大家好，今天给大家介绍一篇单域抗体（纳米抗体）的发展来源和应用概况综述，作者主体源于西安交通大学温玉荣团队。关键词:生物技术工具，诊断，重链抗体，纳米抗体，单域抗体，治疗学
纳米抗体是一种源自骆驼类动物的小型、高稳定性抗体，具有强大的抗原识别能力。它们由于小尺寸、高亲和力、低免疫原性和低生产成本等特性，在生物技术和生物制药领域显示出广泛的应用潜力。纳米抗体已成功应用于癌症、神经系统疾病、传染病治疗以及医学成像和诊断中。近年来，纳米抗体的专利申请数量迅速增加，商业化进程加快，已有多种纳米抗体药物获批上市，如Cablivi和Envafolimab。随着技术进步，如多价纳米抗体的开发和稳定蛋白质框架的应用，预示着纳米抗体在未来医疗技术中具有巨大的变革潜力。单域抗体（Single domain antibodies，sdAb），也称为纳米抗体（Nanobodies，Nbs），最初在骆驼类动物中被发现，它们是一类独特的重链抗体（Heavy chain antibodies，HCAbs），不包含轻链，但具有与常规抗体相似的抗原结合能力。这种结构的发现打破了传统的免疫球蛋白由重链和轻链组成的观念，为研究免疫系统的进化提供了新的视角。科学家们努力来调查这一有趣进化事件，但没有明确的答案。然而，很明显这是一个独立的进化事件，发生在传统的异四聚体抗体出现之后。促进这种适应性免疫球蛋白进化的主要驱动力一定是一种毁灭性病毒性疾病的感染，而极端温度和缺水等极端气候条件等因素可能会加强这种感染。在软骨鱼中发现的重链抗体，称为免疫球蛋白新抗原受体(immunoglobulin
new antigen receptor，IgNAR)，肯定比骆驼类HCAb出现得早得多。然而，骆驼类HCAb与IgNAR发生了惊人的分子趋同进化，探索这两个物种之间潜在的进化联系可能为骆驼抗体的发展提供见解。单域抗体因其小尺寸、高稳定性、强抗原结合亲和力和低免疫原性等特性，在生物技术和生物制药中显示出巨大潜力。它们在癌症治疗中可以针对肿瘤特异性标记物，有助于肿瘤的发现和定位，同时减少脱靶效应。特别地，纳米抗体穿越血脑屏障的能力使其在神经系统疾病的治疗中具有显著优势。此外，纳米抗体也在传染病和诊断领域得到应用，显示了其多功能性。2 是什么原因导致骆驼出现重链抗体?
基因的进化是由随机突变、基因流动、基因漂移和自然选择等机制驱动的。随着时间的推移，这些机制共同塑造了种群的遗传特性，可能使骆驼类能够对不断变化的病原进化和环境做出反应和适应。2.1 自然选择
有颌脊椎动物的出现标志着一个重要的进化里程碑。从软骨鱼到哺乳动物，这些动物都使用免疫球蛋白来获得抗原识别能力。大约4.5亿年前出现的软骨鱼是已知最古老的产生软骨的物种。然而，功能性HCAb仅在骆驼科(包括骆驼属、羊驼属和骆马属)中检测到，包括7个现存物种(阿拉伯骆驼、双峰驼、野生双峰驼、美洲驼、原驼、羊驼和骆马)。自然选择理论表明，骆驼类可能已经发展出了基于两组抗体结构(异四聚体常规抗体和同二聚体HCAb)的独特免疫系统，以应对可能因恶劣环境条件而加剧的病毒威胁。病毒感染很可能引发了骆驼类中衍生自传统H链基因的HCAb的出现。病毒对宿主施加选择性压力，而HCAb在中和病毒和毒素方面是有效的，这些病毒和毒素有时是四聚体抗体难以达到的目标。已知东半球骆驼会感染各种病毒，包括骆驼痘、流感和腹泻病毒，它们携带致命病毒，如SARS和MERS。HCAb的VHH结构域显示出对这些病毒的巨大中和潜力，突出了其在对抗动物健康重大威胁中的作用。然而，其他驱动因素可能有助于骆驼类HCAb的出现。当环境温度超过27°c时，影响免疫力的热应激在野生动物和牲畜中很常见。然而，骆驼是耐热的，可以忍受40°C以上的高温。在体外实验中，骆驼淋巴细胞表现出更高的热应激抗性，来自IgG2和IgG3亚类的HCAb比四聚体IgG1对极端高温的耐受性更强。据报道，一些骆驼HCAb可变结构域(VHH)可以承受高达90°C的温度，而那些平均熔化温度(Tm)为67°C的HCAb在遭遇热变性后和可逆重新折叠后，可以恢复抗原结合活性。此外，来自更极端环境的骆驼物种，如中亚、北非和东非的沙漠和草原，比来自不那么极端环境的骆驼物种，如安第斯山脉高海拔地区，产生更多的HCAb。VHH基因在野生双峰驼中的表达比例高于驯化个体，表明该基因在自然条件下具有适应性表达。骆驼抗体中轻链的消除也降低了轻链沉积疾病的风险（轻链沉积疾病可导致肾功能障碍）从而确保在极端温度下更好地保水并减少免疫紊乱。2.2 适应性互补抗原识别策略
研究HCAb的遗传和结构关键因素可能为其进化适应策略提供额外的见解。与大多数哺乳动物一样，骆驼类利用V(D)J重组产生抗体多样性。这些元件由IGHVH(VHH)-IGHD-IGHJ基因组编码。其中，IGHD和IGHJ组共享产生HCAb和异四聚体抗体(H2L2)，而IGHVH基因在所有骆驼类中都是独特的，并且在HCAb抗原结合区形成中起着重要作用。IGHVH和IGHV都属于IGHV3家族。所有这些基因都聚集在基因组的一个位点上。对所有现存骆驼物种的IGHVH基因的核苷酸多样性分析表明，它们有一个共同的祖先，这表明IGHVH可能在古骆驼物种分化成今天公认的不同谱系之前就已经进化了。对羊驼、双峰驼和单峰骆驼的序列分析表明，可能是由于基因漂移事件，羊驼的IGHVH基因与骆驼的IGHVH基因有一定的差异。HCAbs也是通过突变和基因漂移进化而来的，使它们能够按照更简单的同源化方式组装，与异源四聚体抗体相比，它们的效果甚至更好。HCAbs的可变区（VHH）显示出显著的突变和漂移，框架区（FR）通过亲水突变取代FR2中用于与L链（VL）可变区相互作用的保守疏水氨基酸，导致了VL结构域的缺失。此外，双峰驼的所有IGVH 基因都在其CDR1环（或根据 IMGT编号位于第 50位）中编码一个半胱氨酸，从而导致与 CDR3环中体细胞生成的半胱氨酸形成非规范的二硫键。VHHs 的互补决定区（CDR）也表现出更多的环构象。此外，尽管没有 VL 提供的抗原结合环，但骆驼VHH的CDR3平均长度要长于人类或小鼠VHH，这无疑会增加抗原亲和力。此外，IGHVH中突变热点的增加导致体细胞高突变频率的增加，这可能会进一步丰富抗原结合谱系，而较长的铰链区也可能会提高 HCAbs的表位获取能力。在骆驼 IGHVH（而非美洲驼或羊驼 IGHVH）中，与传统H链中 CH1结构域密切相关的保守 Leu突变为第12位的亲水 Ser，预计会提高 HCAbs的表位获取能力。驼科动物 HCAbs中CH1 结构域的缺失归因于CH1 和铰链外显子之间内含子5′端的一个点突变（G >
A）。这一突变在所有用于产生HCAbs 的驼科IGHG 基因中都是保守的。H链中CH1结构域的缺失阻止了与BiP 结合的伴侣蛋白与H链相互作用，并使H链保留在高尔基体中，然后被L链取代，使其能从细胞中分泌出来。在双峰驼和美洲驼中，较长的 CDR3区域平均为17-18个氨基酸，其结构适应性增强了抗原亲和力，包括对具有隐性表位的抗原的亲和力（图 1B）。VHHs中的非典型半胱氨酸会形成额外的二硫键，从而稳定长CDR3环并提高抗原亲和力（图1C）。在鸭嘴兽和鲨鱼等其他物种中也可观察到延长的CDR环和额外的半胱氨酸桥。此外，驼科动物HCAbs中的铰链区从长而灵活到短而无铰链不等，通过减少空间位阻显著影响抗原结合（图1D）。体细胞超突变（SHM）通过提高 HCAbs 变异区的突变率进一步增强了抗原识别能力，提高了抗原结合位点的出现率，并在缺乏轻链可变域的情况下保持了抗体的多样性。![]()
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图1 HCAb和纳米抗体结构的自适应进化。(A)典型抗体和HCAb示意图(左);完整IgG、VH (PDB: 5DK3)和VHH (PDB: 7DJX)的结构组织(右)。特征氨基酸取代以卡通模式显示，表面视图显示CDR3区域(右下)。(B) 驼科VHH区域的结构定位，(深紫, PDB:8H3Y; 浅紫, PDB:5IMM; 蓝, PDB:7DJX)和来自智人的VH区域(黄色，PDB:5DK3;粉红，PDB:1MCO)和小家鼠(绿色，PDB:1IGY)。右侧为CDR3区域序列比对图。(C)两个不同纳米抗体的结构排列，包含一个额外的非典型二硫键。(橙色,PDB: 1MEL)。(D)重组羊驼IgG转录物的长铰链区氨基酸序列(修改自Kevin)。
2.3在软骨鱼类形成适应性免疫系统中得到的见解
趋同进化解释了不同物种中相似特征的独立发展情况，如抗毒素方面。HCAb首先出现在软骨鱼中，包括鲨鱼的IgNAR和全头鱼（holocephalin，软骨鱼纲的全头鱼亚纲）IgM HCAb。具有类似序列印记和结构特征的HCAb在骆驼中出现的时间也要晚得多。鲨鱼是最早具有适应性免疫系统的脊椎动物，它们发展出了负责结合抗原的独特的具有单可变结构域(VNAR)的IgNAR。分泌型IgNAR包括多个恒定结构域介导效应功能，而跨膜亚型缺乏CH2和CH3结构域。VNAR结构域的特点是通过共价二硫化物键连接的超变环。鲨鱼VNARs表现出适应性结构变化，在包括极性氨基酸和带电氨基酸的保守区域，这些区域暴露于溶剂中，有高溶解性；而骆驼科动物HCAbs的VHH似乎模仿了这一特性。尽管编码这些抗体的基因位点不同，但鲨鱼和骆驼的HCAb趋同进化表明，它们在栖息地具有显著的进化优势，如鲨鱼的高盐度和不同的pH值。此外，这两个物种的纳米抗体都可以通过母体传播，帮助新生儿免疫发育。例如，IgG HCAb同型存在于羊驼初乳中，IgM和IgNAR都存在于护士鲨卵中，突出了它们在免疫系统中的关键作用。3 应用
3.1纳米抗体的发展与商业化
在发现骆驼类HCAb后的短短30年里，它们的可变抗原结合区，即VHHs或纳米抗体，已经在多个领域得到了应用，特别是在过去十年中，引起了巨大的商业兴趣，专利申请在世界范围内迅速增加。2014年，全球纳米抗体专利申请首次超过1000件，此后每年增长20%(图2A)。这一显著增长可能部分是由于Ablynx的主要治疗纳米抗体(Caplacizumab)的I期阳性结果，这是纳米抗体在医学上应用的第一个概念验证。欧洲(2014年)和美国(2017年)Hamers专利中关于HCAb片段的首个产品专利到期，进一步加速了骆驼单域抗体(sabs)作为主流生物治疗药物的出现。到2020年，获得授权的专利数量超过1000项，这表明纳米抗体行业正在进入一个强劲增长的阶段(图2A)。![]()
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图2 LENS的搜索结果。ORG专利数据库使用术语“纳米抗体”(https://www.lens.org/，于2024年7月19日访问)。(A)纳米抗体相关的年度专利趋势。(B)按司法管辖区划分的专利文件和近5年的趋势。(C)来自北美和欧洲的顶尖申请者。
目前，纳米抗体专利申请主要集中在美国，平均每年超过1000件专利申请，其次是欧洲和中国(图2B)。美国和欧洲在纳米抗体专利申请数量上的突出地位也反映在这些地区的生物制药公司持有的大量专利上(图2C)。生物制药公司，如美国的Regeneron
Pharmaceutical，再生元），拥有超过1000项专利申请和400多项授权专利，欧洲的Novartis AG和Ablynx NV各自拥有超过250项授权专利(图2C)。证明了这些公司在纳米抗体开发中的领先地位。此外，专利数量的增加反映了对纳米抗体研究和开发的兴趣和投资的增加。3.2纳米抗体生产与应用进展
随着越来越多的学术界、研究机构和生物技术公司使用这些技术，纳米抗体的筛选和生产技术已经得到了很好的验证。纳米抗体文库的构建及其筛选技术在细菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统中是非常有效的，众多文献已经综述了这些技术，通常首先用目标抗原对骆驼(如骆驼、羊驼或单峰骆驼)或转基因小鼠(配备VHH种系基因和缺乏第一个恒定结构域的适应性恒定基因)进行免疫，以引发HCAb免疫反应，并从免疫动物的血液中分离淋巴细胞。接下来，从这些淋巴细胞中提取RNA并将其转化为cDNA。该cDNA可作为模板，通过PCR扩增纳米抗体基因。将扩增的基因片段连接到专用的选择载体上，用于噬菌体展示或酵母展示。转化到适当的宿主细胞，在噬菌体或酵母上展示，用于检索抗原特异性纳米抗体。然后将这些回收的纳米抗体引入合适的宿主(通常是大肠杆菌)中进行纳米抗体表达。从细菌培养中获得表达的纳米抗体并进行纯化，通常通过亲和层析使用抗原或特定纯化标签（最好融合在纳米抗体的c端）。最后，对纯化的纳米抗体进行表征和验证测试，以确认其特异性和与同源靶抗原的结合特性(图3A)。虽然免疫纳米抗体库是大多标准选择，但合成库或naïve纳米抗体正变得越来越受欢迎。此外，还有基于深度测序或质谱鉴定的替代选择方法。![]()
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图3 (A)使用噬菌体展示库进行常规纳米抗体生产操作的示意图。它包括用目标抗原免疫羊驼，然后采血分离外周血淋巴细胞(PBLs)。从PBLs中提取mRNA并反转录成cDNA。通过PCR扩增VHH基因，并插入噬菌体展示载体中建立文库。显示独特VHHs的噬菌体通过筛选进行抗原结合。筛选选定的噬菌体克隆，并将最佳候选噬菌体克隆成表达载体。VHHs在大肠杆菌等宿主细胞中产生，并使用亲和层析纯化。(B)纳米抗体与抗原结合的结构图(PDB: 8H3Y)和Nbs在医学领域的重要应用和相关靶点的总结，特别是在癌症、神经系统疾病、传染病和诊断工具方面。(C)经批准的治疗性纳米抗体的时间表。产品的名称是橙色的，后面跟着它的靶标。
纯化的纳米抗体具有广泛的应用，包括癌症治疗和脑相关疾病;在生物科学领域被用于复杂的成像，或调节细胞内抗原的存在和功能;甚至在植物科学中，增强对病原体的抵抗力。然而，纳米抗体最显著的影响是在医学疾病领域。作为一种比传统抗体更小、更稳定的新型治疗性抗体，纳米抗体具有独特的能力，可以从静脉外渗，并容易扩散到组织中，到达肿瘤特异性抗原。以乳腺癌为例，一项研究主要针对乳腺癌细胞表面经常过表达的人表皮生长因子受体2 (HER2)肿瘤生物标志物。而肝细胞癌(HCC)，靶向磷脂酰肌醇聚糖-3 (GPC3)信号通路的纳米抗体有助于调节HCC细胞的增殖和转移。在脑肿瘤研究方面，研究主要集中在胶质母细胞瘤，针对转录因子Trim28，趋化因子受体US28和ATP结合盒亚家族C成员3 (ABCC3)等治疗标记物。此外，纳米抗体被应用于靶向淋巴瘤，包括但不限于CD19、CD20和CD22。关于纳米抗体穿透血脑屏障的独特能力的报道在治疗神经系统疾病方面提供了显著的优势，这在诸如阿尔茨海默氏症等疾病的治疗中尤为重要，在这些疾病中，药物可以直接作用于Aβ淀粉样变性部位。同样，在帕金森病中，纳米抗体可以特异性靶向α-突触核蛋白和富亮氨酸重复激酶2 (LRRK2)，这是帕金森病的特异性致病靶点。此外，纳米抗体在对抗神经炎性疾病方面也有希望通过特异性靶向化学引诱细胞因子配体(CCL2, CCL5, CXCR7, CXCL11和CXCL12)，其目的是通过抑制促炎细胞因子或其受体来调节免疫系统并解决炎症。 (图3B)。除了在肿瘤学和神经学方面的应用外，纳米抗体在过去十年中表现出了显著的多功能性，其用途扩展到传染病、生物毒素的检测和中和以及疾病诊断等领域。在传染病中，纳米抗体可以通过与病原体进入宿主细胞的关键蛋白结合来中和病原微生物，尤其是病毒。例如，在流感病毒的例子中，研究人员设计了纳米抗体，可以附着在病毒表面的血凝素蛋白上，这是病毒进入细胞的关键蛋白。同样，在COVID-19大流行期间，科学家开发了针对SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的纳米抗体，该蛋白对于病毒通过ACE2受体进入人体细胞至关重要。对于HIV，已经开发出纳米抗体与病毒囊膜蛋白gp120和gp41的CD4结合位点结合，抑制其感染T细胞的能力。此外，通过靶向和中和参与病毒进入细胞的糖蛋白，纳米抗体已被探索作为减少病毒性出血热(如埃博拉)的潜在药物。此外，纳米抗体在检测和中和细菌生物毒素方面也有许多应用，如炭疽芽孢杆菌产生的炭疽毒素、肉毒杆菌产生的肉毒杆菌毒素和产肠毒素大肠杆菌(ETEC)产生的毒素。它们也被用于对抗霉菌毒素，包括黄曲霉毒素、镰刀菌毒素和赭曲霉毒素。对于寄生虫病，一种anti-VSG纳米抗体已被发现可诱导非洲锥虫的膜裂变和重塑，另一种Pfs230特异性纳米抗体显示可显著阻断恶性疟原虫的传播并减少鞭毛中心的形成(图3 b)。3.3 纳米抗体在医学成像和快速检测中的诊断应用
纳米抗体由于其良好的生物分布能力和对疾病生物标志物的高亲和力，被越来越多地用于诊断。因此，纳米抗体已经与一系列体内成像模式相结合，通过MRI探针使获得的肿瘤清晰可视化，检测阿尔茨海默病，或者在动脉粥样硬化研究中使用正电子发射断层扫描(PET)和磁共振成像(MRI)联合使用放射性示踪剂。近红外纳米抗体探针和荧光纳米抗体揭示结肠癌或胰腺癌的致癌位点也有报道。这些应用增强了成像效果，以更好地了解和监测疾病，并使早期和更准确的诊断成为可能。单光子发射计算机断层扫描(Single-photon emission computed tomography ，SPECT)利用放射性同位素(如99mTc和111In)发射的伽马射线。这种成像方式用于可视化各种目标，包括淀粉样蛋白沉积、免疫细胞类型和特定疾病标志物。正电子发射断层扫描(Positron emission tomography，PET)采用正电子发射放射性同位素，如18F、68Ga和89Zr。当这些放射性核素标记在纳米抗体上时，对于成像癌症生物标志物(如HER2、HER3和EGFR)以及免疫检查点(如PD-L1和CTLA- 4)和肿瘤微环境监测特别有用。光学成像（Optical imaging，OI）光学成像利用荧光染料进行可视化，使其适用于表面病变成像、术中成像和内窥镜检查。这种无放射性的技术灵活且相对便宜。超声成像利用声波来成像，通常标记的纳米抗体与结合造影剂(如微泡)一起使用，以显示组织血管系统。例如，与微泡相连的抗VEGFR2纳米抗体已被用于肿瘤血管生成成像。这种非侵入性技术提供实时成像，允许对生物过程进行动态观察。然而，与PET和SPECT相比，超声成像的分辨率较低，这限制了成像的细节和清晰度。此外，纳米抗体的稳定性和可溶性有助于它们在恶劣条件下使用，例如高温、极端pH值或有机溶剂的存在。这种纳米抗体的坚固性有利于纳米抗体的制造和长期储存。这使得它们在开发快速诊断测试方面特别有吸引力，采用诸如侧流免疫层析、诊断elisa和生物传感器等方法(图3B)。在阿尔茨海默病中，基于纳米抗体的快速检测已被设计用于专门检测Aβ和Tau蛋白，它们也被用于检测由诺如病毒、SARS-CoV-2和MERS引起的病毒感染；或由沙门氏菌、大肠杆菌或脆弱拟杆菌引起的细菌感染；或由刚果锥虫或弓形虫引起的寄生虫感染。此外，纳米抗体有助于快速检测血清c反应蛋白。ALFA-tag是一种高度通用的表位标签，当与其特异性纳米抗体(NbALFA)结合时，可以实现广泛的应用，包括超分辨率显微镜，免疫沉淀，WB和体内蛋白质检测，其通用性和性能优于已建立的标签。除了协助早期疾病诊断外，快速监测和监测疾病进展也是必不可少的。为了监测肿瘤的免疫浸润，已经开发出纳米抗体来监测T细胞浸润和纤维连接蛋白。3.4 纳米抗体在其他疾病治疗中的应用
纳米抗体的应用并不局限于传染病的治疗。例如，在动脉粥样硬化中，抗Gal -2纳米抗体已被证明可以减小斑块大小并减缓斑块形成的进程。此外，植物和动物毒素已经成为纳米抗体的靶标。对于植物毒素，正在评估纳米抗体对蓖麻毒素和金合藤毒素等植物毒素的中和作用。就动物毒素而言，纳米抗体被用于对付蛇毒或蝎子毒素。此外，微囊藻毒素和结节素等藻类毒素也被认为是基于纳米抗体治疗的目标(图3 b)。3.5 纳米抗体作为细胞内探针:技术、多功能性以及在研究和医学中的应用
3.5.1 细胞内靶向方法
纳米抗体的细胞内靶向主要通过两种方法实现:将表达载体转染到细胞中或纳米抗体结合递送蛋白使细胞通透性增强。纳米抗体可以被基因编码并融合到荧光蛋白(FPs)的基因中，FPs克隆在表达载体中，转染后在细胞内产生“显色体”，以靶向和可视化细胞内靶蛋白。该方法可实现活细胞成像，追踪靶蛋白的迁移。例如，“显色体”已被用来实时显示细胞骨架和细胞核成分。此外，纳米抗体可以附着在细胞穿透肽(cCPPs)上，以促进直接进入细胞质，避免内吞作用，从而提高标记效率，使其能够用于药物输送。这种方法的一个例子包括使用cCPP修饰的纳米抗体将治疗剂直接输送到细胞中，从而提高治疗的靶向性和有效性。3.5.2 治疗应用
靶向自噬的纳米抗体嵌合体(ATNCs)已被开发为一种多功能工具，可选择性地降解细胞内无配体作用和无药物作用的蛋白质，显示出潜在的治疗应用，如通过靶向HE4蛋白抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移。小分子-纳米抗体偶联诱导剂(SNACIPs)已被开发用于调节细胞内过程和内源性无配体作用靶点，通过铁凋亡和微管成核调节等靶向机制控制细胞功能和抑制癌细胞增殖，显示出治疗干预的潜力。一种靶向BCL11A的细胞渗透纳米抗体降解剂能有效地诱导胎儿血红蛋白表达，通过靶向降解以前无药物作用的蛋白质，为镰状细胞病和β-地中海贫血等血红蛋白疾病提供了一种潜在的治疗方法。3.5.3 递送技术
激光诱导的光穿孔能够高效、低毒性地将标记的纳米抗体传递到活细胞中，从而实现对特定亚细胞结构的高质量、长期的活细胞显微镜观察。使用递送方法，如电穿孔、光穿孔和微流体细胞挤压促进纳米抗体进入细胞，使显色体或荧光标记的纳米抗体能够可视化其目标在活细胞内的动态过程。例如，显色体已被用于跟踪活细胞中的肌动蛋白动力学，而荧光标记的纳米抗体已使用STORM(随机光学重建显微镜)提供了突触蛋白的高分辨率图像。3.5.4 成像应用
纳米抗体可以在细菌表达系统中大量生产，经过纯化，然后与化学染料结合，使它们适合于SRM和其他先进的成像技术。通过使用染料标记的纳米抗体作为内源性蛋白质成像的直接探针，将不需要二抗。这些修饰的纳米抗体还减少了连接误差，提高了成像研究的分辨率。例如，荧光标记的纳米抗体已被用于在SRM中高精度地可视化微管结构，也被用于跟踪细胞信号通路中涉及的蛋白质的动力学。3.5.5 先进生物传感器
NanoB2结合纳米抗体和NanoBRET有助于配体-膜蛋白相互作用的实时定量研究。因此，即使在内源性受体表达水平上，也能以高灵敏度确定平衡和动力学结合参数。V5-tag-directed nanobody (NbV5)已被开发并优化为细胞内生物传感器，能够监测G蛋白偶联受体(GPCR)信号传导和动态蛋白-蛋白相互作用，对细胞环境的干扰最小。来自单克隆纳米抗体的Intra Q-body探针，在低背景干扰下可有效靶向和可视化活细胞内的p53，实现基于p53表达水平的精确活细胞成像和分选。3.5.6 特定蛋白质研究工具
已经开发出一种基于纳米抗体的工具包，用于监测和修改线粒体GTPase Miro1。这种工程纳米抗体通过先进的生化、成像和细胞内调节方法，为研究Miro1在线粒体动力学和神经系统疾病中的功能作用提供了新机会。此外，据报道，一个多功能的基于纳米抗体的工具包可以分析细胞表面的逆行运输，允许对蛋白质货物进行详细跟踪，并提供对AP-1/网格蛋白机制在这一运输过程中的作用的见解。纳米抗体是细胞内探测的强大工具，能够靶向内源性蛋白质，避免大量修饰。这使得它们在基础研究和临床应用中都是无价的，可以提供对细胞过程和蛋白质功能的详解。3.6 纳米抗体治疗的临床成就与技术进步
一些基于纳米抗体的产品已经成功地转化到严格的临床试验阶段，并获得了监管部门的批准。Cablivi，由Ablynx(现为赛诺菲的一部分)开发，是第一个获得监管机构批准的纳米抗体药物，于2018年8月31日获得欧洲药品管理局(EMA)的上市许可，并于2019年3月15日获得美国食品和药物管理局(FDA)的上市许可(图3C)它用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜(aTTP)，通过靶向血管性血友病因子(vWF)，抑制其与血小板的相互作用，从而防止微血栓的形成。另一种配备纳米抗体的人源化HCAb, Envafolimab (Envida)，是首个皮下注射抗PD - L1抗体，用于治疗微卫星不稳定性(MSIH)和错配修复缺陷(dMMR)晚期实体瘤，于2021年11月获得中国国家药品监督管理局(NMPA)批准(图3C) 。它还获得了美国FDA的快速通道指定，用于治疗晚期不可切除的肉瘤患者。Envafolimab通过阻断PD1-PD-L1相互作用和调节导致抗肿瘤免疫反应的免疫过程起作用。2022年又有两种基于纳米抗体的药物相继获批(图3C)，分别是Carvykti (Ciltacabtagene Autoleucel西达基奥仑赛)和Ozoralizumab (Nanozora)。Carvykti是由强生制药开发的一种嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法，分别于2022年2月和5月获得美国FDA和EMA的上市许可，用于治疗既往接受过4种或更多治疗措施的复发或难治性多发性骨髓瘤(RRMM)的成人。Ozoralizumab由大正制药株式会社开发，是一种双特异性纳米抗体，旨在治疗类风湿性关节炎，并获得日本药品和医疗器械管理局(PMDA)的批准。同时靶向肿瘤坏死因子 (TNF-α)和人血清白蛋白，延长其在循环中的半衰期，提高其治疗效果(图3C) 。这些纳米抗体药物令人印象深刻的治疗效果不仅推动了各自靶向疾病的治疗领域，而且促进了医学领域对纳米抗体生物药物的认识和推广。3.6.1 技术进步与未来展望
增强纳米抗体的亲和性和稳定性将改善其应用性能。因此，构建多价治疗和诊断纳米抗体已成为一种标准程序。例如，在COVID-19爆发后的几年里，针对SARS-COV-2的二价和三价纳米抗体的研究取得了显著增长，二价、四价、五价，甚至十聚体纳米抗体结构比单体形式更有效。为了提高纳米抗体的整体稳定性，研究者将它们纳入高度稳定的蛋白质框架，如铁蛋白支架。计算机方法和数据挖掘技术的进步也促进了合成或naïve VHH库建设的发展，使研究人员能够根据现有的序列和结构信息设计合成库。这些纳米抗体文库在某些情况下是有用的，例如由于无法获得抗原或缺乏免疫原性而无法对骆驼进行免疫。通过深度测序和质谱鉴定替代，或结合噬菌体或酵母展示，靶标特异性纳米抗体的选择方法得到了扩展。纳米抗体的递送方式也增多，包括静脉注射、肌肉注射、鼻吸入和口服给药。结论
骆驼类HCAb的进化证明了大自然在使免疫系统适应不断变化的生态系统方面的聪明才智，独特的HCAb结构及其最小尺寸的单一抗原结合域为生物技术和医学开辟了新的可能性。纳米抗体正在革新治疗方法，为癌症、神经系统疾病和传染病提供靶向治疗。它们的小尺寸和稳定性增强了药物递送和诊断成像应用，使它们在早期检测和个性化医疗方面具有不可估量的价值。纳米抗体疗法进入市场，突出了它们对医疗领域的影响，可见纳米抗体在现代医学中的变革潜力。原文出处：Single domain antibody: Development and application in biotechnology and biopharma - Yu - Immunological Reviews - Wiley Online Library
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/imr.13381
指导教师：王战辉
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