大家好，今天分享一篇发表于Food Chemistry的研究性文章，题为“Using
hapten cross-reactivity to screen heterologous competitive antigens for
improving the sensitivity of ELISA”，该文章的工作来自于南昌大学食品学院的赖卫华教授团队。
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【摘要】
本研究根据与19种喹诺酮类似物的交叉反应性（cross-reactivity, CR），成功筛选出适用于提高ELISA灵敏度的异源竞争抗原。用半抗原类似物（CR为0.77%–49.92%）制备的异源竞争抗原显著提高了后续ELISA的灵敏度。与使用NOR0-BSA作为同源包被抗原相比，使用MOX–BSA作为异源包被抗原时，对NOR的检测灵敏度提高了26倍。本研究提出了一种详细的筛选方法，用于选择合适的异源竞争性抗原以提高ELISA灵敏度。其次，作者提出了新的理论工具来估计该方法中使用的半抗原结构，这些工具也可用于提高其他免疫分析方法的灵敏度。
酶联免疫吸附试验（ELISA）操作快速方便已成为快速检测技术中最为常用的方法之一。然而，对各种样品中靶标的检测要求越来越严格，这限制了传统低灵敏度ELISA的广泛应用。
使用异源竞争抗原（heterologous
competitive antigens, HCAs）作为包被抗原可提高ELISA的灵敏度。然而，各种包被抗原的制备非常繁琐。因此，开发一种简单可靠的策略来选择合适的HCA对于提高ELISA的灵敏度是必要的。喹诺酮类药物在兽医学中被广泛用于预防牲畜疾病，滥用喹诺酮类药物可能导致食品样品中存在喹诺酮类药物残留，过量的喹诺酮类药物残留会对消费者产生负面影。并且喹诺酮类药物具有一系列结构类似物，可以探索其异源竞争策略的有效性与ELISA灵敏度之间的关系。在本研究中，作者成功地利用19种喹诺酮类似物的CR筛选出适合提高ELISA灵敏度的HCA。为了进一步探索Ag-Ab亲和力对此目的的影响，作者通过生物层干涉法确定了Ab对不同HCA的亲和力。然后应用分子对接模拟来探索类似物的结构与使用不同HCA作为包被抗原的ELISA系统灵敏度之间的关系。该工作提供了一种快速、方便的方法来选择合适的HCA，从而可以提高任何给定ELISA的灵敏度。
【内容介绍】
1、抗原和抗体制备
作者在诺氟沙星(NOR)的哌嗪环上引入氨基，制备了同源半抗原NOR0，使用戊二醛法合成NOR0-KLH作为免疫原，经过小鼠免疫、细胞融合和筛选制备出了单克隆抗体（mAb）。以另外18个喹诺酮类化合物（Quinolones, QNs）作为异源半抗原，这18种喹诺酮类药物分别是巴洛沙星（BAL）、贝西沙星（BES）、克林沙星（CLI）、达诺沙星（DAN）、恩诺沙星（ENR）、加替沙星（GAT）、吉米沙星（GEM）、莫西沙星（MOX）、那氟沙星（NAD）、萘啶酸（NAL）、诺氟沙星（NOR）、奥比沙星（ORB）、奥索利酸（OXO）、帕珠沙星（PAZ）、培氟沙星（PEF）、普卢利沙星（PRU）、西他沙星（SIT）和司帕沙星（SPA）。使用活泼酯法利用该18个QNs和NOR0原有的羧基分别与BSA直接偶联制备了19种包被抗原，其中NOR0-BSA为同源包被抗原，其余18种QNs-BSA为异源包被抗原，并使用紫外可见光谱证明偶联成功。2、以NOR0-BSA为同源抗原对15种半抗原的灵敏度检测CR的评估以同源抗原NOR0–BSA为包被抗原，测定了每种ELISA方法检测15种半抗原的灵敏度（以IC50表示），结构相似性是影响mAb对不同类似物识别能力的重要因素。NOR0与其他类似物的CR范围很广（表1），这表明NOR0与其他类似物之间的结构相似性。作者推测半抗原的CR越高，结构相似性就越高（CR越低，结构相似性就越低）。本研究中，CR为75.61%-421.53%的半抗原比CR为0.77%-49.92%的半抗原结构相似性更高。值得注意的是，PAZ的CR小于0.01%，表明PAZ与NOR0的结构相似性极低。因此，PAZ分子不易被ELISA系统上的mAb识别。表1. 以同源抗原NOR0–BSA为包被抗原检测15种类似物的ELISA灵敏度和相应的交叉反应
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3、使用19种不同包被抗原测定ELISA中对NOR的检测灵敏度分别以同源抗原NOR0-BSA和其他14种异源抗原作为包被抗原（浓度相同），通过icELISA评估检测NOR的灵敏度。结果如表2所示，以异源抗原NAL-BSA、DAN-BSA、OXO-BSA、PEF-BSA、NAD-BSA、NOR-BSA为包被抗原时，ELISA检测NOR的IC50值均高于同源抗原NOR0-BSA。而以ORB-BSA、BAL-BSA、CLI-BSA、GAT-BSA、BES-BSA、SPA-BSA、MOX-BSA为包被抗原的IC50值均小于同源抗原NOR0-BSA。因此，结果表明以ORB-BSA、BAL-BSA、CLI-BSA、GAT-BSA、BES-BSA、SPA-BSA、MOX-BSA为包被抗原可提高ELISA的灵敏度。这些包被抗原相应半抗原的CRs值在0.77%-49.92%之间，因此以CRs（反映结构相似性）作为指标，选择理想的异源竞争抗原，提高ELISA灵敏度。其中以MOX-BSA为异源包被抗原的ELISA灵敏度比以NOR0-BSA为同源包被抗原的灵敏度提高了26倍（由5.2降至0.2
ng/mL）。
表2. 15种不同包被抗原的ELISA检测NOR的灵敏度![]()
为了进一步验证这一假设，作者又测定了以另外4种异源包被抗原检测NOR的IC50值，如图1所示，PRU、SIT、GEM、ENR的CR分别为1.03%、5.55%、30.21%、128.28%，其对应包被抗原的IC50值分别为0.3、0.5、0.7、7.8 ng/mL。其中，在同源包被抗原下对PRU、SIT、GEM的CR在0.77%-49.92%之间，而对ENR的CR高于49.92%，因此以PRU-BSA、SIT-BSA、GEM-BSA为异源竞争包被原时，ELISA检测灵敏度有了提高，而以ENR-BSA为包被抗原时灵敏度降低。因此，证明了利用半抗原的CR筛选目标异源包被抗原的策略是有效的。此外，还进行了相关性分析以证明CR的截止值。K均值聚类分析表明，可以根据CR值有效区分IC50。回归曲线表明CR与IC50之间相关性的决策边界为63.37 ng/mL。考虑到实验确定的IC50值，作者将截止CR值设定为49.92%。如上所述，相应CR小于0.77%的包被抗原无法被 ELISA 系统上的mAb识别。因此，选择CR为0.77%至49.92%的包被抗原作为竞争性包被抗原，以提高ELISA的灵敏度。![]()
图1. 四种其他异源类似物的CRs及以这四种类似物相应的异源竞争抗原为包被抗原的ELISA灵敏度（蓝色虚线代表以同源抗原为包被抗原时，NOR的检测灵敏度5.2 ng/mL）作者通过ELISA和BLI测量了mAb对不同HCA的识别能力，以进一步解释异源竞争策略的有效性与ELISA灵敏度之间的关系。上述所述，不同mAb和不同包被抗原的亲和力存在差异，用10种抗原包被可显著提高ELISA灵敏度，而用其他抗原包被则无此效果。因此，作者首先用ELISA测定了mAb对不同HCA的识别能力。如图2所示，ELISA体系中的mAb对NOR0–BSA、NOR–BSA、OXO–BSA、ENR–BSA、NAD–BSA、DAN–BSA、NAL–BSA和PEF–BSA具有较高的识别能力，OD值为1.83至2.41；对GEM–BSA、SPA–BSA、BAL–BSA、ORB–BSA、CLI–BSA、SIT–BSA、BES–BSA、GAT–BSA、PRU–BSA和MOX–BSA具有中等识别能力，OD值为1.14至1.48。作者还对“高”和“中等”识别进行了统计分析。结果表明，使用具有中等识别能力的HCA作为mAb的包被抗原可以提高ELISA的灵敏度。其他包被抗原由于与mAb的相互作用强或弱，不能用作理想的HCA。![]()
图2. mAb对不同包被抗原的识别能力（以不同抗原作为包被抗原，在无NOR的情况下，在相同浓度下测定ELISA体系上的光密度）其次，为了进一步探讨抗原-抗体亲和力对ELISA灵敏度的影响，作者利用BLI测定了mAb对NOR0–BSA和其他7种随机选择的HCA的亲和力。在借鉴其他研究的基础上，作者认为BLI可以帮助准确探索mAb对HCA的亲和力。BLI结果如表3所示，同时进行了K均值聚类分析，证明了亲和力对ELISA灵敏度的重要性，可以根据亲和力值有效区分ELISA灵敏度。与使用同源包被抗原的情况相比，mAb倾向于具有中等亲和力的目标小分子结合，而不是与HCA结合，这可能会提高ELISA的灵敏度。同时Ag-Ab的亲和力应在一定范围内以提高不同免疫测定的灵敏度。在本研究中，ELISA系统中mAb的亲和力范围为10−7 M至10−9M。
表3. mAb对8种包被抗原的亲和力（亲和力通过生物层干涉法确定）
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5、抗原决定簇的丰富电荷分布对提高mAb-Ag亲和力有积极作用为了进一步了解抗原-抗体识别能力与ELISA灵敏度之间的关系，作者分析了8种选定的具有不同单克隆抗体亲和力的包被抗原的抗原决定簇（AD）的静电势分布。在图3中，红色表示负电荷富集程度，而蓝色表示正电荷。NOR0-Lys（远离Lys）的尖端富含正电荷和负电荷。对mAb具有良好识别能力的AD尖端带有大量的正电荷和负电荷，包括NOR-Lys和ENR-Lys。这种分布模式表明，mAb的互补决定区（CDR）是一个同时富含负电荷和正电荷的区域，与NOR0–BSA、NOR–BSA、ENR–BSA和MOXBSA具有较强的静电相互作用。同时，CLI–Lys、BAL–Lys、BES–Lys和MOX-Lys尖端正电荷和负电荷富集程度较低，可能导致那些与mAb的CDR和中等结合能力的AD之间仅存在中等静电相互作用。具体而言，CLI–BSA、BAL–BSA、BES–BSA和MOX-BSA相应的KD值分别为4.4×10−8、1.2×10−8、7.3×10−8和1.3×10−7 M。PAZ–Lys的尖端呈现密集的聚集正电荷和分散的负电荷。这种分布模式导致PAZ–Lys与mAb的CDR之间的静电相互作用较弱。因此，在ELISA系统中，PAZ–BSA很难被mAb（KD
= 9.9×10−7 M）识别。![]()
图3. 8种包被抗原表位的电位分布（蓝色框内结构为赖氨酸，A和B框分别代表NOR0-BSA表位的尖端和末端）选取NOR0-BSA和MOX-BSA分别作为包被抗原，以OD值与NOR浓度的对数作图，绘制标准ELISA曲线。同时，以MOX-BSA为包被抗原的ELISA检测生乳中NOR的灵敏度比以NOR0-BSA为包被抗原的ELISA提高了19倍（IC50分别从4.7降至0.25 ng/mL）。为了验证所建立的ELISA方法的可接受性，以MOX-BSA为包被抗原，测定了生牛乳中NOR的回收率。对生牛乳中0.1、0.5、1.0和2.0
ng/mL NOR的ELISA回收率进行了检测。平均ELISA回收率为97.1%-106.5%，CV为5.8%-10.2%。这些数据表明建立的ELISA方法能够可靠、灵敏地测定生牛乳中的NOR。此外，作者用本文方法和HPLC-MS/MS对30份生鲜乳样品进行了检测，结果显示与HPLC-MS/MS方法的检测结果一致。作者成功地利用同源包被原检测的CR筛选出适合提高ELISA系统灵敏度的异源竞争包被原。作者发现使用对mAb及其相应类似物具有中等亲和力的HCA（相应半抗原的CR为0.77％至49.92％）可以提高ELISA灵敏度。特别是当使用MOX-BSA作为异源包被抗原时，ELISA灵敏度比使用同源包被原NOR0-BSA提高了26倍（IC50分别为5.2至0.2 ng / mL）。该研究提出了一种详细的筛选方法，以选择合适的异源竞争性包被抗原来提高ELISA灵敏度。该方法也可用于增强其他免疫测定的灵敏度。【原文出处】
Hu S, Huang Z, Wang C, Peng J, Lai WH. Using hapten cross-reactivity
to screen heterologous competitive antigens for improving the sensitivity of ELISA.
Food Chem, 2020, 303:125379.原文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.125379抗体故事分享基于抗体的分析方法研究进展，欢迎投稿！
