上篇介绍了《EURL ECVAM Recommendation on Non-Animal-Derived Antibodies》中推荐的非动物源抗体筛选技术及非动物源抗体的应用限制，这篇公众号我们将主要介绍其独特优势以及未来发展方向。![]()
【非动物源抗体的独特优势】
重组抗体库筛选过程模拟了自然免疫反应，因此避免了已知的动物源抗体的局限性，并代之以更受控制的结合试剂。1.非动物源抗体在分离过程中可确定序列
非动物源抗体的序列通常是在分离过程中确定的；杂交瘤来源的单克隆抗体的序列测定步骤繁琐；而多克隆血清样本中的抗体序列未知，在制备后续批次时会发生变化。在克隆的初步鉴定过程中，测序是重组抗体生成过程中不可或缺的一部分。因此，一旦序列被记录下来，细胞克隆可能会丢失，但可以通过基因合成轻松重建对应的抗体，以获得具有相同特异性和结合特性的抗体。这使得科学数据具有无限的可重复性，与传统的多克隆研究数据形成了鲜明的对比，因为多抗研究中有限的动物血清一旦耗尽，就永远无法精确地进行重复。而生产单克隆抗体的杂交瘤细胞系需要长期储存于液氮中，细胞系的丢失也会限制相关实验的可重复性。在体外抗体筛选时，编码抗体的基因会被克隆，因此在体外筛选后只需简单的亚克隆步骤就能制备具有其他功能的抗体变体（图1）。![]()
图1 体外筛选制备的抗体相比动物源抗体具有独特优势。噬菌体展示、酵母展示和核糖体展示等展示技术均可将抗体与其编码基因直接结合。2.展示技术可制备具有独特性能的抗体
通过控制筛选条件，展示技术可以制备针对特定抗原构象或表位的抗体。例如，加入竞争物可定向筛选与特定靶点结合的抗体。通过适当的筛选，可以控制最终选出的抗体的特异性（图2）。![]()
图2 噬菌体展示技术筛选抗体。在展示抗体的噬菌体颗粒中，抗体的基因决定了其编码的抗原结合功能。这样就可以在试管中对单克隆抗体进行亲和力筛选（这一过程被称为 "淘选"），例如，在有可溶性竞争物存在的情况下进行淘选，以清除交叉反应的抗体；在特定的生化条件下淘选出具有相应特性的抗体；或者在同源的两种不同抗原上进行连续淘选，以便从功能上淘选出可以与两种蛋白质的共同结构结合的抗体。3.抗体的应用更为灵活
与动物源抗体相比，重组抗体的使用不受检测系统类型的限制。所有体外选择系统都能筛选出针对特定靶标的抗体，进而获得其基因及相应序列。这使得通过简单的亚克隆和表达就可以获得更多的抗体形式。基于抗体基因，可制备抗体的二聚体、多聚体，也可将抗体与酶、荧光蛋白或各种标签进行融合表达。抗体与细菌碱性磷酸酶融合表达可提高抗体功能。抗体片段也可转化为在许多方面都非常相似的全长抗体或 scFv-Fc 融合体。将抗体基因与不同物种的 Fc片段编码 DNA 进行基因融合，可以在许多免疫检测中使用传统的二级检测系统。例如，噬菌体展示中淘选出的人源抗体可以连接小鼠、大鼠、人类、兔子或其他动物抗体的 Fc 片段（图3）。此外，抗体还可以携带各种标签，包括用于定点生物素化的标签。蛋白质连接技术的最新发展，如 Sortase 系统或 SpyTag 系统，可将 Fc 片段或其他分子直接连接到从抗体库筛选得到的抗体片段上，从而避免重克隆步骤。![]()
图3 非动物源抗体可比拟各种动物源抗体。已有大量实践证明，在免疫印迹、免疫组化/免疫荧光、FACS等多种应用中scFv-Fc 抗体的功能等同于全 IgG。所用的重组抗体可由抗原结合位点与不同物种的Fc片段进行结合以用于检测。例如，在免疫荧光中，可以利用连接了不同物种Fc片段的抗体来观察细胞中的多种生物分子（图4）。Fc片段可通过特定设计以抑制与 Fc 受体的结合（通过LALA、TM 或 N297A 突变），从而使流式细胞术的背景更加清晰。抗原结合位点不变而连接不同 Fc 片段的重组抗体已实现商业化。此外，重组抗体也可通过连接不同的标签以不同的颜色来显示试验结果，而这一点在动物源抗体上无法实现。![]()
图4 连接不同物种Fc片段的scFv-Fc抗体用于免疫荧光。A: scFv-Fc F2C（a-c）、SF9（d-f）、TA10（g-i）和 AA2（j-l）分别连接人（a, d, g, j）、小鼠（b, e, h, k）或兔（c, f, i, l）的Fc片段，通过免疫荧光检测各自的靶蛋白，效率相似（红色）。Bar= 20 μm。B：使用 SF9-人Fc（a）、F2C-小鼠Fc（b）和TA10-兔Fc（c）对 HeLa 细胞中的肌球蛋白、微管蛋白和巨蛋白进行联合检测。三种免疫荧光检测结果显示在（d）中。Bar = 20 μm。4.抗体亲和力和特异性提高
非动物源抗体在制备后可以通过编码 DNA 以在许多方面进行体外进化。可以创建诱变抗体库，并通过筛选获得特异性和亲和力更强的抗体。将抗体亲和力提高到pM水平已相对常见，甚至有研究报道了一种非动物源抗体在体外成熟后的亲和力可达到fM水平。这些抗体的亲和力水平远高于通过免疫动物获得的抗体。B 细胞活化的生理机制使得抗体的亲和力通常被限制在约 100 pM 。为满足试验者的需求，结合动力学参数也可以通过定向进化及选择适当参数进行优化（图5）。![]()
图5 不同选择参数的噬菌体展示在进行轻链筛选时结合及解离速率常数的变化。将一个候选抗体的重链与天然抗体库中的所有轻链重新组合。经过不同条件的筛选，获得了结合动力学不同（表面等离子体共振测定）但保持了原有高亲和力的抗体。5.体外筛选的重组抗体的潜在应用
由于抗体的基因及序列已知，因此非动物源抗体可用于动物源抗体通常无法实现的应用。例如，在带有抗原的细胞中表达对应抗体，从而产生蛋白敲除表型的细胞，如制备 CAR-T 细胞或靶向特定类型细胞的病毒。【非抗体蛋白支架】
自可以用全合成基因库生成亲和试剂以来，研究重点一直集中在用其他蛋白支架替代IgG蛋白框架上，使用非抗体支架代替重组抗体可以利用其特点扩大结合试剂的应用范围。一些支架可以在大肠杆菌中高效生产，由于细菌的表达和纯化非常简单，即使是没有经验的实验室也可以自己表达和纯化这些亲和蛋白。不含半胱氨酸的支架在细胞质中折叠良好，便于其作为胞内体在细胞质还原环境中发挥作用。缺乏β-sheet结构域的支架与绿色荧光蛋白、病毒表面蛋白或跨膜锚点的融合蛋白通常可以很好地折叠，因此在任何宿主中都能良好表达。其中一些支架蛋白已用于药物研发，目前处于后期临床试验，这证实了其良好特异性和亲和力。出于经济原因开发这些支架的公司只将其用于治疗应用。一些实验室和机构已经非商业目的地生产了这些亲和试剂，研究人员可以通过与这些机构的合作获得这些试剂。原则上每种蛋白质都可以转化为高度多样化的结合蛋白库，但需要使用具有适宜的相互作用表面和随机化策略的高稳定支架才能满足应用需求。目前大量的非抗体支架已被开发，但由于缺乏商业可用性，非抗体支架尚未被广泛采用，随着一些关键专利即将到期，这种由企业商业模式导致的问题将很快被解决。支架所具有的特性使其有望在未来取代动物源抗体。虽然其生产和质量控制成本与非动物源抗体非常相似，但后续的蛋白质生产(即从现有基因中表达和纯化)成本较低。随着技术的进一步发展，其成本将进一步降低，甚至可能低于动物源多克隆抗体。【前景展望】
抗体的商业市场被高需求的靶标所驱动，针对同一种流行靶标存在数千种动物源抗体。如果有适当的补贴来奖励非动物源抗体的生产，那么可能会推动更多针对新治疗靶标的研究。目前为止，生产商着重于研发治疗产品，因此生产重组亲和试剂的工业能力仍然很低。这种定制的非动物源性产品在短期内必将与动物源抗体竞争。由于重组产品的价格目前无法降低，其必须保证自身更高的质量。欧盟已经在支持重组亲和试剂的开发方面取得了一些重大进展：目前已为数个项目投入了大量资金，其中包括并行化和小型化生产体外抗体和亲和试剂的任务。现已成功控制重组亲和试剂的生产成本与动物源单克隆抗体相当。通过进一步地并行化和小型化生产以及加大该技术的应用规模，可以大幅度降低成本。但为了预防恶性循环的产生，尚未追求成本的进一步降低。重组亲和试剂市场中每个产品的利润率和销售量很小，无法为实质性的技术开发提供资金，且只要潜在客户存在对重组抗体不可靠且昂贵的误解，对企业来说就缺乏投资吸引力，从而导致成功案例越来越少。目前定制重组抗体比传统单克隆的成本要高一些，这意味着客户会受预算限制而选择后者这种不合格的研究工具，进而减少了非动物源抗体供应需求。如前所述，生产此类分子的企业着重于生产治疗产品。尽管随着非动物源抗体技术的普及，其生产成本将会降低，但在过渡阶段仍需要一个推动力。欧盟各国政府可以向符合标准的抗体生产商或客户发放补贴。另外，非营利性机构可以在过渡时期内向科研机构提供这种重组亲和试剂生产服务。与动物源多克隆抗体和单克隆抗体相比，非动物源抗体和其他亲和试剂提供了更优越的科学资源。但人们普遍认为抗体是“内在的”，这一观点推动了动物源抗体的持续生产，并限制了非动物源抗体在市场上的发展，因此必须改变人们认为重组抗体昂贵且不可靠的观念，创造对科学研究中优越资源的需求。这需要依靠政府主管部门、资助机构和出版商制定更高质量的科研、监管和伦理标准。为达到标准要求，研究人员就会避免使用动物源抗体，非动物源抗体的需求就会随之而来。同时，无法满足欧盟所制定标准的企业将在市场竞争中处于劣势，这将鼓励欧洲外的企业提高生产标准。【原文出处】
EURL ECVAM Recommendation on Non-Animal-Derived Antibodies
原文链接：https://ec.europa.eu/jrc/en/publication/eur-scientific-and-technical-research-reports/eurl-ecvam-recommendation-non-animal-derived-antibodies
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