为非共价固定的抗体数量少于物理吸附与化学反应。除了使用抗体作为识别元件，MIPs也可用于检测SEs的压电生物传感器。Liu等人(2012)通过原位固定将有机硅烷和SEB结合在PQC金电极的表面上，制备了二维MIP涂覆的QCM，用于检测SEB，检出限为6.1 ng/mL。
表4报道中用于检测SEs的压电生物传感器总结![]()
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图6 SEA压电生物传感器示例（Salmain等人，2012年）(a) 生物传感器的构建和操作：通过PDITC（i）或TSTU（ii）在镀金石英晶体电极上的SpA化学选择性示意图；SEA捕获然后应用ABS，然后用流动的PBS-牛血清白蛋白（BSA）阻断非特异性结合。SEA被捕获和检测在三明治格式。（b）在组装压电生物传感器、以0.97 mg/L捕获SEA和应用100 mM甘氨酸盐酸pH 2.5更新生物传感器期间记录的频率和耗散变化。（c）捕获抗体和SEA的第二次和第三次结合期间记录的频率和耗散变化。
7 结论与展望
本文对食品样品中SEs的检测方法进行了全面的综述，主要包括生物检测、基因检测、质谱检测和生物传感器(图7a)。我们的统计表明，在现有的SEs检测方法中，80%的检测方法检测了经典SEs(包括SEA、SEB、SEC、SED和SEE)(图7b)。由于每种检测方法在特定方面都有独特的优点和缺点，因此为特定应用创建一种合适的方法来有效检测食品样品中的SEs至关重要。传统的生物检测，如动物呕吐试验和T细胞增殖，缺乏特异性且耗时，基于MS的检测虽灵敏可靠，但总是受大量样品制备、高成本、低通量和需要专业人员的困扰。基因鉴定方法虽然通量高，但它们仅能检出SEs基因的存在，却不能提供毒素存在的直接证据。一般而言，与基因检测和生物传感器相比，生物和质谱检测方法较少报道用于SEs检测，因为它们耗时且复杂(图7a)。高灵敏度和特异性只是生物传感器优于上方法的几个优点。生物传感器利用光学、电化学和压电传感器产生信号，以抗体、适配体、MIPs和TCRs作为识别元件。它们还在快速响应、廉价成本、便携性和潜在原位应用等方面表现出优越性。在光学生物传感器中，比色生物传感器占SEs检测中使用的所有生物传感器的最高比例——88%，其次是荧光检测、化学发光、SERS和SPR(图7c)。更重要的是，基于比色法的商业ELISA和荧光试剂盒因其简单、灵敏度高和易于操作等优点在世界范围内被广泛使用(表5)。虽然当前关于血清学检测的研究较少，但商业试剂盒仍在销售。尽管在实际样品中具有较高的LOD，基于比色法的LFA仍是现场快速检测SEs的最有前途的生物传感器，(表2)。基于荧光的生物传感器常用于比色生物传感器，然而复杂食品样品有着显著的背景噪声，不利于检测灵敏度。基于SERS和SPR的生物传感器允许对SEs进行无标记检测，具有高度的易用性和较少的试剂使用。SERS生物传感器提供个体整体生物指纹的信息，而SPR生物传感器提供实时跟踪生物分子相互作用的能力。然而，SPR的检测限与SERS生物传感器的精度仍需进一步提高。电化学和压电生物传感器的报道比光学生物传感器少，但它们有着极高的检测灵敏度。在食品从农场到达餐桌之前，在原材料、加工、运输等各个阶段监测SEs污染至关重要。现场快速检测是实现SEs即时监测的发展趋势。目前授权的商业试剂盒大多使用ELISA或酶联免疫荧光分析，该方法劳动密集、耗时长且通量低(表5)。为了支持SEs的快速现场检测的可持续发展，仍有许多改进当前检测方法的努力。从快速样品预处理和新的现场检测方法入手，主要有两个必要的方面。样品预处理是开发检测方法以从复杂的食品基质中快速提取SEs的关键第一步。即使从复杂的食物提取物中分离SEs的过程有时不可避免地会延长分析时间。对于从复杂的食品样品中分离和浓缩SEs，免疫磁性分离已经取得了重大进展。应注意，加工条件的变化，（如温度和pH值的变化）会显著影响基于抗体的生物传感器对SEs的检测(Principato等人，2009；Principato等人，2010年)。即使在成功分离SEs，SEs蛋白的功能的丧失仍然会在检测过程中导致假阴性。不幸的是，此问题目前仍缺乏一个有效的解决方案。可通过制备经过温度或PH筛选的SEs抗体解决此问题。第二点是开发高性能的现场检测方法。传感装置或设备的自动化和便携性是现场快速筛选SEs的主要问题。潜在的候选方法包括可以通过肉眼或智能手机读取的比色生物传感器。越来越多的注意力集中在创新检测形式、便携式仪器和信号材料上，包括改良的AuNPs、碳基量子点、长波长荧光团、上转换发射体和GOs。此外，目前SEs检测的模式样品基本都是牛奶，因此，应该对不同样品（如预制菜）进行更多的研究。尽管在食品行业中用于SEs检测的现场检测仍处于起步阶段，但发展可靠的生物传感器用于实际应用和商业化的趋势很强。特别是开发集样品前处理和生物传感器过程于一体的自动化、经济的控制装置，以实现对各种样品中SEs的“从样品到结果”的检测，可能颇有前途。表5： 用于SEs检测的商用试剂盒
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图7 SES检测的类型分析(a) 所占比例的SE检测方法包括生物检测、基因检测、MS检测和生物传感器。(b) 检测到的SE类型的比例。(c) 用于SE检测的生物传感器的比例基于光学传感器（88%的比例），电化学传感器（9%的比例）和压电传感器（3%的比例）。其中，光学传感器由比色传感器（64％比例）、荧光传感器（14％比例）、化学发光传感器（4％比例）、SERS传感器（2％比例）和SPR传感器（4％比例）组成。数据是通过在Web of Science（2023）上搜索“金黄色葡萄球菌肠毒素检测”获得的。
原文出处：Li, Qing, Leina Dou, Yingjie Zhang, Liang Luo, Huijuan Yang, Kai Wen, Xuezhi Yu, Jianzhong Shen, and Zhanhui Wang. ‘A Comprehensive Review on the Detection of Staphylococcus Aureus Enterotoxins in Food Samples’ 23, no. 1 (January 2024): 1–45.
链接：https://doi.org/10.1111/1541-4337.13264
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