【摘要】
本文开发了一种集成策略，结合Fe₃O₄磁性纳米粒子修饰的金属有机框架-5基磁性固相萃取与光纤基均相化学发光免疫传感器，实现了谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的快速灵敏检测。该杂化磁性材料具有良好的富集能力，吸附量最高可达1.68 mg/g。基于竞争免疫的均相化学发光免疫传感器实现了无洗涤、高灵敏度的脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测，检测限低至46.7 pg/mL，线性范围为0.1至1000 ng/mL。在稻米、玉米和小麦中的回收率分别为80.0%至118.2%、91.1%至116.7%和80.0%至91.5%，相对标准偏差不超过9.11%。该策略与高效液相色谱-质谱法在盲样分析中具有高度一致性，为谷物中霉菌毒素的筛查提供了便捷方法。
【引言】
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON）是一种普遍存在的高毒性真菌毒素，摄入被其污染的谷物产品可能导致食物中毒、呕吐、腹泻乃至死亡。在欧洲、日本以及美国等地已有相关病例报道。联合国粮农组织与世界卫生组织均将DON列为谷物中最危险的污染物之一。
本研究首先采用水热合成法制备了Fe₃O₄磁性纳米粒子（Magnetic Nanoparticles, MNPs），并通过聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone, PVP）进行表面修饰以增强其稳定性和分散性能。随后，通过Fe₃O₄ MNPs与金属有机骨架-5（Metal-Organic Framework-5, MOF-5）之间的化学键合制备了杂化磁性材料。在检测过程中，该杂化材料MOF-5@Fe₃O₄ MNPs作为吸附剂和分离载体，用于谷物样品中DON的磁性固相萃取（Magnetic Solid-Phase Extraction, MSPE）。MSPE后，洗脱液通过基于光纤的均相化学发光（Optical Fiber Homogeneous Chemiluminescence, OFHCL）免疫传感器进行检测。在DON存在的情况下，DON与辣根过氧化物酶(HRP)标记的DON竞争光纤表面固定的DON抗体，从而减少了HRP-DON复合物在光纤上的结合量。加入H2O2后，HRP-DON催化其生成单重态氧，促使吖啶酯从其邻近状态转变为激发态。当激发态的化学发光底物返回至基态时，化学发光现象随之发生，其强度与HRP浓度呈正相关。因此，谷物样品中DON的浓度与化学发光强度成反比。
图1.(A)MOF-5@Fe₃O₄ MNP的合成工艺示意图。(B)谷物中DON的磁固相萃取示意图。(C)利用OFHCL测试DON原理示意图
【结果】
1.Fe₃O₄纳米颗粒和MOF-5@Fe₃O₄ MNP的合成与表征
本研究以FeCl3，SDS和NaAc为原料采用水热合成法合成Fe₃O₄ MNP，并使用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）对其进行表面改性，以提升其稳定性和分散性能。以改性后的Fe₃O₄ MNPs、硝酸锌和对苯二甲酸为原料，在高温条件下合成了MOF-5@Fe₃O₄杂化磁性材料。随后，通过动态光散射(DLS)、扫描电子显微镜(SEM)、X射线衍射(XRD)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)对MOF-5@Fe₃O₄ MNP进行了全面表征。DLS结果表明合成的Fe₃O₄ MNP具有良好的单分散性和均匀的球形，平均尺寸约为280 nm，MOF-5呈立方体形状，直径约为2 μm，并且其表面覆盖了多个Fe₃O₄ MNP。XRD证实同时存在Fe₃O₄ MNP和MOF-5衍生峰。FT-IR光谱发现了特属于MOF-5@Fe₃O₄ MNP的震动峰。以上结果均表明MOF-5@Fe₃O₄ MNP的合成成功。
2.MOF-5@Fe₃O₄ MNP性能评价
为了评估MOF-5@Fe₃O₄ MNP的性能，研究人员利用高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)检测回收率的方式对吸附剂用量、吸附时间、吸附温度等参数做对比优化。结果表明，最佳吸附剂用量为12 mg，最佳吸附时间为30 min，最佳吸附温度为30℃。同时对解吸条件进行了对比优化，确定最佳洗脱液为乙腈，最佳解吸时间为10 min，最佳pH值为6.0。在最佳条件下，MOF-5@Fe₃O₄ MNP实际效果与免疫亲和柱的效果相当。采用Langmuir模型和Freundlich模型拟合MOF-5@Fe₃O₄ MNP对DON的吸附等温线，最终计算出MOF-5@Fe₃O₄ MNP的最大吸附容量为1.68 mg/g。此外，实验还证实了所合成的MOF-5@Fe₃O₄ MNP具有良好的重复使用性，降低了其使用成本。
图2.优化(A)吸附剂用量、(B)吸附时间、(C)吸附温度、(D)洗脱液类型、(E)解吸时间、(F)溶液pH对DON MSPE的影响。(G) MOF-5@Fe₃O₄ MNP吸附DON的等温线。(H)MOF-5@Fe₃O₄MNP和免疫亲和柱提取谷物中DON的色谱分析。(I)MOF-5@Fe₃O₄MNP的可重用性。
3.OFHCL免疫传感器均相反应过程的可行性验证及OFHCL免疫传感器制备
本研究引入了均相反应机制来构建OFHCL免疫传感器。在含有H2O2的溶液中，当吖啶酯和HRP酶处于接近状态(< 200nm)时，HRP酶催化H2O2产生的单线态氧分子可以将能量传递给吖啶酯，使其转化为激发态。但是，如果两者的距离比较远(> 200nm)，单线态氧分子则无法有效地将能量传递给发光底物，此时不会有信号产生。因此，不需要将未结合的HRP-DON从反应体系中分离出来，从而实现无水洗操作。本研究通过使用HRP标记的山羊抗小鼠模拟验证的方式证实了化学发光强度的变化是HRP和吖啶酯状态变化的结果，从而验证了均相反应过程的可行性。
本研究首先去除光纤上的丙烯酸保护层及表面的二氧化硅包层，随后利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷对光纤进行硅烷化处理引入氨基，最终在光纤上连接DON抗体制备了OFHCL免疫传感器。分别利用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和能量色散X射线(EDS)及原子力显微镜(AFM)对OFHCL的制备效果进行了表征。FT-IR发现于酰胺III带的1240cm−1和1310cm−1处出现了两个与蛋白质二级结构完全对应的吸收峰。EDS光谱发现在能谱中除裸露的光纤所含有的C、O和Si还有来自抗体的N、P和S。AFM图像显示相较改性前光纤表面光滑平坦，修饰抗体后的光纤表面出现了宽度约为15 nm的白斑。以上结果均表明抗体被包被到了光纤上，OFHCL免疫传感器制备成功。
图3.光纤探头检测原理验证及表征。(A) C1梯度和C2梯度的化学发光强度。(B) C1梯度和C2梯度的OD450。(C)裸光纤和抗体修饰光纤的FT-IR光谱。(D)裸光纤和(E)抗体修饰光纤的AFM图像。
4.利用OFHCL免疫传感器检测DON
本研究随后对影响检测的关键参数进行了优化，包括抗体浓度、HRP-DON浓度、DMF与水的比例以及免疫反应时间。确定的最佳条件分别为：抗体浓度20μg/mL、HRP-DON浓度5 μg/mL、DMF与水的比例40%、免疫反应时间60min。在上述最佳条件下，评价了OFHCL免疫传感器检测DON的灵敏度。线性方程为Y = 2699.72 X−3641 (X = log[DON (ng/mL)]， R2 = 0.99)，检出限(LOD)为46.7 pg/mL，在0.1至1000 ng/mL范围内存在良好的线性关系。OFHCL免疫传感器与传统OFCL方法的灵敏度相当。
图4.OFHCL免疫传感器的条件优化及性能评价。优化(A) DON抗体浓度，(B) HRP-DON浓度，(C) DMF比，(D) DON检测免疫反应时间。(E) OFHCL免疫传感器与常规OFCL法DON检测的标准曲线和(F)线性范围。
5.真实样本分析
为了证明这种集成检测策略在实际应用中的可行性，本研究使用三种谷物(水稻、玉米和小麦)进行了标准恢复实验。实验结果表明稻谷、玉米、小麦的加标回收率分别为80% ~ 118.2%、91.1% ~ 116.7%、80% ~ 91.46%相对标准偏差分别为6.42% ~ 8.91%、6.44% ~ 9.9%、6.98% ~ 8.27%。这些结果表明所建方法具有良好的准确度和稳定性。在真实样本测试时OFHCL免疫传感器与HPLC-MS方法的结果一致，证实了该方法在实际环境中的可靠性和准确性。
图5.真实样本分析。(A) OFHCL免疫传感器、HPLC-MS法和常规ELISA法检测小麦样品DON的定量结果。“√”为阳性样品。(B) OFHCL免疫传感器与HPLC-MS检测小麦样品中DON的一致性
【总结】
本研究开发了一种综合检测策略，通过将MOF-5@Fe₃O₄ MNP为基础的MSPE与OFHCL免疫传感器相结合，用于分析谷物中的DON。MOF-5与Fe₃O₄ MNP之间的化学键合赋予了该杂化材料较高的化学稳定性和出色的DON富集能力，最大富集量可达1.68 mg/g。此外，该材料表现出良好的可重复利用性，具有显著的成本效益，显示出替代商用MSPE材料的巨大潜力。基于距离依赖的OFHCL免疫传感器通过同质免疫分析法实现了DON的快速检测，具有高特异性、高灵敏度、高稳定性和便携性。该免疫传感器检测DON的线性范围为0.1 ~ 1000 ng/mL，检出限为46.7 pg/mL。在三个实际样品中应用该综合检测策略，回收率范围为80.0% ~ 118.2%，RSD小于9.11。
原文出处：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.135356
指导教师：王战辉
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