原位杂交（ISH）是检测乳腺癌HER2基因扩增状态的重要技术。在2024 USCAP病理年会摘要汇编中，有2篇（编号：164、243）研究重点关注了HER2原位杂交的不典型组别（第2组、第3组和第4组）的稳定性和异质性。此外，大会所收录的HER2 ISH领域研究也突显了人工智能（AI）的强劲介入趋势：第98号摘要采用两个AI算法系统对HER2双探针显色ISH结果进行分析，均具有良好表现并能节省HER2评估时间。第205号摘要探讨了图像分析（IA）工具对于uPath HER2双色双重原位杂交（D-DISH）的分析具有显著的一致性和敏感性。第213号摘要将H&E或IHC载玻片与HER2 FISH的数字化扫描切片进行比对，使得在FISH切片观察时能快速定位到具有最高蛋白表达的肿瘤区域，将提高数字化FISH计数的准确性和效率。而第239摘要通过深度学习方法探讨了准确评估HER2和CEP17拷贝数异质性在指导治疗决策和预测患者预后方面的潜在临床意义。下面将对以上6篇摘要的具体内容进行介绍。
98. 在浸润性乳腺癌中评估集成人工智能的HER2双探针原位杂交（Dual ISH）检测系统
通过免疫组织化学(IHC)和原位杂交(ISH)基因扩增准确评估HER2过表达对于乳腺癌患者的靶向治疗至关重要。HER2双探针ISH的定量分析很费时，并且具有主观性。计算机分析技术为帮助病理学家进行定量和定性研究提供了实用的解决方案，并使得结果更客观和一致。作者之前已经对双探针ISH的扫描分析程序进行了优化。在本研究中，作者使用该程序对两个不同的人工智能集成系统进行评估，以验证结果的可靠性。
对26例已经有HER2 IHC和FISH人工分析结果的浸润性乳腺癌病例（去除标识后）进行了评估。每个病例分别分类为ASCO/CAP ISH 1至5组。H&E、IHC和双探针ISH载玻片由ROCHE DP200以0.23μm/像素扫描，并由3D HISTECH Panoramic p250 以0.17μm/像素3z堆栈扫描。在WSI中选定ROI，分别通过两个系统（Navify DP和Shimaris）进行分析。Shimaris是一款本地化独立应用程序，可以使用任何扫描仪的数据，并且可以自由调整ROI的大小和数量（图1）。NavifyDP是一种基于云的图像管理系统，具有自动评估功能，例如使用一个固定ROI来对HER2IHC和双探针ISH进行分析（图2）。评估不同扫描仪和系统所获得的HER2基因状态的一致性，并与人工FISH结果进行比较。人工智能集成的ISH结果及其与人工FISH的一致性见附表。在WSI上手动计数的双探针ISH结果与显微镜下计数的结果一致。AI集成应用程序对WSI的HER2测定结果与人工FISH结果100%一致。Navify DP系统给出结果的速度非常快，1个固定大小的ROI即可达到20个细胞核。在所有结果中，ISH分组结果与人工FISH结果的一致性低于60%。每个病例计数20个细胞核，临界状态病例计数40个细胞核。两个系统都表现良好，用户交互性好，且能节省HER2评估时间。根据之前另一项研究的结果，计数80个细胞核可以获得最佳结果，ISH组的一致率可能能通过计数更多的细胞核（例如80个）来提高。![]()
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164. HER2 FISH第2组和第4组乳腺癌活检结果是否应在切除术后重复检测？
乳腺癌中的HER2检测是通过免疫组织化学(IHC)和/或双探针荧光原位杂交(FISH)检测，靶向HER2和17号染色体的着丝粒(CEP17)。通过HER2:CEP17比值和每个细胞中HER2信号的平均值来确定HER2的类型。根据2018年ASCO-CAP乳腺癌HER2检测指南，HER2 FISH分为阳性(第1组)或阴性(第5组)，第2-4组的结果基于同时进行的免疫组化，如果免疫组化为2+，则由第二名医生重新计算FISH。如果重新计算结果相似，则认为第3组为阳性，第2组和第4组为阴性。指南指出，在第2组和第4组中，对切除标本进行重复HER2检测可能是合适的，但不绝对推荐重新检测。对2016-2023年乳腺癌生物标志物报告进行回顾性分析，根据2018年指南定义的HER2 FISH第2组(HER2:CEP17比值≥2.0，平均HER2信号/细胞<4.0)和第4组(HER2:CEP17比值<2.0，平均HER2信号/细胞≥4.0且<6.0)筛选病例，并记录重复检测的结果。共有5695例经过HER2 FISH检测;其中第2组101例(1.8%)，和4组194例(3.4%)。在第2组病例中，42例(41.6%)在切除后进行了重复检查，5例(11.9%)呈HER2阳性。在第4组病例中，110例(56.7%)在切除后进行了重复检查，19例(17.3%)呈HER2阳性。第2组和第4组均未见免疫组化染色(3+)阳性。重复检测的HER2状态与接受新辅助治疗之间没有关联，1/4的2组新辅助病例和2/12的4组新辅助病例转变成为HER2阳性(p=0.41和p=1)。同样，重复检测HER2状态与三阴性(TN)状态之间没有关联，1/7的2组TN病例和1/20的4组TN病例变为HER2阳性(p=1和p=0.19)。
第2组和第4组肿瘤是HER2 FISH结果中不常见且具有挑战性的亚群。我们的结果表明，在切除标本中重复进行HER2检测，11.9%的第2组原发肿瘤和17.3%的第4组原发肿瘤变为HER2阳性。我们建议在切除后对这些FISH类型的患者进行重复HER2检测。205. uPath HER2双色双重原位杂交（D-DISH）图像分析（IA）工具用于浸润性乳腺癌（IBC）中人表皮生长因子（HER 2/neu）检测的验证
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HER2基因扩增是IBC的不良预后因素，已成为曲妥珠单抗等抗HER2治疗改善患者生存的有价值的预测指标。D-DISH检测，最近得到验证的技术，提供了一种替代FISH检测的方法，使用明场显微镜，现在已被纳入常规诊断工作流程，作为验证检测来确定HER2状态。uPath HER2双ISH图像分析(IA)算法(Roche Ventana, Tucson, USA)是一种辅助计算机辅助工具，可在Ventana HER2双ISH探针鸡尾酒试验(2020)(Tucson, USA)染色的IBC病例的注释活肿瘤区域内枚举HER2和CEP17信号。本研究比较了人工判读与基于IA算法的D-DISH病例评估。对30例IBC患者进行D-DISH试验，其中HER2/ new免疫组化(IHC)评分为0/1+、2+、3+的各10例。D-DISH切片采用内置uPath IA算法的Ventana DP200切片扫描仪扫描。DDISH切片首先由四位病理学家手动人工评估，然后使用uPath IA算法进行评估。该算法提供了一张热图，在切片查看器中突出显示了HER2/neu扩增区域。采用Cohen’s kappa统计和组内相关系数(Intraclass correlation coefficient, ICC)评估人工D-DISH评分与IA软件评分的一致性，以人工D-DISH评分为金标准。30例IBC中，DDISH人工评分扩增11例，非扩增19例。IA算法显示HER2/neu扩增率为12/30。人工和IA D-DISH分析的一致性为96.67%，Cohen’s kappa值为0.93，表明HER2状态评估几乎完全一致。仅1例IHC评分为2+者结果不一致。ICC值分别为0.65 (HER2信号)、0.74 (CEP17信号)和0.59 (HER2/CEP17比值)，表明两种方法之间存在中等程度的一致性。uPath IA工具的灵敏度为100%，特异度为94.74%，阳性预测值为91.67%，阴性预测值为100%。热图辅助选择感兴趣区域(ROI)，选择特定细胞，计数HER2和CEP17拷贝数，评估HER2/CEP17比率。
罗氏诊断公司的uPath IA算法工具具有显著的一致性和敏感性。它不逊色于人工评估，具有提高工作流程效率的能力。213. 改善数字化HER2 FISH计数的互操作性- 一项初步评估
将H&E或IHC载玻片与HER2 FISH的数字化扫描切片并排比对，可以保证在FISH切片选择高倍观察视野时，能针对性地定位到具有最高蛋白表达的肿瘤区域。通过FISH实验室的同一扫描平台建立评估流程，本研究的目标是：在需要FISH检测时，重新使用由病理医生在明场图像上标记的数字化感兴趣区域的作用。评估样本来自乳腺癌患者的空芯针活检标本。使用MoticEasyScan Infinity以40X分辨率（0.26 um/px）扫描H&E和HER2 IHC切片，由经过认证的病理学家使用传统显微镜和数字化成像检查切片。如果IHC不确定，则要求进行FISH检测，进行人工分析。然后使用PathFusion系统（应用光谱成像）扫描和分析FISH切片。同时，对在MoticEasyScan上获取的明场图像进行标注，并注册标注到FISH图像上。感兴趣区域被自动传输到FISH扫描切片（图1），并对这些标记区域进行高倍扫描（图2）。数字FISH计数结果与人工计数结果进行比较。评估包括来自20名患者的20个活检标本。19个样本被诊断为IDC或ILC，一个为MCCD。病理学报告显示，HER2 IHC在4例中呈阳性，在7例中不确定，在9例中为阴性。所有不确定的病例都进行了人工判读FISH检测，其中3例为HER2阳性，4例为HER2阴性（表1）。然后在FISH实验室扫描FISH切片，并将病理医生在明场图像上标记的感兴趣区域放大，省略了在显微镜下复查FISH切片的步骤。与人工计数结果相比较，数字化FISH计数提供了6个等效的结果。在一个标本中，扫描图像中的肿瘤细胞没有FISH信号，无法提供数字计数。数字化FISH计数中的互操作性允许在FISH检测时重新使用病理学家在H&E或IHC图像上标记感兴趣区域。这种集成的工作流程将提高数字化HER2 FISH计数的准确性和效率。239. 深度学习揭示肿瘤异质性：增强HER2荧光原位杂交（FISH）分析生存、治疗反应和疾病进展的临床相关性
传统的HER2 FISH检测方法常常因为只计数有限数量的细胞核而受限，导致可能丢失有关肿瘤异质性的重要信息。这可能导致诊断不足或假阴性结果。为了应对这些挑战，我们的研究提出了一个全面的流程，结合深度学习、广义加性模型和回归方法，以提高FISH检测中HER2信号计数和人群分析的准确性和效率。共收集了300张FISH图像。两位医生和五名技术人员审查了所有图像。在这些300张FISH图像中，它们被分类为不同的组别：90例被归类为第一组，30例为第二组，60例为第三组，60例为第四组，60例为第五组。为了解决非对称细胞核分割和HER2/CEP17信号检测的任务，设计了一个双金字塔Unet模型。该模型将计数FISH图像中的所有细胞核。此外，还将结合回归分析以识别可能的HER2/CEP17拷贝数克隆性组合。这些结果将以可视化形式提供给医生和技术人员进行进一步的分析和解释。通过我们的方法，发现病例中具有不同HER2或CEP17拷贝数的小细胞群的现象非常普遍（表1）。因为通常日常实践中只计数60个细胞核，所以对这种程度的异质性的识别可能具有挑战性。然而，临床相关性研究表明，第一组和第三组联合占比超过12%的病例可能会从HER2靶向治疗中大大受益。这一发现强调了在此类病例中准确识别和量化“少数细胞群”的重要性。此外，随访结果表明，在第一组和第三组合并阳性细胞群超过12%的病例中，无进展生存期和总体生存期显著缩短。这些发现强调了准确评估HER2和CEP17拷贝数异质性在指导治疗决策和预测患者预后方面的潜在临床意义。（图1和2）
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总之，我们的研究引入了一种突破性的HER2信号计数和细胞群分析方法，用于FISH检测。这有助于识别以前未被发现的肿瘤异质性，并扩大了有资格接受靶向治疗的患者群体。243. HER 2荧光原位杂交（FISH）第2-4组在经过HER 2 2+免疫组织化学重新计数后分类为阳性的乳腺癌可能具有遗传学异质性
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美国临床肿瘤学会/美国病理学家学会（ASCO/CAP）2018年关于乳腺癌HER2检测指南描述了5个FISH分组，并要求在同一组织和同一实验室进行HER2免疫组化（IHC）检测，并将其纳入2-4组的FISH最终分类结果。对于IHC不确定/2+的病例需要进行IHC引导的第二次盲测FISH评估，以确定最终的HER2状态。本文研究了IHC 2+染色范围（extent of IHC 2+ staining）与需做第二次盲测FISH的2-4组病例的最终FISH结果之间的关系。选择本实验室进行HER2 FISH检测结果为2-4组的乳腺癌病例进行研究。对于IHC不确定/2+病例，记录具有环周（弱/中等）染色的肿瘤细胞所占的百分比（即第二次靶向FISH的区域）。一位技术员和一位病理学家在FISH切片上至少计数40个细胞。IHC切片由乳腺病理学家手动人工评分/注释。使用X2检验比较着染细胞%和最终HER2状态。9597例乳腺癌中有2713例（28.3%）的HER2 FISH被分类为2-4组，并在同一组织样本上进行了后续的HER2 IHC检测。1241/2713（45.7%）的结果呈现不确定/2+，需要IHC引导下的第二次盲测FISH重新计数。在IHC引导的第二次盲测FISH重新计数后，第2、3、4组中，分别有18/85（21.2%）、26/105（80.0%）和131/1051（12.5%）例被归类为“HER2阳性”。第2、3、4组中有9/85（10.6%）、9/105（8.6%）、109/1051（10.4%）的病例没有IHC环周染色数据。在已知着染细胞%的病例中，只有13/217（6%）最终“HER2阳性”的病例具有>50%弱/中等环状膜染色（表1）。并未发现肿瘤环状染色比例（≥10%~≤50% vs >50%）与最终HER2状态之间的关联。
对于HER2 FISH 第2-4组且IHC不确定/2+的病例，随后进行有针对性第二次盲测FISH重新计数，显示IHC染色范围与最终HER2状态之间没有相关性。在有针对性的重新计数判读为FISH扩增（“最终HER2阳性”）的病例中，94%的IHC 2+/FISH扩增区域占肿瘤的比例小于50%。推荐将HER2扩增亚群为10-50%的肿瘤归类为具有遗传异质性（GH），这些肿瘤对于HER2靶向治疗的反应与1组肿瘤不同。可能需要更新指南以报告这些肿瘤中的异质性存在情况。（广东省中医院 杨海峰，青岛大学附属医院 王成勤 审校）
唐甜
广州医科大学附属第二医院病理科 主治医师，医学硕士
博士，主任医师/教授，硕士生导师
中国抗癌协会病理学专业委员会乳腺与骨和软组织肿瘤病理学组委员美国约翰霍普金斯大学医学院/医院病理系/科进行博士后研修1年，专注呼吸、乳腺、神经及骨软组织等系统病理诊断，注重分子病理进展与病理诊断的结合。【本文系原创文章，如需转载请标明来源；本订阅号为非盈利性专业学术交流平台，所有文章仅供公益交流，不代表本订阅号立场。热诚欢迎所有关心与支持乳腺病理发展的同仁，加入到我们的订阅号，积极推动我国乳腺病理事业的蓬勃发展，投稿邮箱：breastpathology@163.com】
