肿瘤分子检测助力传统病理诊断——2024 年USCAP乳腺肿瘤基因检测进展（二）

黏液癌（Mucinous carcinoma，MC）是一种罕见的乳腺癌，其特征是细胞群漂浮在细胞外黏蛋白池中。MC通常ER+、PR+、HER2-，并且预后良好。MC进一步分为A型（少细胞型）和B型（富细胞型）。我们对既往12年的MC病例进行回顾性分析，以分析复发风险率（Recurrence Score，RS），以及RS与病理特征、生物标志物和临床的关系。

选出2011-2023年234例纯MC（>90%黏液，M1）或混合性黏液癌（>50%黏液，M2）病例，病例被分为A型（少细胞型）或B型（富细胞型）。收集肿瘤分级、受体状态、RS、辅助/新辅助治疗及随访信息。采用方差分析T检验、卡方及回归分析来评估其相关性。

浸润性微乳头状癌（invasive micropapillary carcinoma，IMPC）是乳腺癌（BC）的一种罕见变异型，具有侵袭性临床病理特征，包括淋巴血管侵犯、淋巴结转移和高分期。IMPC的特征性组织学结构为空腔内的极向翻转的微乳头状细胞团。与浸润性导管癌癌（IDC）相比，IMPC的预后仍存在争议，通过21基因检测Oncotype DX得出乳腺复发评分（Recurrence Score，RS）在这种乳腺癌亚型治疗中的作用有待进一步研究。

选取2011-2021年71例IMPC或浸润性导管癌伴明显的微乳头状结构（>50%；IDCM），评估肿瘤分级、大小、淋巴结（LN）状态、受体状态、复发风险（RS）。应用方差分析T检验、卡方和回归分析来评估相关性。

71例病例中，47例（66.1%）进行了RS检测。平均RS为17.2±9.3（范围3~40），患者平均年龄62±8.2岁（范围48~77岁）。21%（n=10）病例为IMPC，78.7% （n=37）病例为IDCM。IMPC和IDCM的平均RS相似：18.1±10.37和17.2±9，8例（17%）低RS（25）。肿瘤平均大小为1.6±0.72cm（范围0.5~3.8cm），其中低RS为1.2±0.6cm，中RS为1.8±0.7cm，高RS为1.7±0.7cm。除1例1级病例（RS为14）外，其余病例均为2~3级，RS与肿瘤大小或分级无关。10例（21.2%）为PR-。PR-病例的平均RS显着高于PR+病例：（26.6±10.3）比（14.6±7.150），60%的PR-病例具有高RS。所有病例均接受激素和/或放射治疗。3例（10%）中等RS患者接受了辅助化疗，高RS病例中除1例外，其余病例均接受了化疗。1例接受新辅助化疗（RS为27，T1期，LN阴性）。6.3% （n=3）低RS呈阳性LN，19.1% （n=9）中 等RS呈阳性LN，4.2%（n=2）的高RS呈阳性LN。RS与LN阳性、肿瘤分期或微乳头亚型比例没有显着相关性。中位随访时间48个月（范围10~132个月），复发率为6.3%（n=3）。所有复发患者均接受了化疗，2例48个月时出现局部复发，RS分别为23和25，1例10个月时出现远处复发，RS为32。

准确评估乳腺癌（BC）的生物标志物，包括雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体2（HER2）和Ki67增殖标志物，对于制定有效的治疗方案至关重要。然而，目前用于检测这些标志物的“金标准”方法，如免疫组织化学（IHC），面临着标准化挑战和实验室间显著的变异性。为了克服这些问题，我们开发了APIS乳腺癌分型试剂盒，该试剂盒使用RT-qPCR技术评估空心针吸活检（CNB）和切除的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）BC样本中ER、PR、HER2和KI67的状态。在此，我们报告APIS乳腺癌分型试剂盒的临床表现，并讨论其准确检测低HER2表达的潜力。通过与标准IHC的结果进行比较，我们证明了该试剂盒的可靠性和对精确BC分型的实用性。

按照标准实验室协议对来自空心针吸活检（CNB）或切除术的652个福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片进行了组织学分析。对于HER2评分为2+的样本，采用原位杂交（ISH）确定HER2状态，以取代免疫组织化学（IHC）的结果。ER/PR阳性定义为超过1%的阳性染色细胞核，而Ki67染色阳性/阴性的截断值为20%。

众所周知，长时间的冷缺血时间（CIT）和新辅助化疗（NACT）各自都能独立影响乳腺癌相关生物标志物的表达，这一事实在病理学实践指南中得到了体现。然而，它们的联合作用尚未得到充分研究，尚不清楚这些作用对生物标志物表达是中性、负性、正性的还是协同性的。在本研究中，我们评估了延长CIT对癌症乳腺癌标本NACT后生物标志物表达的负面影响是否高于其他类似但非NACT标本。

从机构数据库中，我们确定了334对乳腺癌活检及对应的切除术标本，其中在两种标本上都进行了免疫组织化学（IHC）（雌激素受体[ER]、孕激素受体[PR]、HER2）和HER2荧光原位杂交（FISH）。这些标本包括209对接受新辅助化疗（NACT）切除术的标本对（NACT[+]）和125对未接受NACT的标本对。每个组分为长时间冷缺血时间组（>1小时）和非长时间冷缺血时间组（<1小时）。将包含长时间冷缺血时间、NACT[+]标本对的研究组与包含长时间冷缺血时间、非NACT标本对的对照组进行比较，比较其活检到切除术的最终结果变化频率、IHC染色强度（对于ER和PR）、HER2 IHC评分以及HER2 FISH的HER2/CEP比率。

共有124对研究组标本和84对对照组标本。研究组（即长时间冷缺血时间、NACT[+]）标本在以下方面的活检到切除术结果变化频率明显高于对照组（即长时间冷缺血时间、非NACT病例）：1）PR染色细胞百分比（p=0.019）和2）PR染色强度（p=0.001）。对于ER、HER2/CEP比率或HER2 IHC评分，我们没有观察到类似的情况。然而，我们发现研究组和对照组的活检到切除术在最终结果（阴性与阳性）的变化比例方面没有统计学显著差异，即ER（p=0.087）、PR（p=0.14）、HER2 IHC（p=0.088）和HER FISH（p=0.48）从阳性变为阴性或从阴性变为阳性的比例（参见表1）。

表1

癌细胞中端粒的延长主要依赖于端粒酶逆转录酶（TERT），然而既往文献也报道了端粒酶非依赖性的机制：i）端粒的替代性延长（ALT），与染色体重塑基因ATRX和DAXX的遗传改变相关；以及ii）端粒免受降解的保护，与端粒长度调节器POT1的遗传改变相关。我们旨在确定端粒酶非依赖性机制是否在乳腺癌（BC）中起作用，并研究这些病例的特征。

我们检查了4187例原发性乳腺癌（pBC）和4757例转移性乳腺癌（mBC），这些病例先前已接受临床靶向测序，以确定是否存在ATRX、DAXX或POT1中的致癌/可能致癌的遗传改变。我们根据世界卫生组织（WHO）标准对这些病例进行了组织学检查，并从医疗记录中获取了雌激素受体（ER）/HER2状态。我们将这些病例的肿瘤突变负荷（TMB）和基因组改变比例（FGA）与携带TERT启动子突变的乳腺癌以及缺乏这些遗传改变的乳腺癌进行了比较。

我们在8944例乳腺癌（BC）中确定了68例（0.8%）存在ATRX（49/68；72%）、DAXX（8/68；12%）或POT1（9/68；13%）的致癌/可能致癌遗传改变，或ATRX和DAXX（2/68；3%）同时改变。这些病例包括16/4187例（0.4%）原发性乳腺癌（pBC）和52/4757例（1.1%）转移性乳腺癌（mBC）。大多数ATRX/DAXX/POT1改变的pBC和mBC为非特殊类型的浸润性导管癌（分别为88%和77%），组织学分级为3级/分化差（分别为63%和71%），且为ER+/HER2-（分别为56%和60%）。与携带TERT启动子热点突变的pBC（n=29）相比，ATRX/DAXX/POT1改变的pBC的肿瘤突变负荷（TMB）（P=0.04）和基因组改变比例（FGA）（P<0.01）显著升高，且其TMB也高于ATRX/DAXX/POT1/TERT野生型（WT）pBC（n=4003；P=0.04）。同样，ATRX/DAXX/POT1改变的mBC的TMB也显著高于携带TERT启动子热点突变的mBC（n=40；P<0.001）。它们的FGA和TMB也高于ATRX/DAXX/POT1/TERT-WT mBC（n=4433；P<0.01和P<0.001）。

首先，糖尿病患者罹患乳腺癌的风险相对较高。其次，糖尿病可能会影响乳腺癌的治疗效果和预后。肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）在乳腺癌中起着重要作用，但糖尿病可能会影响TILs的数量和功能。进一步的研究和探索将有助于我们更好地了解糖尿病、乳腺癌和TILs之间的关系，并为乳腺癌治疗提供新的策略和方法。

我们选择了五个与糖尿病表达相关的差异表达基因（DEGs）来构建乳腺癌的预后标志（图1A）。已经验证，该预测标志的ROC曲线的AUC值为0.76（图1B）。随后的免疫分析显示，高风险组和低风险组在免疫浸润、免疫状态和免疫检查点方面存在显著差异。此外，我们进行了单细胞测序，结果显示TCF7L2在乳腺癌的成纤维细胞中表达（图2A）。进一步的细胞通信分析表明，TCF7L2参与了T淋巴细胞的招募（图2B）。随后，我们进行了免疫组织化学验证。此外，TCF7L2表达增加的患者在乳腺癌中的TILs水平也显著升高。

图1 A. 多因素分析糖尿病相关基因于乳腺癌预后的关系。B. ROC曲线。

图2 A. 单细胞分析降维聚类。B. 单细胞分析TCF7L2的表达。

T-DXd已被FDA批准用于治疗转移性HER2低表达乳腺癌患者。目前HER2免疫组织化学（IHC）检测在评估HER2低表达乳腺癌及明确哪些患者受益于T-DXd治疗方面并不理想。

使用FDA批准的PATHWAY和HercepTest IHC测定法测量526个乳腺癌组织芯片（tissue microarray，TMA）中的HER2表达，通过RNAscope评估相应的RNA水平，该RNAscope使用1个FFPE未染色载玻片并使用Leica BOND III 自动染色仪进行杂交，并使用QuPath对RNAscope结果进行量化。其中99个TMA组织还使用 HercepTest 抗体和 Leica BOND III自动染色机进行了实验室开发的测试（LDT）染色。在48个组织中，使用针对细胞系阵列的定量免疫荧光评分进行回归分析，并通过质谱法确定已知的HER2蛋白水平，从而获得HER2蛋白水平。此外，还测量了接受T-DXd治疗的23名患者的32份转移性活检样本中的RNA水平，结果与缓解率相关。

PATHWAY、HercepTest、LDT、超低表达和1+病例中HER2蛋白和RNA水平差异均无统计学意义。定量的HER2 RNA水平和蛋白水平存在显著的相关性（p＜0.0001），此外定量的HER2 RNA水平和来自FDA批准的PATHWAY和HercepTest两项检测的 IHC H-分数之间存在显著相关性（p＜0.0001）。接收T-DXd治疗应答者（6.4±8.2，n=12）中定量的HER2 RNA水平显着高于无应答者（2.6±2.2，n=20），差异有统计学意义（p=0.030）。