摘要
癌症进展过程中DNA甲基化的维持需要DNA甲基转移酶1（DNMT1）。本课题组曾发现DNMT1是口腔鳞状细胞癌（OSCC）进展的潜在标志物，然而DNMT1相关的全基因组DNA甲基化如何调控OSCC仍不清楚。本研究通过不同临床队列样本结合多维度生信分析，证实DNMT1和DNA甲基化状态与OSCC发生发展密切相关；联合DNA甲基化芯片、RNA-seq、scRNA-seq、多重免疫组化等技术，系统分析OSCC中DNMT1依赖性全基因组DNA低甲基化稳态，揭示靶向DNMT1重塑的广泛DNA低甲基化模式；再进一步整合临床样本、多个细胞株和异种移植瘤动物模型等多模态实验数据，证实上述新的DNMT1-DNA低甲基化模式可协同抑制PI3K-AKT和CDK-Rb信号通路，实现更显著的抑瘤效果；结合毒副作用监测及分子免疫学方法，证实DNMT1-DNA低甲基化模式可诱导GSK3β失活，从而巧妙规避OSCC治疗中PI3K抑制所致的高血糖和胰岛素反馈毒性反应。
背景
OSCC是一种起源于口腔上皮细胞的异质性恶性肿瘤，是典型的多阶段癌变过程的代表，包括上皮增生、不典型增生和原位癌。由于治疗后易复发和转移，OSCC患者尤其是晚期患者的生存率很低。近年来出现了新的治疗方法，通过靶向癌细胞中的异常信号分子或蛋白，如EGFR和PD-L1，来改善OSCC患者的生存状况。然而，由于基因组不稳定、信号级联失调或药物毒性等因素，靶向治疗往往因肿瘤细胞耐药性而疗效受限。因此，有必要全面了解上皮癌变和肿瘤生长的潜在机制，以确定防治OSCC的新靶点。
DNA甲基化是真核生物中普遍存在的一种表观遗传修饰，可调控基因表达模式、细胞类型特异性基因组稳定性和胚胎发育，与OSCC进展密切相关。与肿瘤发生相关的DNA甲基化模式改变会随着细胞增殖而逐渐发生。值得注意的是，癌细胞具有全基因组DNA低甲基化景观，导致癌细胞不稳定和肿瘤异质性。DNMT1是最常见的DNA甲基转移酶，在DNA复制过程中对维持DNA甲基化稳态至关重要。DNMT1稳定性和活性的任何改变都会导致DNA甲基化的广泛变化。既往研究预测DNMT1是与OSCC进展相关的潜在靶点。然而，DNMT1通过DNA甲基化和信号转导调控OSCC发生发展的机制尚不清楚。
已有DNA去甲基化药物进行了临床试验，用于治疗包括头颈部癌症在内的恶性肿瘤，但治疗效果各不相同。肿瘤具有复杂的信号网络，调控多种细胞过程，包括增殖、细胞死亡和代谢，也影响着靶向制剂。因此，干预可导致细胞生长停滞或死亡的关键信号通路，如PI3K和CDK，被认为是防止肿瘤发展和消除肿瘤细胞的重要方法。鉴于DNA甲基化是信号转导修饰的上游调控因子，而DNMT1在维持全基因组DNA甲基化稳态中发挥重要作用，DNMT1或可维持动态信号转导的平衡。
结果
1.DNMT1在OSCC发展过程中的表达情况，及其对肿瘤生长的影响
首先，研究人员通过检测从正常口腔组织到增生和不典型增生病变，最后到OSCC组织的人类样本，发现随着口腔恶性转化，DNMT1的表达逐渐升高，并在OSCC组织中达到峰值（图1A）。然后，通过一系列OSCC细胞系，确认它们的DNMT1表达明显高于人正常口腔角质形成细胞（NOK）。接着，选择代表性的Cal27和FaDu细胞敲低DNMT1（shDNMT1-1和shDNMT1-2）。由于shDNMT1-1的基因沉默效果更显著，因此被用于后续研究。敲低DNMT1可显著抑制上述细胞增殖，表现为BrdU和Ki67表达降低（图1B）、体外成球能力降低（图1C）。此外，构建OSCC移植瘤小鼠模型（图1D），shDNMT1转染细胞表现出显著降低的成瘤能力，表现为肿瘤生长减缓、细胞增殖减少和凋亡增加（图1 E-G）。利用GSE30784数据集的RNA-seq数据，观察到在口腔恶性转化过程中DNMT1表达逐渐升高（图1H）。随后，从TCGA数据库获取了原发性OSCC和正常组织，并对匹配的临床病理和随访记录的更大患者队列进行了进一步分析。与癌旁组织相比，DNMT1在OSCC中高表达（图1I）。通过平滑曲线拟合患者的临床病理和随访数据，发现DNMT1表达和OSCC死亡风险之间的非线性动态关联，尽管差异不显著（图1J）。简单来说，在感染点2.92之前，随着DNMT1表达升高，死亡风险呈上升趋势；此后，潜在关系反转。使用限制性立方样条分析（RCS）来评估它们的非线性关系，表明DNMT1表达和总生存期危险比之间存在波动关系(图1K)。这些结果表明DNMT1高表达有助于启动口腔恶性转化，有利于肿瘤细胞的恶性行为，从而促进OSCC生长。
图1
为了进一步验证DNMT1靶向OSCC，作者使用DNMT1抑制剂，即GSK-3484862和GSK-3685032进行平行实验，以确定DNMT1在OSCC细胞生物学行为（主要是增殖和凋亡）中的作用。不间断干预一周后，两种抑制剂均能持续降低OSCC细胞中DNMT1的表达（图2A）。在不同浓度下，两种抑制剂均能降低OSCC细胞中增殖标志物Ki67的表达，升高凋亡标志物cleaved caspase 3（CC3）的表达，与DNMT1敲低效果一致（图2A-C）。在功能上，两种抑制剂均有效抑制了OSCC细胞的自我更新能力（图2D-E）。
图2
2.全基因组DNA低甲基化在口腔癌变过程中发生，并作为一种癌症特异性稳态在OSCC中稳定维持
研究人员收集了一组新鲜的人类样本，包括正常口腔组织、增生和不典型增生病变以及OSCC组织，检测了5-甲基胞嘧啶（5-mC），这是一种在胞嘧啶的第五个碳原子上的共价甲基化，被公认为全基因组DNA甲基化的特异性标记。与正常组织相比，不典型增生和OSCC组织显示出更低的5-mC表达，而正常和增生组织之间无显著差异（图3A）。使用850k甲基化芯片测定细胞的全基因组DNA甲基化水平，与NOK相比，Cal27表现出明显不同的DNA甲基化位点，且低甲基化位点约为高甲基化数量的2.16倍（图3B）。这两种细胞类型之间不同CpG相关甲基化位点的分布反映了850k芯片上Infinium探针分布（图3C）。当使用基因区域探针时，大多数DMSs位于基因体区域而非启动子（图3D）。对前3000个显著DMSs的β值分析揭示了Cal27比NOK更高程度的低甲基化（图3E）。对前1000个显著DMSs分析发现，OSCC细胞中存在一小部分显著高甲基化位点，其中大多数位于CpG岛（CGI）内（图3F）。总之，这些DNA甲基化芯片数据表明OSCC细胞中存在癌症特异性低甲基化状态。这种内部低甲基化稳态可能与维持癌细胞存活有关，因为GO分析所富集到的生物过程包括细胞间信号传导、细胞增殖、调节运输和细胞分化等（图3G）。将850k的DMGs、细胞RNA-seq和TCGA数据库的DEGs重叠后，GSEA分析识别出与上皮恶性肿瘤和癌症进展密切相关的通路，包括Hedgehog、Hypoxia、PI3K-AKT-mTOR、P53和EMT（图3H）。此外，与正常样本相比，虽然OLK病变的DNA甲基化水平未降低，但OSCC组织中存在显著降低（图3I）。这可能由于该数据集中的OLK病变没有在病理学上细分为增生或不典型增生。TCGA数据库同样证实OSCC组织中全基因组DNA甲基化水平低于癌旁组织（图3J）。平滑曲线拟合显示DNA甲基化和死亡风险之间存在非线性动态关联，高DNA甲基化水平与OSCC患者更低的死亡风险相关（图3K）。而无论DNA甲基化水平显著降低还是升高，OSCC患者危险比均降低，从而提高生存率（图3L）。以上表明，在口腔恶性转化过程中观察到的进行性全基因组低甲基化偏离了健康细胞中的典型甲基化模式。然而，肿瘤细胞似乎能够维持其恶性表型特有的甲基化稳态，这可能有助于其无限生长。靶向该特异性甲基化稳态可能是干预肿瘤细胞增殖的潜在手段。
图3
3.靶向DNMT1重塑OSCC全基因组DNA低甲基化模式
在shDNMT1-OSCC移植瘤小鼠中检测5-mC，发现其表达显著低于对照组（图4A），表明DNMT1可能与低甲基化和肿瘤抑制有关。使用850k芯片检测shDNMT1或shNC Cal27细胞，与shNC-Cal27相比，shDNMT1-Cal27表现出几乎完全的DNA低甲基化，其低甲基化差异位点约为高甲基化位点的61.02倍（图4B）。前3000个DMSs的β值分布显示Cal27中DNA甲基化状态几乎完全改变（图4C）。以上表明DNMT1是调控DNA甲基化的关键酶，其活性的任何改变都密切影响DNA甲基化水平。进一步分析芯片结果发现，敲低DNMT1后的差异低甲基化位点大多位于CGI shore，而非CGI（图4D）。评估前1000个DMSs，shDNMT1-Cal27表现出完全的DNA低甲基化，且仅少数DMSs分布于CGI（图4E）。分析基因区域的分布发现，DMSs主要位于基因体，其次是TSS1500（图4F）。KEGG分析DMGs表明，PI3K-AKT是最显著富集的信号通路（图4G）。随后检测PI3K-AKT通路的甲基化改变，发现与NOK相比，Cal27中该通路相关基因DMSs的平均甲基化水平略低（图4H），而shDNMT1则会导致关键基因更广泛的低甲基化（图4I）。此外，参与PI3K-AKT信号通路激活的关键基因，包括PIK3CD、PIK3R1和AKT1，呈现动态低甲基化状态；相反，抑制基因PTEN与NOK细胞中观察到的一致（图4J）。以上说明，敲低DNMT1可直接重塑OSCC的全基因组DNA低甲基化模式，导致PI3K-AKT通路改变，从而表现出更广泛的全基因组DNA低甲基化。
图4
4.DNMT1-DNA低甲基化模式抑制PI3K-AKT通路
将Cal27与NOK、shDNMT1-Cal27与shNC-Cal27之间前3000个DMGs重叠后进行KEGG分析，进一步证实PI3K-AKT通路的参与（图5A）。WB显示PI3K抑制剂BEZ235处理和shDNMT1-OSCC细胞中p-AKT和p-mTOR均显著降低（图5B)，表明PI3K-AKT的激活受到DNMT1-DNA低甲基化的阻碍。使用PI3K激动剂(740Y-P)进行挽救实验发现，740Y-P能够部分恢复shDNMT1细胞中mTOR的磷酸化水平（图5B）。这提示DNMT1可调控PI3K-AKT通路，且可能有DNMT1调控的其他机制参与。使用OSCC移植瘤小鼠模型（图5C）发现，在应用shDNMT1或PI3K抑制剂后，肿瘤生长均减少，且两者相比,shDNMT1的抑瘤作用更明显；而联合应用shDNMT1和PI3K激动剂后，观察到肿瘤生长相较于shDNMT1组略有增加（图 5D）。mIHC显示,shDNMT1组和PI3K抑制剂组细胞增殖减少、凋亡增加（证明其显著的抑瘤作用），p-AKT和p-mTOR水平降低（证明其阻断了PI3K-AKT通路）；而应用PI3K激动剂后，PI3K-AKT通路部分恢复，但与shNC组相比仍受抑制（图5E）。这也提示DNMT1特异性DNA低甲基化模式可能存在其它抑制肿瘤生长的机制。此外，还检测了DNMT1或5-mC与p-AKT在人类样本中的表达，发现在口腔恶性转化时p-AKT表达升高、DNMT1表达升高以及5-mC表达降低（图5F）。
图5
5.靶向DNMT1通过额外抑制CDK2-Rb通路导致更明显的肿瘤抑制
与shNC细胞相比，shDNMT1细胞中CDK1/2/3和Rb的磷酸化水平降低（图6A），证实CDK2-Rb通路也被抑制。此外，PI3K抑制剂也能抑制CDK2-Rb通路，且联合应用PI3K抑制剂和CDK2抑制剂AT7519表现出最明显的抑制作用，这表明PI3K-AKT和CDK2-Rb信号通路之间可能存在相互作用。然而，PI3K激动剂并不能完全恢复CDK2-Rb活性，表明DNMT1介导的CDK2-Rb和PI3K-AKT抑制可能同时发生。此外，在恶性转化过程中，存在进行性的p-Rb水平升高、DNMT1表达升高以及5-mC降低（图6B），证实DNMT1-DNA甲基化模式对CDK2-Rb通路的调控作用。应用移植瘤小鼠模型发现，联合抑制剂组表现出与shDNMT1组相当的肿瘤生长抑制；与PI3K抑制剂组相比，shDNMT1组在早期就表现出更明显的抑瘤作用（图6C）。在该实验结束时，与shNC组相比，所有干预组的肿瘤体积均显著缩小。然而，与两个抑制剂组相比，shDNMT1组的抑瘤效果并不明显（图6D-E）。这可能归因于DNMT1的可逆性，抵消了DNMT1敲低的影响。IHC显示三个干预组的细胞增殖减少、凋亡增加以及p-Rb减少（图6F），表明DNMT1重塑的DNA低甲基化可同时抑制PI3K-AKT和CDK2-Rb通路，从而抑制肿瘤生长，且靶向DNMT1有更明显的抑瘤效果。
图6
6.靶向DNMT1可抑制GSK3β，促进肿瘤细胞凋亡并拮抗PI3K抑制所诱导的胰岛素反馈
在移植瘤小鼠模型中，shDNMT1组和联合抑制剂组的p-GSK3β水平升高，而单独抑制PI3K组p-GSK3β降低；shDNMT1组和联合抑制剂组的糖原水平相似，均明显高于PI3K抑制剂组和对照组，尤其是PI3K抑制剂组几乎没有糖原沉积；shDNMT1组和联合抑制剂组的PFK和PKM2阳性率也更高，表明细胞糖酵解增强，且大多分布在糖原沉积较多的区域（图7A）。此外，糖原沉积和糖酵解增强的细胞主要出现在肿瘤凋亡区附近，而远离增殖区（图7B）。以上表明DNMT1诱导的GSK3β失活可通过异常的糖代谢促进肿瘤细胞死亡。WB显示，只有shDNMT1组能抑制PI3K-AKT和GSK3β激活，而CDK2抑制剂组可升高p-AKT（图7C）；表明shDNMT1可同时使PI3K-AKT、CDK2-Rb和GSK3β失活，从而恢复信号平衡。此外，在人类口腔恶性转化过程中观察到p-GSK3β表达升高，伴随着p-AKT升高、DNMT1升高和DNA甲基化水平降低（图7D）。以上进一步证明PI3K-AKT-GSK3β通路参与OSCC发展。
图7
动物模型和临床试验表明PI3K抑制剂会引起系统性葡萄糖紊乱。从而限制其临床应用。在OSCC小鼠模型中（图8A），PI3K抑制剂组出现进行性血糖升高，同时血清胰岛素水平持续升高；联合抑制剂组血糖水平明显持续降低、血清胰岛素水平也降低；shDNMT1组则在血糖和胰岛素水平上均表现处明显的稳定性（图8E）。此外，小鼠肝脏IHC显示，仅PI3K抑制剂组表现出明显的高糖原水平，伴随着p-GSK3β表达升高；联合抑制剂组出现肝糖原储存减少和p-GSK3β水平降低，表明肝糖原分解有助于血糖恢复正常（图8F-H）。以上表明，在PI3K抑制所诱导的高血糖背景下，抑制DNMT1最有可能降低维持正常血糖稳态的不良毒性，从而提高抗癌疗效（图8I）。
图8
7.DNMT1介导通路在OSCC发生发展和治疗中的协同作用
为了进一步验证这种协同模式在口腔恶性转化中的作用，使用GSE181919数据集进行scRNA-seq分析。从正常组织、OLK组织和HNSCC组织中聚类出上皮细胞群，并将其分为二倍体和非整倍体细胞，后者代表恶性细胞群。拟时分析显示，正常上皮细胞有两个进展分支，分别通向癌前状态或癌变状态，非整倍体细胞主要位于后者（图9A）。随着上皮细胞向癌变状态发展，PI3K-AKT、mTOR、CDK-Rb-E2F和糖酵解等通路被激活；且与癌前趋势相比，这些参与恶性转化的通路均表现出持续激活（图9B）。对调控这种信号协同模式的单个关键基因也进行拟时分析，发现在上皮癌变过程中，DNMT1、AKT1、CDK2 和 GSK3B表达升高，而负向调控基因PTEN表达降低（图9C）。以上单细胞转录组结果进一步证实这种信号协同模式在口腔癌变中的关键作用。此外，对移植瘤进行mIHC确定了核心调控标志物在蛋白质功能水平上的共定位（图9D）。在增殖活跃的OSCC组织中，肿瘤细胞表现出高水平的p-AKT、p-Rb和p-GSK3β；且大多数细胞都表现出这三种标记物的共定位，无论是高表达或低表达。敲低DNMT1后，移植瘤表现为较小的散在病灶，p-AKT和p-Rb水平降低，而p-GSK3β仍广泛表达，且p-Rb和p-GSK3β的改变独立于p-AKT改变。以上再次证实DNMT1在协调多种信号通路中的强大调控作用。
图9
讨论
全基因组DNA低甲基化是恶性肿瘤的显著特征，OSCC中DNMT1高表达与全基因组低甲基化并存的现象反映出，DNMT1的上调可能是维持DNA甲基化平衡的一种补偿机制。抑制DNMT1可以重塑一个几乎完全的低甲基化模式，并能有效抑制肿瘤，提示DNMT1在维持原有甲基化模式中的关键作用，其失活可直接触发OSCC中DNA甲基化失调。此外，靶向DNMT1重塑的甲基化模式并不遵循恢复正常细胞的轨迹。相反，它有可能在DNA复制过程中严重破坏DNA甲基化平衡，最终抑制细胞增殖或诱导死亡。另一方面，DNMT1改变引起的DNA甲基化改变可影响一系列生物学过程和信号通路，导致OSCC恶性行为改变。本研究证实靶向DNMT1重塑的DNA低甲基化模式通过PI3K-AKT、CDK2-Rb和GSK3β介导的糖原代谢来协同调节OSCC发生发展。因此，使用化合物、生物材料或纳米药物靶向干预DNMT1有望成为OSCC治疗的新方向。但还需要进一步研究DNMT1如何重塑特定的DNA低甲基化模式，这将有助于更深入地了解驱动OSCC进展的表观遗传学机制，从而确定新的治疗靶点，改善OSCC患者的治疗效果。
