Nat. Rev. Immunol. (IF 67.7)万字长文：深刻理解TCR 信号传导机制，设计新型 CAR，提高疗效

所有目前 FDA 批准的 CAR 都包含 ζ 的细胞质尾部，而缺少 TCR 的其他尾部。ζ 链是第一个在 CAR 形式中进行测试的 TCR 衍生链，可能是因为 ζ 包含三个 ITAM，而 CD3ε、CD3γ 和 CD3δ 链每个只包含一个 ITAM，并且当时还没有发现其他非 ITAM 信号基序。实际上，ζ 尾部支持第一个嵌合构建体中的 T 细胞激活 。CD3ε、CD3γ 和 CD3δ 链在 CAR  中激活 T 细胞的潜力直到最近才得到确认。CAR 的结构及其信号域。

CAR 与其配体的结合如何导致细胞内信号传导尚不完全清楚，并且其研究远不如 TCR。鉴于 CAR 是融合来自不同受体的单个结构域的结果，很难想象构象变化可以从抗原结合位点转移到细胞内尾部。TCR的构象调节的一个重要方面是细胞质尾部被屏蔽，从而在没有配体结合的情况下保持 TCR 失活。相比之下，CAR 在没有抗原的情况下具有可测量的强直信号，这将在后面更详细地讨论，这表明 CAR 的 ITAM 可能持续暴露于激酶并作为底物。然而，配体结合仍然诱导信号克服这种组成型强直信号以介导特异性激活。因此，配体诱导的 CAR 聚集和磷酸酶的排除可能是 CAR ITAM 磷酸化高于强直信号的原因。聚集是否会导致随后的结构变化尚不清楚。

使用第二代 CAR 构建体测试了配体诱导的 CAR 二聚化的作用，表明高亲和力 CAR 的二聚化在促进 CAR 信号传导中没有关键作用。许多 CAR 在配体结合发生之前可能已经以二聚体或寡聚体的形式存在于细胞表面，这取决于它们包含的 scFv、接头和跨膜区域 。然而，不能排除在其他系统中，CAR 二聚化可能会增强信号传导。

值得一提的是，呈递细胞和 T 细胞的膜之间的距离增大，当配体长度增加时，早期 CAR 的信号传导效率较低。这些结果证明了 CAR 框架中尺寸的至关重要性，当 CAR 靶向小抗原或大抗原的膜近端区域时，它们效果更好。

在 TCR 中，激酶 LCK 在使 ITAM 磷酸化方面比相关的激酶 FYN 起着更重要的作用。然而，对于 CAR，LCK 和 FYN 的作用可能不同，因为已表明基于第二代 CD28 的 ζ CAR 被 FYN 磷酸化，而基于 4-1BB 的 ζ CAR 被 LCK 磷酸化。因此，共刺激结构域的确切性质可能会影响 CAR 的信号启动。

CAR 和 TCR 之间的另一个显着差异是 CAR 与其配体的结合亲和力要高得多，因为 scFv 来自亲和力成熟的抗体。scFv 对其配体的亲和力在纳摩尔范围内，而 pMHC-TCR 亲和力在微摩尔范围内。然而，矛盾的是，CAR 与其配体的更强结合并没有转化为增强的信号传导。TCR 在识别少数激动剂 pMHC 后可以触发 T 细胞激活。

相比之下，通过 CAR 刺激 T 细胞（与代数无关）所需的抗原浓度比通过 TCR 刺激 T 细胞高 100-1,000 倍。当用相同的配体浓度刺激 CAR 和 TCR 时，TCR 被更有效地磷酸化，ZAP70 被更有效地募集到受体。同样，与 TCR 刺激相比，衔接蛋白 LAT 和磷脂酶 PLCγ 仅被 CAR 刺激微弱地磷酸化。CAR 的这种低敏感性在肿瘤仅显示低水平靶向抗原的临床情况下可能是一个问题。可以参考之前的文章：Science子刊：精彩绝伦的CAR分子设计，可识别只有1-2个抗原分子的癌细胞。（点击打开）

此外，CAR 的持续强直信号传导可能导致 T 细胞无反应、衰竭和体内持久性降低。强直信号传导可以发生在各种 CAR 设计中，但在具有 CD28 胞质尾部的基于第二代 ζ 链的 CAR 中尤为明显。当前基于 ζ 链的 CAR 缺乏信号终止机制，例如负调节剂的募集（例如在 TCR 信号传导中发挥作用的 CSK 或 SHP-1）和有效的受体内化，这可能会导致介导过早衰竭和过度细胞因子产生 (CRS) 的过度激活。

已经研究了许多结构修饰，使 CAR 能够真实地模拟 TCR 激活和随后的下游信号传导，以提高 CAR T 细胞的敏感性和功效。迄今为止采用的策略可分为三类：

(1) 将 CD3 链中存在的信号基序引入到当前基于 ζ 链的第二代 CAR 中；

(2) 用含有 ITAM 的替代细胞质尾部取代 ζ 链；

(3) 使用完整的 TCR 的方法，其理念是最佳地利用该受体的信号传导潜力，包括其对信号传导的结构调节以及 CD3ε、CD3γ、CD3δ 和 ζ 细胞质基序的多样性。

要注意的是TCR 中给定信号基序的功能性在 CAR 的背景下可能会或可能不会被保留，这需要专门的研究。传统上，ITAM 磷酸化是通过蛋白质印迹法测定的，使用抗磷酸化酪氨酸单克隆抗体 4G10，该抗体检测 ζ 链细胞质尾部的磷酸化，但不检测（或非常弱地检测）CD3 亚基的磷酸化。然而，在 TCR 触发后，定量磷酸化蛋白质组学已经证明 CD3ε、CD3γ 和 CD3δ 也被磷酸化。

TCR 中的十个不同 ITAM 具有定量和定性作用。关于 ITAM 的数量，功能性 TCR ITAM 少于七个的小鼠在 T 细胞发育过程中 TCR 功能失调，导致中枢耐受缺陷和自身反应性 T 细胞发育。与此一致的是，在表达缺乏所有六个 ζ ITAM 的 TCR 的转基因 T 细胞中，TCR 介导的信号和抗原刺激后的 T 细胞增殖没有改变，但胸腺中的阳性 T 细胞选择受到影响。不同的 ITAM 在 TCR 的背景下也具有特定的作用，表现出不同的功能。消除 ITAM 多样性，同时保持 ITAM 数量不变，会严重损害 TCR 功能。

首先，LCK 和 CD45 对不同的 ITAM 表现出偏好。例如，LCK 使第一个 CD3ε ITAM 酪氨酸的磷酸化速度比第二个快，而 CD45 使第二个和第三个 ζ ITAM 的去磷酸化效果比第一个 ITAM 好。其次，各个双磷酸化的 TCR ITAM 对 ZAP70 表现出不同的亲和力。在所有 ITAM 中，CD3ε ITAM 对 ZAP70 的亲和力最低。

实际上，ITAM 中的两个酪氨酸可能不会同时被磷酸化。双磷酸化的 ITAM 与 ZAP70 的串联 SH2 结构域相互作用。当单磷酸化时，ITAM 充当具有单个 SH2 结构域的信号分子的对接位点。不同的 ITAM，甚至 ITAM 中的每个酪氨酸，都可能表现出不同的相互作用伙伴。例如，CD3ε 和 ζ ITAM 中的两个酪氨酸表现出优先的磷酸化顺序，而 CD3γ ITAM 中的两个酪氨酸似乎被平均磷酸化。同样，CD3ε ITAM 中的两个酪氨酸和第一个 ζ ITAM 中的两个酪氨酸在功能上是不同的。例如，在早期的 CAR 形式中，第一个 CD3ε 酪氨酸处的苯丙氨酸取代消除了该 ITAM 的信号转导，而第二个酪氨酸的取代则没有。实际上，CD3ε ITAM 与 TCR 的其他 ITAM 完全不同。它的氨基末端酪氨酸是 PRS 的一部分，而羧基末端酪氨酸是 RK 基序的一部分。在 TCR 激活后，很大一部分 CD3ε ITAM 在 N 末端酪氨酸处被单磷酸化。这有两个后果：单磷酸化促进抑制性激酶 CSK 的募集，并阻止 NCK 与 PRS 结合。这两个事件可能有助于抑制 TCR 的信号传导。

目前批准的第二代 CAR 利用了包含三个 ITAM 的 ζ 链细胞质尾部，并且 ITAM 磷酸化对于 CAR 的信号启动至关重要 。具有越来越多的 ITAM 的早期 CAR 构建体表明，增加 ITAM 的数量增强了信号转导的效率。尽管如此，三个 ζ 链的 ITAM 可能对 CAR T 细胞的抗肿瘤功能有不同的贡献。已经表明，第二个和第三个 ζ 链的 ITAM 对于识别表达高水平同源抗原的肿瘤的 CAR T 细胞来说是可有可无的，而这些 ITAM 可能对于识别呈现低水平抗原的肿瘤变得重要，从而降低了 CAR 激活的抗原密度阈值。

2020 年描述的一种新型 CAR 构建体将 CD3ε 尾部包含在现有的基于 ζ 链的第二代 CAR 中，从而产生具有四个 ITAM 的构建体 (εζCAR)。这些 εζCAR 在临床前小鼠模型中优于现有的基于 ζ 的第二代 CAR，尽管尚未研究这是否是由于 ITAM 数量增加所致。然而，εζCAR 中 CD3ε ITAM 的单磷酸化可能解释了这些结果，因为它促进了 LCK 募集到 CAR 的 RK 基序并促进了与 CSK 和 PI3K 的相互作用。除了 TCR 衍生的序列外，新型 εζCAR 还包含 4-1BB 尾部或 CD28 尾部，表明这些发现与所使用的共刺激结构域无关。

2023 年，设计了一组新的基于第二代 4-1BB 的 CAR，以系统地比较每个 TCR 细胞质尾部作为 CAR 激活信号单元，这里称为 CD3CAR。这些 CAR 中的每一个都在体外有效地激活了 T 细胞，这表明一个 ITAM 足以在抗原识别后激活下游信号级联反应。然而，表达含有 CD3δ、CD3ε 或 CD3γ 尾部的 CAR 的 T 细胞在体内使用“金标准”Nalm6 B 细胞白血病模型优于传统的 ζ 链 CAR T 细胞。这一结果是否可以用不同的 ITAM 序列、仅存在一个 ITAM 或每个 CD3 亚基尾部中存在的非 ITAM 基序来解释尚不清楚。发现 SHP-1 与 CAR 环境中的 CD3δ 尾部结合（CD3δCAR T 细胞），并且这些细胞在多次遇到肿瘤细胞后保留了更好的“干细胞样”特性和功能，这表明更平衡和受约束的信号可能有助于更好地控制肿瘤。

ζ 链和 CD3ε 细胞质尾部都包含带正电荷的 BRS，因此容易发生离子相互作用。ζ 尾部的 BRS 是否与第二代 CAR 环境中的质膜结合仍有待研究。在这些构建体中，ζ 尾部与来自共刺激受体的信号结构域融合，这可能会阻止与膜的结合，这可能解释了为什么 ζ 尾部的 ITAM 在没有抗原与 CAR 结合的情况下被磷酸化。迄今为止，尚未鉴定出 ζ BRS 的其他相互作用原件。相比之下，CD3ε 的 BRS 与几种信号蛋白结合，包括 LCK、PI3K 和激酶 GRK2。这些相互作用可能解释了在 TCR 环境中突变 BRS 时观察到的信号传导减少。

包含 CD3ε 和 ζ 尾部的第二代 CAR 表现出增强的抗肿瘤活性并促进 T 细胞的持久性。这些构建体包含 CD3ε 和 ζ 尾部中存在的所有信号结构域，并且可能更有可能更好地模拟响应 TCR 信号传导而发生的平衡信号事件。

值得注意的是，CD28 和 4-1BB 共刺激结构域都包含近膜 BRS。CD28 具有两个 BRS，它们促进与质膜内叶和 LCK 的相互作用。虽然这些 BRS 已被证明对胸腺发育至关重要，但它们在第二代 CAR 环境中的作用仍未得到探索。同样，4-1BB 的近膜 BRS 还有待研究。

CD3ε 细胞质尾部的 RK 基序被鉴定为与 LCK 的 SH3 结构域结合的新型基序。该基序的突变消除了配体诱导的 LCK 募集到 TCR 并影响了 TCR 磷酸化以及 T 细胞发育。RK 基序与 CD3ε ITAM 重叠，共享 C 末端酪氨酸。结构分析表明，C 末端酪氨酸的 OH 基团与 LCK SH3 结构域中的丝氨酸之间形成了氢键。这种相互作用在 C 末端酪氨酸磷酸化后被消除，这表明 RK 基序仅在 CD3ε ITAM 未磷酸化或在 N 末端酪氨酸处单磷酸化时才与 LCK 相互作用。在所有 TCR ITAM 中，CD3ε ITAM 显示出最明显的单磷酸化模式：N 末端酪氨酸比 C 末端酪氨酸显示出更快、更频繁的磷酸化。

RK 基序在 CAR 环境中的作用首先使用具有 CD3ε 和 ζ 尾部的含有 4-1BB 的 CAR 进行研究。RK 基序促进 LCK 募集到 CAR，抗原结合后 CAR 磷酸化，并在体外和体内增强抗肿瘤活性。后来，RK 基序的作用也在具有 CD3ε 尾部而不是 ζ 的 CD3CAR 环境中得到解决）。RK 基序增强了 T 细胞活化、钙流入和细胞毒性。因此，与第二代 CAR 相比，含有 CD3ε 和 ζ 尾部的 CAR 在几个方面更接近地模拟了 TCR 激活：通过募集 LCK 使 CAR 磷酸化，募集 PI3K 以促进 AKT 信号传导，以及募集 CSK 以使用在 TCR 环境中活跃的机制自我抑制 CAR T 细胞激活。所有含有 CD3ε 尾部的 CAR 在临床前小鼠模型中均优于基于 ζ 的 CAR。

CD3γ 胞质尾部包含一个靠近细胞膜的 LL 基序，它与附近丝氨酸的磷酸化一起参与了抗原诱导的 TCR 信号传导后的 TCR 内化 ，并且对控制 T 细胞稳态和对病毒感染的反应很重要 。最近的一项研究通过在包含 CD3γ 尾部而不是 ζ 尾部的 4-1BB 为基础的第二代 CAR (CD3CAR) 中突变该 LL 基序，探索了该 LL 基序在 CAR 中的重要性。此外，在 CD3δ 中发现的类似的靠近细胞膜的 LL 基序也被突变；然而，该基序缺乏 LL 基序前五个氨基酸处的丝氨酸，因此被认为不参与 TCR 内化。两种 LL 基序突变的 CAR 均显示出显着增加的表面表达，并且它们在激活 T 细胞和杀死靶细胞方面也更有效。因此，CD3γ 和 CD3δ 的 LL 基序都参与调节 CAR 表达水平，进而影响这些 CAR 的功能。

一种新型的CAR，叫作“Bypass CAR”，它可以通过直接整合TCR下游的信号分子来绕过TCR的信号部分，如ITAMs。最早的绕过CAR是在1990年代设计的，用来找出哪些激酶对于T细胞的激活是至关重要的。这些早期的CAR中，CD16被连接到LCK、FYN、SYK或ZAP70上。只有含有SYK的绕过CAR能在受到刺激时启动细胞杀伤功能。最近，设计了一系列抗肿瘤的bypass CAR，它们直接与LCK、FYN、ZAP70的激酶部分（ZAP70KD）、LAT、SLP76和PLCγ1相连，而不使用任何共刺激域。ZAP70KD-和PLCγ1-CAR都能促进T细胞的激活，其中ZAP70KD-bypass CAR在实体瘤小鼠模型中展现出了比第二代4-1BB ζ CAR更优秀的肿瘤控制能力。

ZAP70KD绕过CAR能在缺少TCR和LCK的细胞中促进T细胞激活，但在缺少SLP76或LAT的细胞中则不行，这表明TCR下游信号路径的顺序保持不变。最近，通过在ZAP70的靶向部分和激酶部分之间加入来自LAT或SLP76的衔接域，开发出了第二代bypass CAR。不过，这些结构显示了过度的基础信号活动，因此没有继续研究。作为替代方案，在ZAP70激酶部分之前加上CD28信号域，结果在Nalm6肿瘤小鼠模型中达到了与传统4-1BB第二代ζ CAR相似的肿瘤缓解效果，而且比传统的CD28第二代ζ CAR更持久。

几种不同的TRuCs，通过将抗肿瘤的scFv与TCRα、TCRβ、CD3ε或CD3γ融合。然而，将scFv与CD3δ或ζ链融合会阻止或减少TCR在细胞表面的组装和表达，这另一方面，将scFv与TCRα或TCRβ链融合可能导致与内源性TCRβ或TCRα链错配，从而产生新的TCR特异性，可能会使CAR T细胞倾向于自身免疫。

因此，选择了一种结构，将抗肿瘤的scFv与CD3ε链融合，生成了εTRuC T细胞。εTRuC T细胞在造血和实体瘤异种移植模型中比使用4-1BB或CD28共刺激尾部的第二代CAR T细胞更有效。最可能的原因是εTRuC诱导的信号传递比CAR诱导的更接近于TCR介导的激活。此外，εTRuC T细胞在实体瘤模型中的持续时间比第二代CAR T细胞长，并且显示出更快的肿瘤渗透。所有这些发现都与εTRuCs传递的信号比CAR驱动的信号更像TCR是一致的。最后，εTRuC-T细胞对低抗原水平的敏感度是第二代基于CD28的ζ CAR T细胞的十倍，但仍未达到未修饰的TCR的极高敏感度，原因尚不清楚。

近年来，出现了许多策略，这些策略是用替代的配体结合域替换TCR的可变区。例如，完整Fab片段被连接到了TCRγ和TCRδ链的恒定域上，生成了抗体TCR（AbTCR）。选择TCRγδ链而不是TCRαβ链是为了避免引入的链与内源性链错误配对，从而防止产生新的特异性。尽管在体外，表达AbTCR的T细胞杀死肿瘤细胞的效果与第二代CAR相似，但它们释放的细胞因子较少，表达的耗竭标志物也较少。在体内，AbTCR-T细胞比基于CD28和4-1BB的ζ链CAR T细胞更好地控制B细胞肿瘤，产生的细胞因子更少，上调的耗竭标志物也更少。到目前为止，AbTCR只被设计成可以与CD19结合。

早在1980年代，就开始尝试制造一种特殊的受体，这种受体将TCR的可变区域替换成抗体的轻链和重链的可变区域，以此来证明TCR的特异性是由其可变部分决定的。这些早期的尝试被简单地称为早期STAR。后来同样的方法被用于创建合成的TCR和抗原受体（STAR）以及HLA非依赖性T细胞受体（HIT）。

为了防止这些新受体与人体内的TCRαβ链错误配对，设计了一种名为mutSTAR的变异体，它使用了经过突变的小鼠TCRα和TCRβ链。另一种方法是通过基因编辑技术，将引入的TCRβ和TCRα链整合到TCRα基因的位置，以减少HIT平台上的错误配对情况。

在临床前的小鼠模型中，mutSTAR和HIT T细胞对血液肿瘤和实体肿瘤的控制效果比第二代CAR要好，特别是当肿瘤细胞的抗原水平较低时，这种优势更加明显。这意味着mutSTAR和HIT T细胞可能特别适合治疗那些通过降低抗原水平来逃避CAR T细胞攻击的难治性肿瘤。确实，mutSTAR技术对低水平抗原的敏感度与天然TCR相当。研究表明，无论是mutSTAR还是HIT T细胞，它们的敏感度都是CAR的十到百倍。

与TRuC和AbTCR T细胞相比，mutSTAR和HIT T细胞不易出现疲劳状态，存活时间更长，更能深入实体肿瘤。然而，与TRuC和AbTCR T细胞不同的是，mutSTAR和HIT T细胞在遇到肿瘤时，无论是体外还是体内，都会分泌更多的或者相似数量的细胞因子。这可能是因为它们对肿瘤的敏感度更高。

为了进一步发展这一技术，设计了新的mutSTAR受体，这些受体含有两种不同的scFv，可以针对两种不同的肿瘤抗原。此外，还将许多共受体的胞内部分，比如CD40，融合到mutSTAR链上，目的是提高T细胞的增殖能力和持续时间。携带mutSTAR–OX40构建体的T细胞在清除体内肿瘤方面的效果比mutSTAR或基于4-1BB的ζ CAR T细胞更好，这可能使得mutSTAR成为癌症免疫治疗的一个非常有潜力的选择。

为了提高T细胞对抗原的敏感度，设计了一种类似于TCR的合成受体，这种受体包括共受体CD4的胞内部分，以增加T细胞对抗原的敏感性。在这个T细胞抗原耦合器受体（TAC）中，特异性识别肿瘤的scFv与一个抗CD3的scFv相连，后面跟着CD4的跨膜和胞内部分。当这种TAcC结构在T细胞中表达时，理论上可以与TCR结合，将其带到CD4的胞内尾部附近，后者与LCK结合，从而有助于TCR的ITAMs磷酸化。

为了优化TAC，在体外测试了不同抗CD3 scFv的毒性作用和细胞因子分泌情况，最终选择了来自人源化抗体UCHT1的scFv版本。携带这些TAC的T细胞在临床前小鼠模型中表现出比基于CD28的ζ链CAR T细胞更好的固体肿瘤渗透能力和抗肿瘤效果。

当TCR被触发时，T细胞会与抗原呈递细胞和目标细胞形成一个紧密的界面，这被称为免疫突触。免疫突触在纳米尺度上影响T细胞的激活、抗原敏感性和向目标细胞高效传递细胞毒分子。TCR驱动的免疫突触由一系列同心环状聚集的分子组成：TCR和LCK在中心环聚集，而黏附分子（如LFA-1）和肌动蛋白集中在外围环。相比之下，CAR驱动的免疫突触缺乏明显的LFA-1黏附环，这很可能是因为CAR无法充分激活黏附受体以提高抗原敏感度。

虽然CAR在免疫突触处结合的抗原量上超过TCR，但由于LCK介导的ITAM磷酸化和ZAP70激活效率低下，近端激活受到抑制，这限制了CAR T细胞的激活。此外，CAR驱动的信号传递是短暂的，这限制了稳定免疫突触的形成，但有利于CAR T细胞快速脱离并移动到新的目标。尽管这种非传统的免疫突触似乎不会削弱CAR T细胞的细胞毒性，但它对抗原敏感性差异确实很大。

●开发 TCR 类嵌合受体: