【摘要】
开发纳米抗体(VHH)过程复杂，目前缺乏针对特定表位设计的研究。本文介绍了一种利用经验力场FoldX设计CDRs的抗体从头设计新方法。从VHH的FR区开始，解决了三个难题：1）设计CDRs以优化VHH的稳定性及其对靶点的亲和力；2）设计CDRs以与人类同系物具有高亲和力；3）设计与人白细胞介素9受体α有低纳摩尔亲和力的VHH的CDRs（目前未开发特异性抗体）。对于每个难题，本研究在一个设计周期内使VHH亲和力达到了纳摩尔。本方法适用于高亲和力VHH的从头设计，同时能够保持VHH的特异性和稳定性。【引言】
抗体治疗已成为极具前景的工具，成为治疗从传染病到癌症等多种疾病的候选药物。过去十年中，FDA批准的大多数生物制品都是治疗性抗体。传统的抗体制备方法以动物免疫、杂交瘤技术和噬菌体展示为基础。然而，这些方法存在成功率不理想、开发抗体的交叉反应有限且不可预测，以及难以产生针对保守表位的抗体等弊端。此外，使用动物进行免疫接种也存在伦理问题。这些限制要求研究人员创新方法，满足抗体开发不断变化的新需求。在此背景下，基于结构的从头抗体设计已成为一种新方法。利用计算方法来预测和优化抗原-抗体相互作用。这种方法的核心是能够准确地模拟抗体及其靶标的三维结构，从而独立设计和优化结合界面。通过分子对接、序列优化和设计模型的实验验证，基于结构的从头抗体设计有可能简化抗体开发过程，并促进发现具有定制特性（例如增强的结合亲和力和稳定性）的抗体。本研究通过两个主要的计算机步骤进行基于结构的从头抗体设计。第一步是分子对接，将模板抗体与预定义表位充分靠近；第二部是设计步骤，构建可适应表位结合的序列，同时保持抗体在孤立状态下的可折叠性。本研究报告了一种命名为EvolveX的计算机抗体设计流程，用于生成针对预定义表位的抗体。EvolveX流程解决了预定抗原从头设计抗体的主要计算问题：抗体与目标对接、抗体结构优化以及抗体互补决定区（CDR）序列设计，同时保持抗体良好的热力学稳定性并避免引入聚集因素。本流程使用ModelX实现结构优化，通过经验力场FoldX评估相互作用能和抗体稳定性，通过TANGO评估聚集倾向。通过一系列实验分析验证抗体设计步骤的有效性，包括噬菌体展示、生物物理表征、NMR和X射线晶体学，证明了从低亲和力和高亲和力蛋白复合物出发成功设计VHH。进一步探索了EvolveX 流程的灵活性，通过重新设计模板VHH以适应不相关的蛋白靶点，即人类白细胞介素9受体α（hIL-9Rα）界面，在一个设计周期内获得具有低纳摩尔亲和力的结合物。总之，本研究强调了基于结构的从头抗体设计有潜力作为生物技术和药物发现的强大工具。【内容简介】
1.以高亲和力复合物为起点的抗原结合区的计算机重建
Wen等人通过利用小鼠Vsig4蛋白的细胞外IgV结构域进行免疫免疫生成了VHH，Nb119（在本研究中进一步称为VHH_WT）。该VHH对小鼠Vsig4（mVsig4）表现出高亲和力，但对人类Vsig4（hVsig4）的亲和力则低上千倍。通过X射线晶体学确定了两种抗原抗体复合物的结构。使用VHH与mVsig4复合物的晶体结构来验证EvolveX从高亲和力复合物重建anVbody互补位的能力（图1A）。CDR2和CDR3中距离配体8 Å以内的每个氨基酸残基（脯氨酸和甘氨酸除外）都突变为丙氨酸。从这个全丙氨酸起始点开始，使用FoldX中的PSSM函数探索每个选定位置与所有20种氨基酸的兼容性，从而得出每个点突变对VHH的热力学稳定性以及与配体的相互作用能量的影响。基于这些数字，生成与复合物结构兼容的随机起始序列。这些起始序列被用作基因算法的输入，其中选择基于FoldX计算的相互作用能量，并预设了VHH的热力学稳定性上限（详情请参阅原文）。![]()
图 1使用EvolveX设计结合小鼠Vsig4的VHH的库设计、筛选、分类和验证
根据FoldX预测的相互作用能和VHH稳定性阈值以及TANGO预测的聚集倾向对结果序列进行过滤。此外，根据与蛋白质配体结合的VHH的公开晶体结构得出的密度计算Z分数，包括VHH内、VHH与其配体界面处以及VHH净电荷。获得总和Z分数最低的前6000 个序列作为寡核苷酸，并将其克隆到噬菌粒载体中的VHH_WT主链中。通过几轮噬菌体展示，使用逐渐降低至5 nM的mVsig4浓度，使结果文库中mVsig4结合物富集。从富集文库中随机挑选了188个VHH克隆，制备了周质提取物，产生了36个独特序列，随后使用扩增发光邻近均质分析（AlphaScreen）分析了mVsig4结合情况（图1B）。选中12个AlphaScreen 信噪比与VHH_WT相似或更高的克隆。在这些VHH变体中，使用生物层干涉法（BLI）（图1C）确定了解离速率常数（kd），该常数在所有情况下都非常相似。随后，对kd值略优于其他候选物的前四个候选物（VHH_m1、VHH_m2、VHH_m3和 VHH_m4）进行了更大规模（10 mg）的重组生产、色谱纯化和生物物理表征。使用表面等离子体共振（SPR）（图1D和E）和BLI（图1E）确定了mVsig4的结合亲和力（KD），结果显示四个VHH候选物的亲和力接近VHH_WT（图1E）。使用尿素和盐酸胍对四个VHH进行化学变性分析表明，与VHH_WT相比，所有四个设计序列的稳定性均显著提高约-2 kcal/mol（图1F）。分别使用内在色氨酸荧光（ITF）（图1G）和直角光散射（RALS）（图1H）同时测定蛋白质Tm和Tagg。设计的序列显示出更高的热稳定性，并且化学和热力学变性之间的稳定性相对顺序非常吻合，其中VHH_m4更稳定，VHH_m3最不稳定。使用EvolveX成功识别多参数优化序列证明了此计算方法在从高亲和力复合物结构出发设计VHH CDR序列组合方面的能力。 2.计算机设计hVsig4抗体的最佳CDR2/CDR3序列
从VHH_WT和hVsig4之间的低微摩尔亲和力复合物的晶体结构中获得的结构模板开始（PDB ID 5IMK and 5IML）（图2A）。使用ModelX中的Bridging命令以5IMK为起点调整CDR3的骨架构象，添加14个起始复合物结构。如上所述的序列设计产生了6000个候选序列（图2A）。将小鼠VHH_m和人类VHH_h序列组合成一个噬菌体文库，使用与之前类似的程序针对hVsig4进行选择。根据富集情况，选取了第三轮筛选（50nM hVsig4，R3）和第四轮筛选（5nM hVsig4，R4）的噬菌体进行筛选。从两个文库中随机挑选188个菌落进行表达和测序，得到112个独特序列，使用经典ELISA对这些序列进行排序，以确定它们是否与hVsig4结合。R4_hVsig4_5nM组的平均ELISA信号高于R3_hVsig4_50nM组，并且大多数克隆的ELISA信号高于VHH_WT（图2B）。使用BLI测试了56个序列的解离率（图2C）。选择具有最佳解离率的3个克隆（VHH_h1、VHH_h2和VHH_h3）、具有最高ELISA信号的克隆（VHH_h4）和出现率最高的克隆（VHH_h5）进行纯化和随后的生物物理表征。![]()
图2 使用EvolveX设计结合人类Vsig4的VHH的库设计、筛选、分类和验证使用
值得注意的是，所测量的设计序列的亲和力处于低纳摩尔亲和力水平（图2D和E），这意味着对hVsig4的亲和力比VHH_WT高出1000倍（图2D和E）。亲和力与VHH_m匹配项交叉验证，以确定是否与mVsig4和hVsig4结合。这表明，所有设计的VHH都对其预期靶标表现出特异性。所有VHH都经过化学和热变性。尿素和盐酸胍的化学变性表明，与原始人类VHH_WT相比，五个设计序列的稳定性从-1.5增加到-3.5 kcal/mol（图2F）。与人类VHH_WT相比，所有设计序列的Tm（图2G）和Tagg（图2H）均显著改善。VHH_h2、VHH_h4和VHH_h5对hVsig4的结合最强，比VHH_WT高1000倍（图2E）。VHH_h1和VHH_h3对hVsig4的KD值比前三个候选者更差，而显著好于VHH_WT。在所有情况下，发现五个VHH之间的常见突变（CDR2中的WN变为PF、CDR3中的DK变为NR、F变为D以及E变为N）（图2I）。为了确认表位并评估EvolveX所做的预测，设计的VHH与hVsig4进行复合结晶（图3）。所有五个高分辨率晶体结构都表明，与VHH_WT的晶体结构相比，所有VHH的结合表位几乎相同（图3B和C）。当叠加在hVsig4上时，可以看到每个VHH以及VHH_WT结合的方向略有不同（图3B）。这可能是由于CDR3（Asp107和Asp109）中设计的负电荷与hVsig4的N端之间的相互作用。总体而言，与VHH_WT相比，设计的VHH中与hVsig4相互作用的残基更多。此外，CDR3的构象与VHH_WT晶体结构非常相似（平均成对骨架 RMSD = 0.29 Å）（图3C）。![]()
图3 VHH_h1-h5的X射线晶体学高分辨率结构
为了阐明导致设计序列比原始VHH稳定性增加的生物物理参数，通过核磁共振 （NMR）光谱研究了VHH_WT和VHH_h4（hVsig4 最稳定的结合物）。VHH_WT具有分散良好的异核单量子相关 （HSQC）光谱，其中几乎所有峰都可以明确分配。有趣的是，三个 CDR 中的大多数残基没有显示骨架酰胺共振。之前已报告了其他几个VHH的CDR信号稀缺，并将其归因于CDR环的灵活性和构象异质性。VHH_h4的HSQC光谱与VHH_WT的光谱相似，但包含更多峰值，其中一些可以归因于CDR3环中的残基。此外，在VHH_WT的NMR光谱中未观察到的几个VHH_h4共振（在三重共振NMR实验中显示非常弱的信号，排除了它们的明确分配）可能属于其他CDR。总体而言，似乎VHH_h4在靶标结合时经历的构象交换比WT要小得多。根据主链化学结构预测，VHH_WT和VHH_h4的二级结构非常相似，与X射线结构中的二级结构非常吻合，这证明了CDR外VHH折叠的高度结构保守性。为了进一步探究VHH_WT和VHH_h4之间的差异，进行了NMR弛豫分析，结果显示溶液中的游离VHH_h4保持结合样蛋白质构象，紧密堆积的CDR环运动有限。同时，VHH_WT的CDR在很大程度上是无序的，并涉及广泛的构象交换。这些差异可以解释这两种蛋白质的热稳定性差异，其中CDR的运动无序性使VHH_WT不太稳定。3.针对特定靶标进行抗体从头设计的计算机设计流程
抗体设计中更大的挑战是针对特定表位从头设计单域或全长抗体，因为这涉及将抗体支架对接到抗体上，重塑环路并寻找介导高亲和力结合的序列。开发了一种基于热点筛选的对接方法，用于将VHH模板对接到与预期界面重叠的预定义表位侧链上。对接方法将模板VHH放置在所选表位附近，并确保抗体和热点残基之间的至少一些相互作用同时进行。首先使用FoldX分析VHH和蛋白质配体之间复合物的所有晶体结构，以确定表位上哪些氨基酸预计对相互作用贡献最大，称为热点残基。通过使用FoldX中的Rotacloud命令对能量上可能的旋转异构体进行建模，可以改变这些热点残基侧链。然后使用热点数据库将模板VHH对接至目标蛋白质预定义表位的氨基酸上。4.通过针对人类白细胞介素-9受体α验证从头设计流程
为了验证方法可行性，选择人类白细胞介素9受体α（IL-9Rα）的晶体结构（PDB ID 7OX5）和AlphaFold模型（Q01113）作为目标。对于从头设计，在hIL-9Ra的茎区中选择一个表位，该表位靠近膜结构域，预计受体会与白细胞介素2受体γ（γcR/IL-2Rγ）的等效茎区相互作用，并且位于hIL-9结合位点之外。预计在此界面处结合的抗体会抑制IL-9下游信号传导，这可能是一种针对哮喘和一般过敏性疾病的治疗方法，其中IL-9被视为疾病严重程度的关键因素之一。根据相互作用残基和主链冲突的数量，对上述热点残基对接结果进行筛选。这些对接按热点残基和模板结构分组。对每组的代表性对接进行目视检查，以确定其可行性，判断依据涉及的CDR、VHH方向、相互作用潜力和与糖基化位点。有趣的是，在符合标准的对接组中，72个不同的对接巧合地使用与hVsig4结合的VHH_WT作为模板。然后，选择此VHH_WT作为起始模型，可以针对目标重新设计VHH，保持KD并改善物理特性，增加目标直系同源物的亲和力，最后更具挑战性地对其进行修改以识别完全不相关的靶标。将Z值总和最低的前16477个序列排序为寡核苷酸池。创建了两个噬菌体文库，一个确保低重组率，另一个允许所有CDR之间完全重组。使用几轮噬菌体展示筛选这两个文库与hIL-9Ra结合。根据富集情况选择噬菌体用于低重组率和高重组率文库（图4B）。将这四组中的VHH序列重新克隆到表达载体中并转化到TG1细菌中。同样，随机挑选570个菌落进行表达和筛选，包含122个独特序列。低重组率和高重组率文库之间的平均AlphaScreen信号相当（图4B）。使用BLI测试了30个序列的解离率（图4C）。根据解离率和AlphaScreen 信号，选择了8个序列进行纯化和生物物理表征。其中，7个序列的亲和力低于25 nM，最佳匹配VHH对hIL-9Ra的亲和力为1.3 nM，最差的亲和力为43 nM（图4D和E）。为了测试从头设计序列的匹配是否与hIL-9Ra特异性结合，对hIL-9Ra、hVsig4和mVsig4进行了AlphaScreen。结果显示，所有与hIL-9Ra结合的序列都不会与hVsig4或mVsig4结合（图4F）。此外，VHH_WT对hIL-9Ra没有显示任何AlphaScreen信号，最高亲和力VHH的Tm为83℃（图4G）。![]()
图4使用热点移植和计算机从头设计抗体方法设计人类白细胞介素9受体α（hIL-9Ra） 的高亲和力抗体
5.总结
本研究证明了计算机辅助抗体设计在 VHH 创制方面的强大功能。分子建模、序列优化和实验验证相结合为抗体工程提供了一种系统而有效的方法，对药物开发、诊断和生物技术具有重要意义。未来的工作将侧重于进一步完善设计流程、减少库容并探索其在其他蛋白质靶点和治疗模式中的应用。原文出处：Van Der Kant R, Zhang Z, Marković I, et al. De novo design of high-affinity single-domain antibodies[J]. bioRxiv, 2024: 2024.04. 22.589762.
指导教师：王战辉
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