多能干细胞（PSC）是一种能够发育成各种细胞类型的干细胞。 由于PSCs具有自我更新和分化（成熟）成几乎任何给定类型的组织的独特能力，PSC可用于修复因年龄、创伤或疾病而不可逆转的器官。
一旦PSC分化成干细胞治疗的特定类型，在将分化的干细胞回输人体后，肿瘤形成的可能性很高。为了使基于PSC的疗法取得成功，当务之急是通过在移植前识别培养物中潜在的未分化细胞，来最大限度地降低肿瘤发生的风险。
在此背景下，由日本奈良科学技术研究所的Atsushi Intoh和Akira Kurisaki领导的研究团队最近在干细胞治疗和肿瘤发生方面取得了突破性发现，其结果发表在《Stem Cells Translational Medicine》： 主要论述了EPHA2 蛋白可以区分未分化并具有致瘤风险的多能干细胞，为提高 PSCs 移植安全性提供了潜在的新方法。
EPHA2 是一种受体酪氨酸激酶，在胚胎早期发育和疾病发生过程中发挥重要作用，参与细胞增殖、迁移等多种生物功能。在癌症领域，EPHA2 是关键的功能性受体之一，通过调控细胞间相互作用、增殖和迁移等，促进肿瘤发生。因此，EPHA2 被认为是识别和追踪侵袭性肿瘤的重要细胞表面标志物。
早期胚胎的单细胞 RNA 测序分析表明，Epha2 在囊胚阶段表达高，随着发育的进程表达降低，小鼠 iPSCs 重编程后 Epha2 表达增加。这些结果表明 EPHA2 可以作为小鼠多能干细胞的标志物。
图 EPHA2 蛋白在未分化的小鼠胚胎干细胞表面表达，分化过程中表达下调
抑制 EPHA2 后，小鼠胚胎干细胞的形态发生明显变化，原本圆形的克隆体几乎消失，未分化状态特有的碱性磷酸酶活性也降低，EPHA2 的缺失也会导致胚胎干细胞的自主分化。过表达 EPHA2 可以使 EPHA2 敲减的小鼠胚胎干细胞恢复细胞形态和 Oct4 蛋白表达。EPHA2 不仅在维持胚胎干细胞未分化状态方面发挥关键作用，而且还能抑制胚胎干细胞分化。
图 敲低EPHA2 蛋白会导致小鼠胚胎干细胞自主分化
文章不仅研究了小鼠胚胎干细胞，还检测了人类多能干细胞 (iPSCs) 未分化状态下 EPHA2 的表达模式。随着人类 iPSCs 自主分化，EPHA2 mRNA 水平也显著下降 。然而，通过流式细胞术 (FACS) 分析发现，约 12% 的未分化 iPSCs 细胞表面显示出 EPHA2 表达的异质性 。对无 feeder 培养条件下培养的 iPSCs 菌落进行免疫荧光染色后，可以在周边区域检测到明显的 EPHA2 蛋白。
图 EPHA2 在人类多能干细胞的异质亚群中的表达
文章研究了未分化细胞中 EPHA2 和 OCT4 的共表达。构建了一个带有 Oct4 启动子-EGFP 标签的小鼠胚胎干细胞系 (Oct4-egfp)，以便可视化未分化状态下的 OCT4 表达。
利用 EPHA2 抗体介导的磁分离 (MACS) 技术，从混合的 Oct4-egfp ESCs 中分离 EPHA2 阳性细胞。这些细胞培养于含或不含 LIF 的培养基中，培养 7 天后，EGFP 阳性细胞数量显著减少 。由此可见，EPHA2 可作为一种有效的细胞表面标志物，用于识别未分化的小鼠胚胎干细胞。
图 去除EPHA2阳性后， Oct4-egfp细胞显著减少
作者将小鼠胚胎干细胞诱导分化为肝细胞谱系 ，在第 10 天和第 14 天，分别观察到了肝细胞前体标志物甲胎蛋白 (alpha fetoprotein) 和成熟肝细胞标志物白蛋白 (Albumin) 的表达。值得注意的是，经过相同分化过程后，Oct4-egfp ESCs 在第 14 天仍有约 1% 的 EGFP 阳性细胞残留 。这表明即使经过长时间分化，仍存在未分化细胞。
图 即使经过长时间分化，仍存在未分化细胞
由于移植到免疫缺陷小鼠体内时未分化细胞存在致瘤风险，我们对 ESC D3 进行肝细胞分化，然后分别使用分离 (EPHA2-MACS) 和不分离 EPHA2 阳性细胞的方法处理细胞，并将处理后的细胞移植到 SCID 小鼠体内。皮下睾丸移植术后 4 周，解剖小鼠后观察到由三个胚层来源的细胞组成的畸胎瘤，小肠周围的囊状腺中也观察到了畸胎瘤形成。这证实了即使经过长时间的诱导分化，仍然存在未分化细胞的污染。
然而，利用 EPHA2-MACS去除 EPHA2 阳性细胞显著减轻了畸胎瘤的形成 ，表明 EPHA2 可以作为一种有效的抗原来识别分化细胞群中的畸胎瘤形成细胞。
图 EPHA2 可识别具有致瘤性的未分化细胞
通过流式细胞术分离的 EPHA2 阳性细胞 (补充图 10A 和 10B) 在肝细胞谱系分化过程中维持较高的 OCT4 和 NANOG mRNA 水平，表明这些细胞是未分化细胞并具有致瘤性。因此，EPHA2 可作为一种潜在的细胞表面标志物用于识别未分化和致瘤性的 iPSCs。
图 EPHA2 阳性细胞在肝细胞谱系分化过程中有较高的 OCT4 和 NANOG mRNA
总之，本研究发现 EPHA2 可作为小鼠和人类未分化多能干细胞 (PSCs) 的一种有前途的表面标志物。EPHA2 表达与高水平的 OCT4 和 NANOG（关键多能性标志物）一致。
研究关键点：
EPHA2 允许有效检测和去除未分化 PSCs，这些细胞在移植后会形成肿瘤。这对于更安全的细胞治疗应用至关重要。
EPHA2 在识别分化过程中的残留未分化细胞方面优于传统的标记物，例如 TRA1-81。
EPHA2 在维持小鼠胚胎干细胞多能性中的作用表明其可能参与早期人类胚胎发育。
EPHA2可最终成为选择未分化干细胞的潜在标志物，为降低再生治疗中干细胞移植后的肿瘤发生风险提供了一种有价值的方法。
参考文献：Atsushi Intoh, Kanako Watanabe-Susaki, Taku Kato, Hibiki Kiritani, Akira Kurisaki, EPHA2 is a novel cell surface marker of OCT4-positive undifferentiated cells during the differentiation of mouse and human pluripotent stem cells, Stem Cells Translational Medicine, 2024;, szae036.
