上篇着重介绍了《EURL ECVAM Recommendation on Non-Animal-Derived Antibodies》的颁布初衷、影响以及报告中对不同来源抗体研究现状的总结。这篇公众号我们将继续解读欧盟的建议书，了解非动物源抗体筛选技术及其应用限制。![]()
【引语】
在过去近40年中，杂交瘤技术为筛选单克隆抗体用于研究和诊断提供了强大工具。当前除了对传统的制备单克隆抗体的方法改进之外，研究人员还受益于体外展示技术的发展。虽然展示技术比动物免疫更能灵活的控制抗体性质，但至今未得到充分的应用。鉴于现代生物学研究越来越依赖商业化抗体的保真度，这突出了新方法提高抗体质量的重要性。抗体可通过多种方法筛选，欧盟文件中推荐的是噬菌体展示技术。在分析非动物源性抗体的应用限制前，让我们先对噬菌体展示技术做简单的了解。【噬菌体展示技术】
噬菌体展示技术的两大核心是建库和筛选。首先是建库，要创建至少含有1012个可能的抗体基因序列的理论筛选库。健康成人外周血B细胞数量约为5×109 ，利用与体外抗体库构建相同的组合多样化原理，采用标准化的分子、细胞和微生物学技术从人类血液中分离出的B细胞DNA(未活化B细胞)中抗体结合区的基因序列。PCR扩增后将其克隆到噬菌体载体中和丝状噬菌体次要衣壳蛋白基因Ⅲ融合，以确保抗体最终会被表达在噬菌粒表面与噬菌体的外壳蛋白融合，从而暴露出来被抗原识别。将噬菌粒导入到实验室大肠杆菌宿主中，建立通用抗体DNA库，库的多样性仅受大肠杆菌转化效率的限制。这就产生了包含超过1011个独立转化子的文库。用辅助噬菌体感染含有噬菌粒的大肠杆菌培养物，辅助噬菌体编码的噬菌体蛋白可将噬菌粒DNA包装成噬菌体病毒颗粒释放出来，这些噬菌体在其表面携带抗体，并在包装的噬菌粒中携带相应的抗体基因信息，从而将抗体基因型与其表型联系起来。可以收集噬菌体颗粒并将其通过噬菌体展示淘选来分离特定抗体。在噬菌体展示中，将展示库编码抗体的噬菌体与目标抗原一起孵育，对抗原有亲和力携带抗体的噬菌体被捕获，非特异性的噬菌体被冲洗掉，这个过程被称为“淘洗”。最后，包含所展示抗体相应遗传信息的结合噬菌体被洗脱，并用于感染新的大肠杆菌以增殖新的噬菌体。然后进行下一轮的洗脱。经过3轮的“吸附-洗脱-扩增”后，便可得到与目标抗原特异性结合的噬菌体。高度富集的噬菌体感染的大肠杆菌可以被识别和分离。培养阳性菌体以表达抗体片段如scFv或Fab(单价或二价)，或者抗体基因被重新格式为IgG或scFv-Fc，并在哺乳动物细胞中培养。为应对抗原的入侵，免疫系统已进化出高亲和力抗体筛选的机制，并在体内扩增这些高亲和力抗体。非动物源抗体与动物源抗体一样具有目标识别特性。在体外筛选针对目标抗原的噬菌体展示抗体，探索潜在的结合功能，这可以通过类似抗原的竞争、pH或浓度进行筛选，同时进行测试和验证特异性。在宿主的免疫应答过程中，体细胞超突变集中在抗体的抗原结合区，随后进行竞争性克隆选择，其结果是抗体对抗原的亲和力不断增强。类似的机制已被开发用于从原始或合成重组库中获得抗体亲和力成熟。受限于B细胞激活的生理机制，天然抗体的亲和力上限为100 pM，但在体外产生的亲和力可突破上限 。【非动物源抗体的应用限制】
1.研究人员更倾向现有的方法
许多研究人员认为在使用动物源抗体时遇到的问题无法避免。这种误解来源于大多数研究人员使用动物源抗体的日常经验以及多克隆抗体最大的特异性问题。而性能更好的单克隆抗体也会遇到特异性问题。为什么研究人员继续使用存在问题的抗体？Bradbury的文章给出了关于这个问题解释：研究人员通常不知道生产重组抗体的方法，缺乏为非治疗性市场提供生产重组抗体服务的公司，以及对该领域早期展示方法生产的抗体质量的误解。在过去的40年里，动物源性抗体的生产方法并没有显著改善这些已知的问题：高背景值、非特异性等，也没有进行严格的质量控制。部分研究人员认为这些问题是抗体所固有的，因此他们认为其他生产抗体的方法不会改善抗体的质量。然而，有大量高水平文献中可靠的数据已证实了重组抗体的独特优势独特优势。2.对重组抗体缺乏认识
在九十年代，重组抗体通常是从杂交瘤中克隆出来的，但使用当时新开发的系统，在细菌中生产scFv片段的克隆存在困难。此外，这些杂交瘤衍生的scFv片段中有一部分是不稳定蛋白质——这是一些小鼠可变区域的固有特性。因此，这些scFv片段对很多研究者来说需要额外的努力和技术诀窍才能用于典型的应用程序。此外，因为标记抗体缺少Fc区域，使用这种抗体的研究人员必须通过使用抗标记抗体而不是抗Fc多克隆抗体来实现检测。尽管最终检测结果是相同的(通常是通过与检测抗体相连接的酶或荧光团)，但人们通常认为多克隆抗Fc血清灵敏性更高。此外，一些公司出售不成熟的产品增加了负面影响。早期的抗体库没有产生亲和力像免疫产生的抗体那样高的抗体，小鼠scFv蛋白稳定性的问题导致了对抗体生成的展示方法的认知偏差，尽管经历了25年的发展和成熟，这种偏见仍然存在。如今，重组抗体具有优异的性能。虽然大多数动物抗体为IgG形式，但重组技术提供了更多的机会来产生各种形式，如单价Fab、二价Fab等。重组抗体也可以合成全长IgG，其在功能上与动物源IgG区别不大，但是可无限量供应。3.经济和合同约束
过去，很少有公司为非治疗性市场提供生产非动物源性抗体的服务。知识产权的限制也阻碍了该技术更广泛地商业化。在治疗和制药领域，重组抗体生产平台和公司高昂价格的专利战一直备受人们关注。然而，欧盟所有重组抗体生产的初始专利现在都已经过期，使得所有研究人员都可以使用这项技术。虽然最初的初始重组文库的开发需要投入大量时间，但一旦开发完成，这将提供一种多样性的候选抗体，相当于动物的终生供应，并避免了动物饲养管理的持续成本。单克隆非动物源抗体的生产成本与单克隆动物源抗体类似甚至更便宜，而且其生产速度快且只需要标准的实验室设备和消耗品。随着需求的增加，技术有望改善，价格有望进一步降低。单克隆抗体的产生需要几个月的时间，使用一个初始的重组库筛选抗体仅用几周时间就可完成。4.资源获取难
由于缺乏认识、合同约束和随后的需求不足以及利润率较低，除了用于治疗市场，很少有公司投资或销售重组抗体和亲和试剂。幸运的是，这种情况正在改变，一些公司现在开始生产非动物源性抗体产品。其中一些抗体是无法通过动物免疫获得的具有复杂功能的抗体。重组抗体可以实现其他研究领域的应用，如细胞表面的融合（T细胞上的嵌合抗原受体(CAR-T)）、用于重定向病毒或用抗体研究细胞生物学。这些应用都要求研究者从产生该抗体的公司获得该抗体的DNA。然而，即使是在利用展示方法生产抗体的公司中，也很少有公司免费提供抗体的DNA序列。在这种情况下，非营利组织或财团就可以发挥重要作用。5.科学的误解
对非动物源抗体的可靠性普遍存在的误解是，与自然免疫反应相比，非动物源抗体可能不能满足某些苛刻应用的要求（表1）。表1 不同来源抗体的比较，包括交叉反应性、稳定性、亲和力、亲和性、特异性和功能性以及多表位识别方面的可靠性。![]()
现普遍认为，为了充分发挥免疫系统的潜力，需要整个动物机体对抗原产生免疫应答。而大量的数据显示情况并非如此。对动物源抗体的发展来说，一个具有挑战性的问题是如何产生自身抗原或与其高度同源的抗原的抗体。针对小鼠抗原的小鼠单克隆抗体难以制备，而重组抗体库不受免疫应答过程中消除自身抗体的B细胞耐受机制的影响。因此，许多针对人类抗原的抗体已从重组抗体库中成功制备，其中一些已被批准用于临床治疗。此外，关于重组抗体亲和力比动物源抗体低的误解源于重组抗体技术发展的早期，当时大多数研究都是在功能多样性低于目前常规水平的较小抗体库进行的。有明确的证据表明，具有更多功能抗体基因的抗体库会产生具有更高亲和力的抗体。混淆了从细菌来源的单价抗体片段(通常是scFv或Fab)测量的内在亲和力和从双价IgG测量的表观亲和力(亲和力)，这也加剧了研究者对重组抗体低亲和力的误解。如今，重组抗体可以很容易地以二价IgG形式或许多其他双价和多价形式生产，并可以在不同的宿主中制备。体外选择系统可以优化淘洗条件以筛选出符合预期的抗体。初始淘选后，非动物源性抗体有望实现与鼠单克隆抗体亲和力相当的结合(纳摩尔[nM]范围)。在亲和成熟后，非动物来源的抗体可以获得与家兔单克隆抗体相当或更好的亲和力。对于某些应用，如需要识别多个表位时，采集血清并捕获整个动物免疫反应的多克隆抗体是首选。然而非动物来源的方法也能满足这一要求。体外选择策略在淘选过程中常规地针对抗原的各种表位识别多个候选抗体。重组方法可选择具有最合适结合特性的单个克隆以创建针对特定靶点的单克隆试剂，或者将重点放在用于复杂或高度突变靶点等应用的多表位方法。【小结】
欧盟推荐使用噬菌体展示技术进行非动物源抗体的体外筛选，并介绍了噬菌体展示技术的筛选原理以及过程。噬菌体展示技术比动物免疫更能灵活控制抗体的性质，鉴于现代生物学研究越来越依赖商业化抗体的保真度，这突出了改进方法以提高抗体质量的重要性。欧盟强调通过体外筛选技术获得的抗体，其在性能和功能上并不逊色于动物源抗体。接着欧盟分析了非动物源抗体仍没有被广泛应用的原因，总结如下：对现有方法的倾向；对重组抗体缺乏认识；经济和合同限制；获得资源难；以及重大的科学误解。下篇公众号我们将重点围绕非动物源抗体，详细介绍其独特优势以及未来发展方向。【原文出处】
1.EURL ECVAM Recommendation on Non-Animal-Derived Antibodies
2. Clackson T., & Lowman B. H. (2004). Phage Display A Practical Approach. London. ON: Oxford University Press.
原文链接：https://ec.europa.eu/jrc/en/publication/eur-scientific-and-technical-research-reports/eurl-ecvam-recommendation-non-animal-derived-antibodies
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