白细胞介素-17调控损伤上皮细胞的缺氧适应性

       哺乳动物细胞自主激活缺氧诱导转录因子（HIFs），以确保在低氧环境中生存。作者在此报道，损伤诱导的缺氧不足以在受损上皮细胞中触发HIF1α。相反，多模式单细胞和空间转录组学分析和功能研究表明，视黄酸相关孤儿受体γt+（RORγt+）γδT细胞衍生的白细胞介素-17A（IL-17A）对于激活HIF1α是必要和充分的。IL-17受体C（IL-17RC）通过蛋白激酶B（AKT）和细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的信号传导激活哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR），从而激活HIF1α。IL-17A–HIF1α轴驱动伤口前沿上皮细胞的糖酵解。IL-17RC、HIF1α的上皮细胞特异性缺失或糖酵解阻断会破坏上皮修复能力。作者的发现强调了炎症、代谢和迁移程序的耦合，以加快上皮愈合，并阐明在修复过程中细胞适应缺氧压力时免疫细胞的作用。

       上皮屏障限制了致病环境介质的渗透。因此，器官存活依赖于损伤后屏障完整性的快速修复。来自受伤微环境（即缺氧、基因毒性和氧化应激）的痛苦信号会引起原始的细胞内在反应，以确保上皮细胞适应恶劣条件。同时，生长因子和细胞因子等辅助细胞产生的外源性“二次信号”直接导致裸露表面的再上皮化。在组织修复过程中，外源性微环境信号是否以及如何与原始细胞应激反应交叉还有待探索。

       上皮细胞受到淋巴细胞库的监视，这些淋巴细胞对损伤可以产生快速反应。这些“第一反应者”包括先天性、类先天性和适应性淋巴细胞，对受损上皮分泌的应激物质产生反应。应激物诱导的淋巴细胞活化触发白细胞介素-17A（IL-17A）、IL-17F和IL-22的产生，已报道这些细胞因子具有有丝分裂作用。然而，上皮细胞增殖对于伤口再上皮化是可有可无的，这是一个需要上皮细胞穿过缺口迁移的过程。因此，确定淋巴细胞-上皮细胞相互作用下游的迁移程序至关重要。

       损伤部位的上皮细胞必须应对恶劣的伤口微环境，包括低氧和营养物质匮乏、活性氧物种以及细胞和微生物碎片。对这些严重情况的适应究竟是如何发生的，以及它们是否与修复相关淋巴细胞释放的因子有关，目前尚不清楚。为了解决这个问题，作者采用皮肤上皮损伤模型，皮肤是机体的一个主要屏障，已经进化出复杂的修复机制，也是淋巴细胞介导的免疫监测的原型位点。使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学、成像和小鼠遗传策略来跟踪淋巴细胞和伤口边缘上皮细胞之间的交流信号，作者鉴定了视黄酸相关孤儿受体γt+（RORγt+）γδT细胞衍生的IL-17A作为这种相互沟通的重要介质。通过上皮细胞IL-17受体C（IL-17RC）的IL-17A信号传导通过激活缺氧诱导因子1α（HIF1α）来协调迁移和缺氧适应程序。IL-17A–HIF1α转录轴诱导糖酵解，这是伤口上皮化所必需的。因此，作者挑战了一种长期以来的观点，即缺氧足以自主诱导HIF1α介导的代谢重塑。此外，作者阐明了微环境信号，如淋巴细胞衍生的IL-17A，在促进这种适应性组织反应中的作用。

结果 

       为了以无偏差的方式确定第一反应淋巴细胞的组成，作者通过测序（CITE-seq）对转录组和表位进行了细胞索引。从未损伤的皮肤和全层损伤后第3天、第5天的皮肤组织中纯化CD45+CD90+淋巴细胞并进行分析。对4923个细胞进行PCA和UMAP分析显示存在12个集群，其中效应性和调节T（Treg）淋巴细胞有明显的分群。因为淋巴细胞以低丰度转录物著称，作者使用表面蛋白表位和转录物进行明确的簇注释。与未损伤对照相比，T辅助和细胞毒性T（TH/TC）细胞簇1至3，γδT细胞和粘膜相关T（MAIT）细胞簇、自然杀伤和自然杀伤T（NK2/NKT）细胞蔟以及Treg细胞簇2和3在受伤皮肤中富集（图1A）。因此，与预期相反，没有出现占主导地位的修复相关淋巴细胞群。相反，许多不同的免疫细胞群体在急性损伤中会发生实质性的重塑。

       接下来，作者检测了Th1、Th2、Th17和Treg细胞的细胞因子表达。其中，Th17细胞因子Il17a和Il17f以及Th1细胞因子Ifng在损伤样本中富集（图1B）。17型免疫包括由主转录因子RORγt控制的不同细胞类型，该因子也与修复有关。事实上，RORγt+淋巴细胞在人类和小鼠的上皮伤口前沿部位富集（图1C和D）。Rorgt-EGFP小鼠的将绿色荧光蛋白（EGFP）敲入Rorgt基因座，使Rorgt失去功能。使用纯合的Rorgt-EGFP小鼠（以下称为GFP-KI），作者测量了在没有RORγt的情况下的伤口闭合能力。与相应的对照组相比，GFP-KI小鼠RORγt的基因缺失和RORγt抑制剂地高辛的局部给药均导致伤口闭合率降低40%至50%。

       人类皮肤完全通过上皮再形成愈合，这一过程依赖于上皮增殖和随后迁移到伤口。相比之下，小鼠通过上皮再形成和肌成纤维细胞介导的真皮收缩来愈合。因此，作者用硅胶夹板固定小鼠伤口，以消除真皮收缩。显微镜观察发现，在GFP-KI夹板伤口中，角蛋白14+（K14+）整合素α5+上皮细胞迁移率出现特异性损伤，但不损伤上皮增殖（图1E）。类似地，与未夹板的GFP-KI伤口相比，上皮的迁移相对于对照组明显受到影响（图1E）。

       鉴于伤口中RORγt+淋巴细胞的快速富集，作者假设常驻RORγt+淋巴细胞局部扩张以促进修复。事实上，相对于未受伤的皮肤，伤口RORγt+细胞的细胞周期基因高表达（Mki67、Cdk1和Top2a）和5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）的高掺入（图1F和G）。为了确定皮肤RORγt+淋巴细胞是否足以引发修复，作者用FTY720治疗小鼠，FTY720是一种鞘氨醇-1磷酸受体激动剂，通过将淋巴细胞“捕获”在淋巴结内来抑制淋巴细胞进入血液。FTY720阻断不会改变伤口RORγt+细胞的频率或上皮迁移的速度（图1H）。因此，先前存在的皮肤RORγt+细胞的扩增足以驱动上皮再形成。

图1

IL-17RC介导γδT细胞-上皮细胞相互作用，控制再上皮化

       作者使用多参数流式细胞术绘制了修复过程中皮肤RORγt亚群的动态图。先天性γδT细胞、MAIT（MR1四聚体+）和不变的NKT（iNKT）细胞（CD1d四聚体+）在损伤后的第一天首先扩增。适应性TH17、TC17和RORγt+Treg细胞随后在D3和D5之间增加。淋巴细胞（ILC3）在损伤中没有变化，这表明在有适应性免疫的情况下，ILC3可能不会在修复中发挥主导作用。

       为了确定哪个RORγt亚群位于再上皮化的伤口前沿，作者转向了空间转录组学（ST），这是一种能够以50µm分辨率对组织进行空间分辨转录谱分析的技术。PCA和UMAP分析区分出了未损伤皮肤组织区域中的七个簇和受伤皮肤中的六个簇（图2A和B）。所鉴定的簇与代表组织结构的组织学区域和基因一致（图2A和B）。通过Krt14和Krt17的表达可以辨别伤口边缘上皮。然而，为了确认表皮伤口边缘簇的身份并验证作者的ST数据，作者进行了多模式交叉分析（MIA），这是一种可以推断组织区域中细胞类型富集的方法。将一个独立的scRNA-seq数据集与作者的ST数据进行整合，该数据集将受伤上皮定义为生长停滞细胞，将伤口远端上皮细胞定义为Col17a1+细胞，揭示了Col17a1+细胞和伤口远端上皮簇3（P=2.3×10−16），生长停滞细胞和伤口边缘上皮簇4（P=5.4×10−35）之间存在显著重叠。接下来，作者利用MIA来解决由作者的CITE-seq数据确定的伤口淋巴细胞群的位置（图1A）。来自每个效应淋巴细胞CITE-seq簇和每个ST簇的前300个上调基因（≥0.25 log FC）的MIA，确定了作者在受伤皮肤中的所有淋巴细胞群的定位，并揭示了伤口边缘上皮细胞群4中γδT/MAIT簇1（P=7.9×10−6）和簇2（P=1.9×10−5）的特异性富集（图2C）。

       γδT细胞和MAIT细胞都与伤口修复有关。然而，在再上皮化的背景下，这些和其他RORγt+细胞亚群之间缺乏系统的比较。因此，作者分析了RORγt+γδT细胞缺陷小鼠（Tcrd CreER; Rorc fl/fl）、RORγt+MAIT细胞缺陷小鼠(Mr1−/−) 和RORγt+TH17/TC17/MAIT/iNKT细胞缺陷小鼠（Cd4 Cre；Rorc fl/fl）。他莫西芬诱导耗竭后，Tcrd CreER; Rorc fl/fl小鼠与对照动物相比，表现出更慢的迁移率，这表明RORγt+γδT细胞在伤口再上皮化中发挥非冗余作用（图2D）。Mr1−/−和Cd4 Cre；Rorc fl/fl小鼠的伤口迁移率与各自的对照组相当，强调了RORγt+γδT细胞在指导上皮再形成中的单一性（图2E和F）。RORγt+γδ T细胞通过产生细胞因子IL-17A和IL-17F发挥强大的效应功能，这些细胞因子向周围的薄壁组织提供指导性信号。在CITE-seq分析的所有效应淋巴细胞中，γδT/MAIT细胞簇在创伤后的第3天，这些细胞因子的表达水平最高，暗示它们在伤口边缘的RORγT+γδT细胞-上皮细胞相互作用中的作用（图2G）。因此，皮内注射重组小鼠IL-17A（rmIL-17A）可以逆转GFP-KI小鼠的再上皮化缺陷（图2H）。

       IL-17A/F信号传导是由IL-17受体A（IL-17RA）–IL-17RC异二聚体介导的，而IL-17F也可以结合IL-17RC/RC同源二聚体复合物。ST图显示，伤口边缘的Il17ra和Il17rc转录物增加，其中表达最突出的是Il17rc（图2I）。因此，作者制备了上皮特异性IL-17RC缺陷小鼠(Krt14 Cre;Il17rc fl/fl labeled Il17rc EKO)，并构建了上皮损伤模型。与IL-17RC正常的小鼠相比，IL-17RC上皮特异性缺失表现出与GFP-KI和Tcrd CreER; Rorc fl/fl 小鼠相同的上皮化缺陷（图2J）。因此，RORγt+γδ T细胞提供的IL-17A/F直接与上皮IL-17RC结合，诱导迁移和上皮再形成。

图2

HIF1α是一种由RORγt+细胞控制的上皮再形成因子

       PCA和UMAP图整合了来自损伤第3天的野生型（WT）和GFP-KI组织切片，识别出了15个细胞簇，具有很高的生物可重复性（图3A和B）。基于组织学和上皮再形成因子Gjb2、Lamc2、Mmp9、Mmp13和Stfa1的表达，作者重点研究了伤口边缘簇7和8。作者进一步将簇7划定为伤口边缘基底上皮细胞（Krt5、Krt6、Krt14和Krt17），将簇8划定为伤口边缘分化上皮（Krt10、Lce1a1和Lor）。WT和GFP-KI簇7差异表达基因的通路分析揭示了WT中IL-17信号传导、皮肤/表皮发育、表皮分化、上皮细胞/组织迁移和T细胞激活通路的富集（图3C）。通常与组织缺氧相关的HIF1信号传导也作为一种差异表达途径出现（图3C），与GFP-KI伤口边缘相比，WT中的Hif1a转录物更高（图3D）。

       为了验证这一发现，作者分析了WT和GFP-KI伤口的整合素α5和整合素α6双阳性伤口边缘上皮细胞（迁移边缘）以及仅整合素α6阳性的伤口远端上皮的转录组。作者观察到WT和GFP-KI伤口远端上皮之间存在较小差异（62个差异表达基因，调整后P＜0.1）。相反，WT和GFP-KI迁移的前沿细胞具有1548个差异表达的转录物（调整后的P＜0.1）。HIF1α信号传导和相关的糖酵解途径在WT样品中显著富集。与Hif1a转录物的富集一致，野生型移行上皮细胞前沿核HIF1α蛋白水平也显著增加，这在GFP-KI伤口前沿是不存在的（图3E）。

       此外，Il17rc EKO小鼠表型复制了在GFP-KI伤口中观察到的HIF1α缺陷（图3F）。核HIF1α也在人类伤口的迁移上皮前部强烈表达，这表明该转录因子在上皮再形成中具有高度保守的作用。HIFs普遍介导细胞对低氧环境的适应。因此，作者使用荧光缺氧标记物吡莫尼唑（PIM）和纤维探针直接测量组织O2含量，测量了WT和GFP-KI伤口的缺氧情况。WT和GFP-KI伤口具有等效的PIM信号和O2水平（约10至12 mmHg或2%O2）（图3G和H）。此外，WT和GFP-KI上皮表达相当水平的脯氨酰羟化酶（Egln1、Egln2和Egln3）和Vhl泛素连接酶。因此，即使在组织缺氧和具有必要的调节机制的情况下，伤口边缘上皮也无法在没有RORγt+细胞衍生信号的情况下维持HIF1α。

       接下来，作者制备了上皮细胞特异性HIF1α缺陷小鼠(Krt14 Cre; Hif1a fl/fl labeled Hif1a EKO)，并构建了上皮细胞损伤模型。上皮HIF1α的缺失损害了迁移上皮细胞的发育和形成（图3I）。此外，与GFP-KI小鼠不同，重组小鼠rmIL-17A未能挽救Hif1a EKO小鼠的上皮再形成缺陷。因此，上皮HIF1α对于响应IL-17A信号和激活迁移程序是必要的。

图3

IL-17RC信号通过细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）-AKT-哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）诱导HIF1α

       为了验证作者的假设，即γδT细胞衍生的IL-17作为激活HIF1α的第二信号，作者将rmIL-17A、rmIL-17F或rmIL-22皮内注射到未损伤的皮肤中。给予rmIL-17A和在较小程度上给予rmIL-17F足以诱导表皮HIF1α活化和增生（图4A）。IL-22略微增加了表皮厚度，但没有上调HIF1α。在rmIL-17A存在下培养5天的皮肤上皮类器官显著大于对照，并稳定表达HIF1α（图4B）。其他损伤相关细胞因子[rmIL-1、rmIL-6和重组鼠肿瘤坏死因子α（rmTNFα）]没有激活HIF1α。表皮生长因子也未能将HIF1α增强到rmIL-17A治疗后观察到的水平，这突出了IL-17在扩增该途径中的特异性。

       IL-17RA和IL-7RC在上皮类器官和伤口边缘整合素α5+细胞中强烈表达。Il17rc的上皮特异性缺失消除了rmIL-17A在体内和体外激活HIF1α的能力，排除了辅助细胞在这种串扰中的作用（图4C和D）。为了描述上皮IL-17RC信号传导如何导致HIF1α激活，作者比较了GFP-KI和WT伤口转录组学（图3A至C）。mTOR信号传导与HIF1α调节有关，是一种重要的差异表达途径。因此，作者评估了核糖体蛋白S6S240/244 磷酸化，这是mTOR1的主要下游底物。rmIL-17A在WT中显著增加了上皮S6S240/244 磷酸化，但在Il17rcEKO小鼠和类器官中没有（图4E和F）。

图4

       rmIL-17A处理的类器官还显示上游p-S6KT389和p-mTORS2448的激活增强（图5A和B）。雷帕霉素对mTOR的抑制显著降低了IL-17A下游的HIF1α蛋白（图5A至C）。此外，在rmIL-17A刺激后，Hif1a EKO和对照类器官具有相似的mTOR激活水平，证实mTOR位于HIF1α的上游。除了增强HIF1α蛋白外，rmIL-17A刺激还以mTOR依赖的方式诱导Hif1a基因表达（图5D）。rmIL-17A处理的类器官中，Hif1a转录物的增加不是由增强的mRNA稳定性引起的，并且在rmIL-17A存在的情况下，HIF1α蛋白被更快地降解。因此，mTOR控制IL-17A下游的HIF1α转录和蛋白水平，但不控制稳定性。

       为了确定IL-17RC近端信号传导是否以及如何与mTOR连接，作者接下来测量了rmIL-17A刺激后的早期（≤1小时）mTOR激活，并发现p-S6KT389 和p-S6S240/244富集。作者检测到IL-17A刺激后p-ERK1/2T202/Y204（IL-17RC信号传导的经典介质）和蛋白激酶B（p-AKTS473）（上游mTOR激酶）的激活（图5E）。长期和短期rmIL-17A治疗（分别为30分钟和5天）后，ERK1/2（U0126）或AKT（MK-2206）的抑制，降低了p-S6KT389, p-S6S240/244和HIF1α的表达（图5E）。然而，阻断ERK也导致p-AKTS473的代偿性增加。ERK和AKT的双重抑制消融了rmIL-17A刺激下游的mTOR-HIF1α反应（图5E）。

       鉴于伤口边缘缺氧的突出性，作者接下来检查了在急性（5小时）或慢性（5天）缺氧条件（2%O2）下培养的类器官中的IL-17A–mTOR–HIF1α轴。急性缺氧足以稳定HIF1α，IL-17A进一步增强了这种反应（图5F）。相反，与作者的体内损伤数据一致，p-S6S240/244和HIF1α水平因长期缺氧暴露而显著降低，并因rmIL-17A的存在而得到逆转（图5F）。雷帕霉素治疗消除了IL-17A在慢性缺氧培养物中增强HIF1α的能力（图5G）。因此，IL-17A在常氧和缺氧条件下直接有效地诱导mTOR上调HIF1α（图5H）。

图5

IL-17A依赖性代谢重编程对上皮再形成至关重要

       迁移是上皮再形成的一个主要特征，需要细胞消耗能量。然而，迁移的上皮细胞究竟是如何在缺氧的伤口微环境中满足其能量需求的尚不清楚（图3G和H）。糖酵解和氧化磷酸化是两种主要的细胞能量产生途径。其中，已知HIF1α控制糖酵解的转录程序。因此，与GFP-KI相比，WT伤口前沿表达更高水平的糖酵解相关基因[己糖激酶2（hk2）、磷酸甘油酸激酶1（Pgk1）和葡萄糖转运蛋白1（Slc2a1）]（图6A）。rmIL-17A治疗显著增加了上皮类器官中葡萄糖转运蛋白1（Slc2a1）和糖酵解酶的表达（图6B）。与对照组相比，rmIL-17A处理的类器官具有更高的糖酵解活性和糖酵解能力，并分泌更高水平的乳酸，这是糖酵解的最终产物（图6C）。与mTOR在调节HIF1α中的作用一致，雷帕霉素处理或Hif1a EKO类器官表达的糖酵解酶水平低于对照（图6D和E）。GKP-KI、Il17rc EKO和Hif1a EKO伤口边缘上皮表达的葡萄糖转运蛋白1水平显著低于其各自的对照（图6F和G）。rmIL-17A给药挽救了GKP-KI伤口中的葡萄糖转运蛋白1水平。因此，IL-17A–HIF1α轴在上皮细胞中诱导糖酵解代谢程序。 

       作者的研究结果提出了IL-17A–HIF1α依赖性葡萄糖代谢程序促进上皮迁移的可能性。作者用2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）局部治疗小鼠，2-DG是一种抑制糖酵解的葡萄糖类似物。2-DG处理的小鼠具有比对照小鼠显著更短的整合素α5+上皮细胞迁移。阻断糖酵解不会改变上皮细胞增殖，这表明糖酵解对于扩大伤口前部的上皮细胞数量是可有可无的。2-DG处理也导致伤口边缘型17细胞的减少。因此，作者转向体外上皮划痕试验来评估局部2-DG治疗的免疫效果。在存在和不存在重组人IL-17A（rhIL-17A）的情况下，2-DG或HIF1α抑制剂（BAY872243）阻碍了人上皮细胞迁移和恢复体外“伤口”的能力（图6H）。因此，IL-17A增强糖酵解，这是一种为上皮细胞迁移提供动力的重要生物能量途径，可以加速愈合。

图6

讨论

       总之，作者的结果表明，RORγt+γδ T细胞提供的IL-17A对于伤口边缘上皮中HIF1α的最佳激活是必要的。HIFs是一类原始的转录因子，存在于所有后生动物细胞中，并在低氧微环境中稳定下来。先前的研究将HIF1α在受损皮肤和肠上皮中的表达增加归因于组织缺氧。因此，作者发现伤口边缘的慢性缺氧环境不足以激活HIF1α，这促使作者对未愈合伤口和慢性缺氧条件下的IL-17和HIF1α的其他次级激活剂进行研究。

       与已发表的报告一致，作者发现急性缺氧会强烈诱导HIF1α。相比之下，暴露于慢性缺氧（与伤口微环境一致）会导致mTOR降低，从而导致HIF1α降低。慢性缺氧时mTOR下调的原因尚不清楚，需要进一步研究。然而，在这种情况下，IL-17A作为“第二信号”通过ERK1/2和AKT激酶激活mTOR。作者发现IL-17A诱导的mTOR控制HIF1α基因转录和蛋白质水平，但不控制稳定性。因此，作者的研究结果表明，在复杂的组织微环境中适应缺氧除了需要细胞自主的氧气监测外，还需要来自辅助细胞的第二信号。

       IL-17A将伤口边缘上皮的代谢重组导向糖酵解程序。最近的工作强调了IL-17A诱导的糖酵解在成纤维细胞存活和增殖中的作用，与此相反，伤口边缘上皮细胞不需要糖酵解来增殖。相反，这种能量产生机制对伤口前沿的上皮细胞迁移至关重要。HIF1α和糖酵解是肿瘤进展和转移的驱动因素，这就提出了IL-17A或其他免疫衍生信号驱动癌症中的这些途径的可能性。IL-17A也是许多自身免疫性疾病病理学的核心，包括银屑病、炎症性肠病和脊柱关节病。除糖酵解外，其他HIF1α转录靶点也可能助长IL-17介导的上皮病变。因此，作者在这里发现的IL-17A–HIF1α轴可能为广泛的炎症和转移性疾病提供治疗机会。