免疫检查点是防止免疫细胞变得过度活跃的基因，例如T细胞相关的PD-1和CTLA-4，它们本质上是细胞的刹车，防止过度激活扩增。那么自然杀伤NK细胞上会不会也有类似“刹车”的基因？如果能找到这些刹车并关闭它们，是否有助于细胞浸润实体瘤，提高CAR-NK的抗肿瘤活性？
2024年6月25日，Yale University发表在《Nature Biotechnology》上的一篇文章In vivo AAV–SB-CRISPR screens of tumor-infiltrating primary NK cells identify genetic checkpoints of CAR-NK therapy 详细地研究了NK细胞上的检查点，并发现了一个名为CALHM2的基因。敲除了NK细胞中的CALHM2基因使自然杀伤细胞在癌症杀伤力、肿瘤浸润效率以及产生抗肿瘤细胞因子的效率上都有所提升。
为了寻找能增强NK细胞在肿瘤中活性的相关基因，研究人员对小鼠原代自然杀伤(NK)细胞进行体内CRISPR敲除(KO)筛选，将这些突变细胞置于患有四种不同肿瘤（黑色素瘤、乳腺癌、胶质母细胞瘤和胰腺癌）的小鼠中，以识别哪些突变体能够侵入并积累在肿瘤中。
分析单细胞组学的差异表达基因以及在外周血原代NK细胞中自然表达的基因之间的交集，发现CALHM2是唯一作为共同靶点出现的基因。
大多数NK亚群在肿瘤样本中Calhm2的平均表达量和基因检出率均下降。尽管CALHM2在NK细胞中的作用尚不清楚，但已发现它能调节小胶质细胞的促炎活性。
新鲜分离的小鼠原代NK细胞中CALHM2蛋白表达相对较低，在扩增的NK细胞中显著上调，Calhm2 KO并未影响小鼠原代NK细胞的增殖。这说明CALHM2蛋白水平在NK细胞中会被调控。类似T细胞上的检查点。
Calhm2-KO CD45.2供体NK细胞回输小鼠体内，转移48小时，Calhm2 KO显著增加了肿瘤中供体CD45.2+ NK细胞的数量，而脾脏中NK细胞的数量没有变化。
与不同癌细胞系的共培养试验评估了Calhm2-KO NK细胞的体外细胞毒性结果显示，与载体对照NK细胞相比，Calhm2-KO NK细胞对所有测试的细胞系（在效应细胞与目标细胞（E:T）比为1:1的情况下）具有显著增强的细胞裂解能力。
文章构建了抗HER2-CAR-NK92-hIL-2细胞（针对抗原HER2，并表达IL2因子），以评估其体内外的抗肿瘤功能及CALHM2敲除的影响。
CALHM2敲除显著增强了抗HER2-CAR-NK92-hIL-2细胞对HER2+ MCF-7-PL-HER2-OE、MCF-7-PL和HT29-GL癌细胞的细胞毒性。
利用实体瘤模型（HT29-GL异种移植到NSG小鼠中）测试了CALHM2-KO的抗HER2-CAR-NK92-hIL-2细胞的体内疗效。对照组抗HER2-CAR-hIL-2-NK92细胞对HT29肿瘤没有显著的体内疗效，相比之下，CALHM2-KO的抗HER2-CAR-hIL-2-NK92细胞具有强大的体内抗肿瘤效果。
总之，这些体内外数据共同证明了CALHM2的敲除显著增强了CAR-NK92细胞的抗肿瘤活性，包括细胞毒性、脱颗粒、浸润以及整体的抗肿瘤效果。
为了进一步扩展CALHM2在更具临床相关性NK细胞疗法中的应用，从三位不同健康人体外周血中分离并扩增人原代NK细胞，并用CRISPR敲除CALHM2基因。然后和不同肿瘤共培养。
CALHM2敲除显著增强了对不同癌细胞系（包括K562-GL白血病细胞系和实体瘤细胞系HT29-GL和MCF-7-PL）的NK细胞细胞毒性杀伤作用。
CALHM2-KO原代人NK细胞的效应细胞因子（干扰素-γ（IFNγ）和肿瘤坏死因子-α（TNFα））产生显著增加。
由于NK细胞中CALHM2的基因调控机制很大程度上未知，文章在静息状态（基线，未刺激条件）和经HT29-GL细胞刺激6小时后的状态下（刺激条件），对CALHM2-KO（CALHM2 gRNA）和对照（AAVS1 gRNA）人外周血来源的NK细胞进行了全量mRNA测序。
主要观察到与压力响应和细胞死亡相关的途径在CALHM2-KO的NK细胞中富集。
在未刺激条件下，CALHM2-KO NK细胞具有更强的应激反应基因表达（缺氧反应）和上调的抗凋亡基因，如NKG2D。在刺激条件下，CAHLM2-KO NK细胞具有更高Wnt信号通路基因表达，如CTNND1。
CAR-NK的临床效果不是很理想，扩增受限，很难浸润肿瘤，目前的策略是共表达IL15，给NK细胞补充弹药能量，防止衰竭或者敲除负调控因子如CISH，整体上的策略是不如CAR-T多；本文通过体内CRISPR筛选和单细胞测序，识别了CALHM2作为NK细胞功能的内源性抑制因子，其敲除能显著增强NK和CAR-NK细胞的抗肿瘤活性，为开发新型高效癌症免疫疗法提供了靶点。
参考文献：Peng, L., Renauer, P.A., Sferruzza, G. et al. In vivo AAV–SB-CRISPR screens of tumor-infiltrating primary NK cells identify genetic checkpoints of CAR-NK therapy. Nat Biotechnol (2024). https://doi.org/10.1038/s41587-024-02282-4
