杂交瘤技术是目前单克隆抗体制备的主要方法。随着重组抗体的表达和抗体库的测序技术的发展，抗体的制备技术已经成为生物技术领域的重要一部分。然而，在杂交瘤技术中，杂交瘤细胞分泌的抗体是在培养基当中的，因此需要有限稀释法，对杂交瘤进行稀释，并检测单克隆细胞上清中抗体的检测，在该方法中存在检测数量的限制，这可能会导致灵敏抗体的丢失。因此，近年来在杂交瘤技术上有很多新的改进技术，目的是提高杂交瘤技术制备抗体的效率，包括电融合等，但是筛选方式仍然是传统的有限稀释法，这导致杂交瘤技术没有突破性进展。淋巴细胞培养技术，可以将抗体与分泌抗体的B细胞联系起来，为筛选方式的改进提供了一些新的思路。研究表明可以通过在微滴或半固体介质中捕获分泌的单个细胞分泌的单克隆抗体。还有一些研究对杂交瘤进行生物素化处理并结合与抗生物素蛋白偶联的抗IgG二抗。或者将二抗结合到锚定膜的亲脂性分子上。但是，在这些方法中，分泌抗体会结合至未分泌抗体的附近细胞上面，从而会导致非特异性和假阳性的产生，因此在运用的过程存在很多限制。
本研究提出了一种新的杂交瘤筛选方法：细胞表面单抗筛选（On-Cell mAb Screening，OCMSTM），可以高效筛选能够识别和分离分泌具有抗原特异性和表达稳定性杂交瘤细胞株。OCMSTM的原理与酵母展示系统的原理一样，但是克服了酵母展示中基因克隆及载体构建等复杂过程。与传统的ELISA方法相比，OCMSTM所需的抗原量很小，可以使用荧光成像或流式细胞术实时评估异质群体中单个细胞的mAb表达水平。在OCMSTM中，杂交瘤表面捕获且显示mAbs，同时能够防止mAbs与不分泌它们的细胞结合，从而避免了非特异性的产生。细胞表面上显示的mAb的表达水平和结合特异性，可以通过荧光抗原含量（基于图像）或流式细胞仪快速测定。研究发现，OCMSTM通过形成在细胞表面IgG“帽”，证明了对单克隆抗体与脊髓灰质炎病毒和狂犬病毒的特异性结合，这可以作为抗病毒单克隆抗体的通用检测方法。本研究制备并表征了分泌能中和脊髓灰质炎病毒的mAb的OCMSTM功能杂交瘤，并使用荧光显微镜进行鉴定，同时克隆了人N-甲基-D-天冬氨酸受体特异的人mAb。最后，我们使用OCMSTM评估了293T细胞中产生的重组mAb的表达和抗原结合。作为将mAb与分泌它们的杂交瘤物理关联的新方法，OCMSTM克服了杂交瘤mAb筛选的核心挑战，并为mAb的发现和生产提供了新的技术和方法。
1． OCMSTM设计概述
3 OCMSTM特异性捕获和分析分泌人IgG的杂交瘤
图 2 OCMSTM进行分泌人IgG杂交瘤的特异性捕获和分析。（a）将8C5 OCMSTM（上排）和B5-6T OCMSTM（下排）细胞与RAH（AB14），生物素化狂犬病GP和Alexa Fluor488®链霉亲和素（绿色）（AB3）孵育过夜。通过荧光显微镜观察，图像显示为带有DAPI（蓝色）（右）或不带有DAPI（左）。比例尺= 5μm。（b）将4G4 OCMSTM（上排）和8C5 OCMSTM（下排）杂交瘤与兔Fab抗人IgG（AB17）孵育过夜，然后与其他兔Fab抗人IgG和Sabin III型PV孵育一小时（左栏）或GP（右栏），然后是AlexaFluor®488抗人IgG（绿色）（AB2）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺= 10μm。（c）在此混合实验中，非分泌型OCMSTM细胞系用CFSE（绿色）标记，并以10：1的比例与分泌IgG的OCMSTM杂交瘤混合。将细胞与兔F（ab′）2抗人IgG（AB15）孵育过夜，然后洗涤并与生物素化蛋白A（AB12）和APC链霉亲和素（红色）（AB4）孵育。（顶部行）8C5 OCMSTM与B5-6T OCMSTM CFSE。（下排）4G4 OCMSTM与LCX OCMSTM CFSE。使用DAPI（蓝色）（右列）或不使用DAPI（左列）。比例尺= 5μm
4 运用OcmsTM的捕获分泌人抗PV mAb的杂交瘤
为了测试LCX OCMSTM筛选的杂交瘤是否具有表达有活性的人IgG能力，使用OCMSTM方法评估这些杂交瘤中PV特异性IgG的分泌，在单克隆抗体捕获过夜后测试PV结合。将LCX OCMSTM，8C5 OCMSTM或PV OCMSTM细胞与兔F（ab'）2抗人IgG（AB15）培养。并与生物素化的Sabin III型PV孵育1小时，然后用Alexa Fluor488®链霉亲和素（AB3）检测结合的PV（图3（a））。所有的PV杂交瘤克隆都有许多带有绿色荧光的细胞，通常不对称地呈帽状分布，而LCX OCMSTM和8C5 OCMSTM杂交瘤则没有。通过流式细胞仪分析了这些细胞的PV结合，并将其与LCX OCMSTM和8C5 OCMSTM细胞系进行了比较。（图3（b））。接下来，测试了Anchor表达和人类mAb捕获。双阳性人群的范围为47.6–85.8％，而LCX OCMSTM约为3％：8C5，85.8％；3A3，62.7％；4A8，49.0％；5E12，47.6％；1A9，56.5％；5H3，82.7％；5F6，54.7％；4G4，占79.8％（图3（c））。在蜘蛛图中比较这三个测量值，可以对mAb表达的稳定性，功能性锚蛋白水平和抗原结合活性进行视觉，定性评估（图3（d））。
图3. III型PV与分泌人抗PV IgG mAb的OCMSTM杂交瘤的结合。（a）将杂交瘤与兔F（ab′）2抗人IgG（AB15）孵育过夜，然后与生物素化的PV孵育。用Alexa Fluor488®链霉亲和素（绿色）（AB3）检测到PV。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺= 5μm。（b）如（a）所述制备杂交瘤，但是用APC链霉亲和素（AB4）检测生物素化的PV，并通过流式细胞术分析细胞。（c）将杂交瘤与兔F（ab′）2抗人IgG（AB15），然后与生物素化的蛋白A（AB12）一起孵育过夜。然后用APC F（ab′）2抗兔IgG（AB5）和Alexa Fluor488®链霉亲和素（AB3）通过流式细胞术评估结合的兔和人抗体。（d）将显示与PV（绿色），兔IgG（蓝色）和人IgG（红色）结合的杂交瘤的百分比收集到蜘蛛图中。
使用OCMSTM克隆抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎（ANRE）的人IgG，首先测试了在OCMSTM免疫复合物中显示的mAb的ATD。将LCX OCMSTM细胞与RAH（AB14）结合，然后与人抗NMDAR mAb（5F5）或6A mAb（对肉毒杆菌毒素具有特异性的人同种型对照mAb）结合。将它们与生物-微粒化的ATD和Alexa Fluor488®链霉亲和素（AB3）孵育。共聚焦成像显示暴露于5F5 mA，而不是6A对照mAb的细胞上斑片状的圆周染色（图4（a））。随后进行了杂交瘤实验，将ANRE患者的CD27 + PBMC融合到LCX OCMSTM细胞中。通过荧光显微镜观察细胞，使用有限稀释方法来分离表达人IgG1λmAb，结果显示，3C11 OCMSTM的稳定单克隆杂交瘤细胞与4G4 OCMSTM杂交瘤相反，按上述方法处理的3C11 OCMSTM杂交瘤的共聚焦图像显示ATD结合在细胞周围呈点状红色染色（图4（b））。通过在293T-ATD细胞和原代大鼠海马神经元上进行测试，我们确认了3C11 mAb的抗原结合特异性（图4（c–d））。
图4.分泌特异于NMDAR的人类抗体的杂交瘤3C11 OCMSTM。（a）将LCX OCMSTM细胞与RAH（AB14）和5F5 mAb（NMDAR特异性）或6A mAb（同种型对照）一起孵育，然后将生物素化的NMDAR ATD和Alexa Fluor488®链霉亲和素（AB3）孵育，并通过共聚焦显微镜。显示的细胞仅ATD染色（左列）或与DAPI合并（右列）。（b）比较了3C11 OCMSTM和4G4 OCMSTM杂交瘤与RAH（AB14）孵育过夜后与生物素化ATD的结合。用Alexa FluorTM 555链霉亲和素（AB18）检测到结合的ATD。显示的细胞仅具有ATD染色（左列）或与DAPI合并（右列）。（c）比较了纯化的3C11和6A人IgG与293T-ATD细胞系的结合。用Alexa FluorTM 555抗人IgG（红色）（AB10）检测到结合的人IgG。用商品化的NR1 mAb（AB20）和Alexa Fluor488®山羊抗小鼠IgG（AB9）（绿色）检测到ATD。右栏中显示了包含DAPI染色（蓝色）的合并图像。（d）比较3C11和6A mAb与培养的14日龄原代大鼠海马神经元的结合。除了使用不同的市售NR1 mAb（AB19）（绿色）以外，按照4c的方法对细胞进行染色。人IgG显示为红色，右列显示包含DAPI染色（蓝色）的合并图像。比例尺= 10μm
6 OCMSTM用于快速评估重组IgG表达和抗原结合
为了测试OCMSTM是否可用于评估贴壁细胞中异位表达的mAb的表达和抗原结合，我们在293T细胞中表达了Anchor蛋白，从而创建了293T OCMSTM。将293T OCMSTM细胞与RAH（AB14）和1B8 mAb孵育，然后与APC抗兔IgG（AB5）和Alexa Fluor488®抗人IgG（AB1）孵育。流式细胞仪显示出83％的双阳性人群（图5（a））。与在OCMSTM融合蛋白上观察一致（图1（c）），在RAH存在下，293T OCMSTM细胞仅结合人IgG（图5（b））。用表达mAb A12的Ig重链和轻链的质粒转染了293T OCMSTM和293T细胞，我们将细胞与RAH（AB14）和Alexa Fluor488®抗人IgG（AB1）孵育，并通过共聚焦显微镜观察细胞（图5（c））。比较了有和没有A12质粒转染的生物素化I型PV与293T OCMSTM细胞的结合（图5（d ））。约43％的转染细胞结合PV，而未转染的细胞均未结合。这些结果表明，OCMSTM方法可用于评估贴壁细胞表达的重组mAb。
图5.功能性scFv Anchor在293T细胞表面的表达。（a）通过流式细胞仪分析293T细胞和293T OCMSTM细胞捕获的兔和人IgG。（b）在以下条件下测试293T OCMSTM细胞与人IgG（1B8 mAb）的结合：（左图）添加人IgG，有或没有RAH（AB14），（右图）RAH（AB14）（c）用编码结合I型和II型PV的A12 mAb的质粒转染293T OCMSTM（左栏）或293T细胞（右栏），用Alexa Fluor488®抗人IgG（AB1）检测结合的人IgG。共焦图像显示为DAPI染色（蓝色）（下排），没有DAPI染色（上排）。比例尺= 10μm。（d）将转染的（TX）（右图）和未转染的（UT）（左图）的293T OCMSTM细胞与RAH（AB14）孵育过夜，用胰蛋白酶从板中移出，与生物素化的I型脊髓灰质炎病毒（PV1）和APC链霉亲和素（AB4），并通过流式细胞仪分析。
本研究报道了一种新型的利用荧光成像技术，分析杂交瘤和瞬时转染的细胞分泌单克隆抗体的on-cell检测系统，OCMSTM方法的基本组成部分是分泌细胞表面的Anchor分子和结合Anchor分子并捕获细胞分泌的mAb的Linker分子。mAb显示在细胞表面，就可以借助荧光显微镜和流式分析mAb的表达水平，结合活性和其他的一些特征。在OCMSTM方法中，Linker分子还可以充当竞争者，如果在培养液中过量提供Linker，它将防止mAb与非分泌细胞上的Anchor分子结合，提高了反应特异性，减少了假阳性。OCMSTM为杂交瘤的筛选效率提供了新的方法和思路。
Puligedda R D, Sharma R, Al-Saleem F H, et al. Capture and display of antibodies secreted by hybridoma cells enables fluorescent on-cell screening[C]//MAbs. Taylor & Francis, 2019, 11(3): 546-558.
指导老师：王战辉
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