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癌细胞编辑基因表达以逃避免疫监视。然而，缺乏早期肿瘤发生过程中基因编辑的全基因组研究。在这里，我们在乳腺癌基因工程小鼠模型(GEMM)中使用单细胞RNA测序来无偏见地识别编辑过的基因。晚期肿瘤抑制抗肿瘤免疫基因，减少浸润性免疫细胞和肿瘤免疫细胞间的通讯。在下调肿瘤基因列表中，主要是先天免疫基因，尤其是干扰素刺激基因，而调节细胞内在恶性肿瘤的基因大多未被编辑。早期肿瘤中的初始和活化的CD8+ T细胞在晚期肿瘤中被耗尽或前体耗尽的细胞所取代。低剂量地西他滨可通过抑制DNA甲基化逆转免疫基因的抑制，从而抑制肿瘤生长并恢复免疫控制，增加肿瘤浸润淋巴细胞的数量、功能和记忆，减少髓系抑制细胞的数量。地西他滨诱导了GEMM、植入性乳腺和黑色素瘤中重要的干扰素、焦亡和坏死基因、炎症细胞死亡和免疫控制。
免疫治疗的临床成功清楚地表明免疫细胞可以控制肿瘤的生长。然而，大多数实体癌对目前的免疫疗法没有反应。虽然免疫监视限制和消除了一些新形成的免疫原性肿瘤，但生长引起疾病的肿瘤迅速进化抵抗免疫监视和逃避免疫控制。Schreiber及其同事发表的具有里程碑意义的论文假设肿瘤编辑它们的基因表达以避免免疫识别和清除。他们通过其功能后果来定义免疫编辑:减少免疫识别和控制。编辑可以通过基因突变、扩增、删除和/或基因表达的表观遗传修饰来实现。免疫逃避肿瘤克隆还可以通过塑造肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)来抑制细胞毒性淋巴细胞功能，进一步促进免疫逃避。
以前的免疫编辑研究主要检查激活抗肿瘤T细胞的基因和/或途径。抗原加工和递呈的下调、检查点受体配体、免疫抑制细胞因子和“不要吃我”信号的上调、TME免疫细胞的募集和排斥不良以及免疫抑制TME是已知的肿瘤免疫逃避策略。肿瘤抗原在免疫正常而非免疫缺陷小鼠的肿瘤发育过程中发生突变和表观遗传沉默，这表明免疫选择同时利用遗传和表观遗传机制来降低肿瘤的免疫反应性。
T细胞效应功能和记忆的刺激依赖于激活先天免疫的危险信号，以招募免疫细胞到危险部位，并允许免疫细胞区分自我和非自我，或肿瘤，正常细胞和转化细胞。如果没有危险信号，淋巴细胞很快就会对肿瘤产生耐受。DNA启动子超甲基化抑制先天性免疫干扰素(IFN)、坏死性坏死和焦亡通路，这些信号在一些癌症中已经被描述。
由于新发肿瘤难以检测，因此尚未对早期肿瘤发生过程中基因表达变化进行全基因组研究。肿瘤基因编辑在多大程度上涉及抑制免疫基因与促进内在细胞恶性肿瘤的基因，目前尚不清楚。
基因工程小鼠模型(GEMM)肿瘤是有吸引力的模型，因为它们在组织中自然产生，比癌细胞系更接近于人类癌症，可用于研究肿瘤免疫和免疫治疗，并且具有可诱导的癌基因，可同步肿瘤发生和荧光素酶或荧光报告基因，以识别新转化的细胞。众所周知，GEMM对免疫治疗具有耐药性，因此提供了严格的治疗模型。
在这里，我们采取利用诱导MMTV驱动Erbb2Δ16癌基因产生的侵袭性乳腺癌GEMM来无偏见地识别在早期肿瘤发生过程中被抑制的基因表达。单细胞RNA测序(scRNA-seq)比较癌基因诱导后1周的早期GEMM肿瘤与1个月后形成的肿瘤，发现大多数被抑制的基因参与免疫信号传导，特别是先天免疫，包括IFN和IFN刺激基因(ISGs)。晚期肿瘤中许多被抑制的免疫基因可以通过抑制DNA甲基转移酶(DNMTs)来降低，从而重建免疫监视。
1、乳腺肿瘤编辑细胞图谱
强力霉素治疗成年雌性ErbB2ΔEx16+/−MTB+/−小鼠诱导小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)驱动的ErbB2缺失外显子16的乳腺表达，删除16个氨基酸的近膜序列，产生组成型活性HER2和侵袭性乳腺肿瘤。在7-28天内，80-90%的小鼠发展为对检查点阻断(CPB)有抗性的转移性HER2+乳腺肿瘤。为了确定肿瘤发生过程中的早期变化，从癌基因诱导后5-10天(早期)或30-35天(晚期)收获的肿瘤中制备scRNA-seq文库(每组n=4个样本)(图1a)。在使用Seurat对原始数据进行质量评估后，通过无监督聚类和手动检查典型标记进行注释，分析了表达20499个基因的24,798个细胞。细胞聚集成三种主要的细胞类型——上皮细胞粘附分子(EpCAM+)上皮细胞、CD45+免疫细胞和Fap+ /Dcn+成纤维细胞——以及23个亚簇(图1b、c)。
上皮细胞分为九个亚簇:四个发光肺泡亚群，Alv1-4 (Elf5+Csn2+);激素感知(Prlr+Esr1+)，基础(Krt14+);肺泡-基底，同时具有肺泡和基底特征(Aldh1a3+)和增殖和/或循环肺泡(Mki67+)细胞(图1b，d-g)。EpCAM、增强的绿色荧光蛋白(eGFP)和HER2 (Erbb2)表达以及基于分化/成熟对细胞进行分层的CytoTRACE算法用于鉴定正常、转化和转化的上皮亚簇(图1d-g)。少于12%的激素感应亚簇表达eGFP或HER2，并且主要包含正常上皮细胞(扩展数据图1c)。尽管Alv1和2经常表达EpCAM、eGFP和HER2，但所有Alv1-4亚型表达的成熟标志物都多于增殖型、Alv-基底和基底亚簇，后者分化程度较低。基于这些数据，我们随后的分析集中在低分化增殖，Alv-basal和basal亚簇上，将它们定义为肿瘤细胞。其他分化程度更高的亚簇也表达EpCAM、eGFP和Erbb2，可能同时包含正常乳腺上皮和转化细胞。早期和晚期肿瘤细胞的亚簇丰度没有显著差异(扩展数据图1d)。
图1 乳腺癌GEMM早期和晚期肿瘤的scRNA-seq定位
a、 实验设置:8周龄雌性ErbB2ΔEx16转基因小鼠在饮水中给予多西环素诱导乳腺肿瘤，在早期(5-10天，n=4)或后期(30-35天，n=4)时间点收获肿瘤细胞，分离成单细胞，进行scRNA-seq分析。
b、 统一歧形近似和投影(UMAP)图，包括早期和晚期GEMM文库中的24,798个细胞和20,499个基因:使用无监督聚类算法和已知细胞标记的人工检查鉴定了23个原代细胞亚型。
c、 显示原代细胞类型(左)或早期和晚期肿瘤细胞分布(右)的UMAP图。原代细胞类型为EpCAM+上皮细胞(早期肿瘤927例，晚期肿瘤6582例)、CD45+免疫细胞(早期肿瘤7152例，晚期肿瘤8539例)和FAP+ /DCN+成纤维细胞(早期肿瘤1546例，晚期肿瘤52例)。
d-g，基于EpCAM(d)和eGFP(e)的表达以及通过CytoTRACE检测EpCAM+ eGFP+细胞的成熟状态(f)，上皮细胞簇被划分为肿瘤和非肿瘤(g)。子类型标记显示在扩展数据图1和2中。a，使用BioRender.com创建。源数据图1提供了UMAP坐标和单元元数据。CM:中央存储器;前,疲惫不堪;Alv,肺泡。
2、编辑过程中免疫相关肿瘤基因的下调
使用线性模型(MAST)鉴定了晚期和早期肿瘤细胞之间的差异表达基因(DEG)。在晚期和早期样本中，总共有229个基因下调，128个基因上调(错误发现率(FDR) <0.05，对数倍变化(|logFC|) >0.25)(图2a)。显著下调的基因是IFN和ISG(n=144, isg从干扰素数据库中查询)，包括9个鸟苷酸结合蛋白，参与细胞内感染防御。下调肿瘤基因的基因本体(Gene Ontology, GO)富集分析发现179个显著的，主要是免疫相关的GO项(q值< 0.05;图2b)。
代表性最高的术语涉及先天免疫，特别是I型和II型IFN (IFNI和IFNII)和感染防御。
先前描述的负责抗原加工和递呈以及淋巴细胞杀伤的适应性免疫途径也被高度过度描述。在排名前40位的氧化石墨烯术语中，只有氧化磷酸化与免疫力没有直接关系。该氧化石墨烯术语捕获了线粒体电子传递链复合物I、III、IV和V中的多个基因。晚期与早期肿瘤DEGs的Hallmark基因集富集分析还发现，最显著下调的途径是I型和II型ifn和氧化磷酸化。在晚期肿瘤中，所有179种氧化石墨烯术语的共享基因都被显著下调。13个主要的相互关联的术语集群广泛地确定了功能群，包括适应性免疫、先天免疫和代谢(图2c)。节点数最多的GO术语簇与细胞杀伤、T细胞介导免疫和适应性免疫有关。第二大簇包含与线粒体氧化磷酸化和ATP合成相关的术语(图2c)。其他大型集群集中在先天免疫，I型IFN，细胞因子和趋化因子信号传导，适应性免疫，抗原加工和递呈。晚期肿瘤中显著上调的基因集中在与致癌信号相关的Hallmark基因集，如KRAS和p53，以及与细胞增殖和存活、代谢、应激反应或免疫抑制相关的术语。凋亡相关基因在晚期肿瘤中更加突出。转移不在最高上调的过程之列。下调基因的富集项的P值远低于上调基因的富集项。综上所述，氧化石墨烯术语富集分析表明，肿瘤编辑主要是抑制肿瘤免疫的免疫编辑，而不是促进细胞增殖或侵袭性的基因改变。
图2 肿瘤发生早期，肿瘤细胞下调免疫相关基因。
a， 肿瘤早期和晚期deg的火山图。采用广义线性模型(MAST检验)确定双侧P值并定义deg (logFC>0.25, FDR调整P<0.05)。通过这种切断，与早期肿瘤相比，晚期肿瘤中有229个基因下调，128个基因上调。
b， 晚期肿瘤中富集P值最显著的前50个GO项与下调基因相关(q < 0.05)。GO术语组手工标注。
c， 晚期和早期肿瘤中与下调基因相关的显著氧化石墨烯项的相互作用网络(q < 0.05)。基于GO术语和共享基因的相似性，使用EnrichmentMap方法生成网络。颜色表示由图聚类识别的无监督聚类。人工将无监督的聚类分为更广泛的组，以代表适应性免疫、先天免疫和代谢。节点大小与富集的显著性成正比(−log(P))。
b,c，富集统计量:单侧Fisher精确检验。使用q值法调整P值以进行多次比较。源数据图2给出了网络P值、节点和边缘信息。
3、炎性基因在早期肿瘤中的低表达
焦亡和坏死引起免疫原性细胞死亡(ICD)，从而促进肿瘤的免疫原性。然而，参与这些途径的基因在早期和晚期肿瘤中并没有DEG。这些通路中的关键基因(焦亡中的Gsdmd、Gsdme、Nlrp3、坏死下垂中的Ripk3)在早期和晚期肿瘤中均表达不足。它们的低表达导致分析差异表达的统计力较低。在早期或晚期肿瘤中，只有1%的肿瘤细胞有Nlrp3, 7%的肿瘤细胞有Gsdmd, 9%的肿瘤细胞有Ripk3。尽管Gsdme在44%的肿瘤细胞中有相关的读数计数，但其表达一直很低。为了更灵敏地检测这些基因，我们从早期和晚期肿瘤中分离出CD45−EpCAM+ eGFP+肿瘤细胞，并通过反转录定量PCR (RT-qPCR)分析关键的坏死、焦亡和ISG基因。这些炎症基因在早期和晚期GEMM肿瘤中表达均较低，除Gsdmd和Gsdme在早期和晚期肿瘤中表达均较低外，大多数基因在晚期肿瘤中表达均显著降低。在五项独立的scRNA-seq研究中，这些基因在正常乳腺上皮中也表达不足。在任何正常上皮细胞亚型中均未检测到背景以上的Gsdme, Gsdmd、Nlrp3和Rip3k的表达极低，每种亚型中只有0-9%的细胞有任何测序读数。这些数据表明，焦亡和坏死基因在非粘膜GEMM中没有被显著编辑，因为它们在该组织中的表达已经被抑制。
4、肿瘤浸润淋巴细胞在晚期肿瘤中改变
scRNA-seq分析将肿瘤浸润性免疫细胞分为五大群:B细胞(Cd79a+)、中性粒细胞(S100a9+)、巨噬细胞(Fcgr3+ Cd74+ Lyz2+)、自然杀伤细胞(NK) (Ncr1+)和T细胞(Cd3d+)(图1b)。共划分了10个T细胞亚群:2个CD4+亚群(调节性T细胞(Treg)和幼稚型CD4+ T细胞)和8个CD8+亚型(幼稚型(Ccr7+ Sell+ Il7r+ Tcf7+ Bach2+)、效应型(Cd44+ Ctsw+ Nkg7+)、增殖型(Cd44+ Mki67+ Top2a+ Stmn1+)、组织常驻记忆样20 (TRM, Cd44+ Itga1+ Itgae+ Xcl1+ Chn2+)、中枢记忆型(Cd44+ Ccr7+ Sell+ Il7r+ Tcf7+)、祖细胞耗散型(Cd44+ Tcf7+ Bach2+ Pdcd1+)。衰竭(Cd44+ Tcf 7−Bach2−Fcer1g+ Pdcd 1hiLag3hiCd244ahi)和高表达ISG的亚群21,22 (CD8+ ISG+ T细胞，Isg15+ Ifit1+ Irf7+)(图1b和3a)。CD8+ TRM肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)比其他亚群存活时间更长，增殖更多，杀死肿瘤细胞更有效。激活的TRM细胞产生IFNγ和肿瘤坏死因子(TNF)，它们驱动树突状细胞成熟以增强肿瘤免疫。祖细胞耗尽CD8+ TIL寿命更长，增殖更多，并作为耗尽CD8+ TIL的储存库，这些CD8+ TIL具有更高的共抑制受体基因表达，寿命短，增殖有限。人类的CD8 ISG+ TIL簇被认为是IFN诱导的激活状态。
然后用Dirichlet多项式回归比较早期和晚期样品的T细胞和NK细胞特征。在肿瘤晚期，CD4+和CD8+初始T细胞比例明显下降，而祖耗尽和耗尽CD8+ T细胞比例增加(图3b)。肿瘤内CD4+和CD8+ T细胞和NK的表型和功能标记基因变化一致(图3c)。所有三个亚群都显示Klf2减少，Klf2是一种控制幼稚淋巴细胞归巢到次级淋巴组织的转录因子。肿瘤晚期CD4+和CD8+ TIL显著降低幼稚细胞和记忆细胞标记转录物的表达，包括Ccr7、Cd69和Cd28。CD8+ T细胞整体上也下调Tcf7，编码T细胞干细胞性、记忆形成和CD8效应功能所需的TCF1，并上调大量共抑制受体基因(Pdcd1(编码PD-1)、Lag3、Cd244a、Tigit、Ctla4、Cd160)。NK TIL表现出衰竭特征的变化，包括Eomes(NK功能主调控因子)和NK效应基因(Gzma、Ifng、Prf1)显著减少，共抑制受体基因(Lag3、Tigit、Cd160)显著增加(图3c)。CD8+ T细胞亚簇内基因表达的变化不太明显，可能是因为亚簇名称已经确定了不同的功能。因此，scRNA-seq数据捕获了早期肿瘤发生中T细胞衰竭的演变。
图3 肿瘤晚期浸润的T和NK细胞表现出衰竭的迹象。
a, T和NK细胞的UMAP。
b，肿瘤浸润性T和NK细胞簇在早期和晚期肿瘤中的比例。星号表示两组间差异显著(经FDR校正P<0.05)，采用双侧Dirichlet多项检验。颜色编码如a。
c，肿瘤浸润T细胞和NK细胞在早期和晚期肿瘤中关键标志物的表达比较。
标记对应于共刺激分子(黑色)、分化和激活标记(红色)、粘附分子(蓝色)、转录因子(绿色)、功能效应物(橙色)、衰竭标记(棕色)和趋化因子(紫色)。采用广义线性模型(MAST检验)确定差异表达的双侧P值。y轴表示对数归一化基因表达，基于每个细胞中缩放和对数转换的scRNA-seq读取计数。***表示FDR调整后P<0.05，|logFC|>0.25。
源数据图3给出b、c、P值
5、肿瘤编辑会破坏肿瘤免疫细胞的通讯
下调的转录本表明，肿瘤编辑可能会破坏肿瘤细胞与TIL之间的通信。基于所有细胞中配体受体基因共表达的变化，CellChat用于比较早期和晚期scRNA-seq数据中推断的细胞-细胞相互作用。超过107个重要的细胞通讯通路在早期或晚期肿瘤中活跃(图4a,b)。在这里，我们推断44个通路在早期样本中明显更活跃，29个过程在晚期样本中具有更高的活性(Wilcoxon秩和检验P<0.05)。在早期样本中活跃的13条通路在晚期肿瘤中不活跃，包括重要的先天(II型IFN, LIGHT (TNFSF14)，IL2信号传导)和适应性(CD80共刺激，主要组织相容性复合体(MHC)-II结合)免疫通路。NK表达IFNII，激活巨噬细胞，抑制肿瘤生长，被广泛的肿瘤亚型和大多数免疫细胞感知，仅在早期肿瘤中。同样，CD8+ TRM细胞表达LIGHT，这是一种促炎细胞因子，可刺激T细胞并激活NF-κB以增加先天免疫和/或触发细胞凋亡，仅在早期肿瘤中被所有肿瘤和一些免疫亚群感知。
由于细胞毒性NK和CD8+ TIL是抑制肿瘤生长的关键，我们进一步分析了NK或CD8+ TRM与肿瘤细胞之间的细胞通讯途径(图4c)。早期肿瘤中的多种配体-受体相互作用在晚期肿瘤中减少或无法检测到，包括巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、ITGB2-ICAM1、IL-7、TNF和GzmA等参与免疫细胞募集和功能的物质。当我们结合细胞间通讯和DEG分析(图4d)时，NK和肿瘤细胞之间IFNII信号的丢失可归因于晚期样本NK中IFNγ转录物的丢失。MIF与其受体CD74相互作用，启动信号级联，激活NF-κB，促进淋巴细胞存活。晚期肿瘤中MIF信号的丢失可能归因于CD74的肿瘤细胞转录物减少，CD74与CD44异二聚体。
推断出晚期样本中单个CD8+ TIL亚型与肿瘤细胞之间的细胞通讯包括肿瘤与多个CD8+ TIL亚型之间的MHC-I-CD8相互作用，以及晚期样本中MIF、IL2、CXCL和CX3C信号通路。比较合并肿瘤细胞与合并CD8+ TIL之间的相互作用，发现晚期肿瘤中共抑制信号的潜在显著增加。推断出CD8+ TIL与肿瘤细胞和肿瘤浸润性骨髓细胞之间的相互作用表明，肿瘤晚期共抑制信号(PD-1-PD-L1, TIGIT-PVR/Nectin 2, CTLA-4-ICOSL/CD86)的增强，主要是由于CD8+ TIL上共抑制受体表达增加，而不是肿瘤细胞或肿瘤浸润性骨髓细胞上免疫检查点配体的增加(图3c)。其他检查点抑制受体配体编码基因(Pdcd1lg (PD-L2)， Fgl1 (LAG3配体))或Lgals9 (Tim3的凝集素9配体)要么未被检测到，要么几乎未被检测到。总的来说，我们的数据表明肿瘤和浸润性免疫细胞的变化降低了免疫监视。
图4 肿瘤进展过程中肿瘤免疫细胞通讯中断
a， 使用CellChat软件分析早期和晚期肿瘤之间推断通信变化最显著的前30条途径的热图。行表示通信路径。列表示作为信号通路的发送者(表达配体)或受体(表达受体)参与主动相互作用的细胞类型。通讯强度的分配基于配体-受体对的共表达。非零强度值表示使用CellChat单侧排列检验确定的重要推断通信事件(P<0.05)。
b， 在早期样品中选择的推断细胞-细胞通信途径具有活跃的信号传导，在后期样品中丢失。箭头表示配体(源节点)和受体(靶节点)之间的重要相互作用。线路颜色代表信号的来源，线路宽度代表通信的强度。使用CellChat单侧排列检验计算显著相互作用(P<0.05)。
c， 早期和晚期肿瘤中NK细胞(左)或CD8+ TRM细胞(右)向肿瘤细胞亚簇的选定信号的比较。行表示预测的配体-受体相互作用。实点表示显著相互作用(P<0.05)。通讯强度与配体-受体对的共表达有关。P值表示通信强度值的显著性，该值是使用CellChat单侧排列检验计算的。
d， 小提琴图显示IFNII配体和受体的标准化表达(左)和MIF(右)途径推断肿瘤细胞与NK和CD8 TRM在早期和晚期肿瘤中的相互作用。y轴表示对数归一化基因表达，基于每个细胞中缩放和对数转换的scRNA-seq读取计数。采用广义线性模型(MAST检验)确定差异表达的双侧P值。***表示FDR调整后P<0.05， |logFC| >0.25。P值如源数据图4所示。Max,最大;Min,最低;PARs，蛋白酶激活受体。
6、DAC增加GEMM肿瘤免疫原性和免疫控制
DNMT启动子甲基化抑制基因表达。为了评估DNA高甲基化是否会降低肿瘤免疫，携带晚期GEMM的肿瘤(平均肿瘤大小，300 mm3，多西环素诱导后1个月)用地西他滨(DAC，第1周5mg kg-1 ×3，第2周2mg kg-1 ×3)或PBS对照治疗。两只携带最大肿瘤(~1,000 mm3)的小鼠接受DAC以测试其对大肿瘤的有效性。测试的最高剂量(5 mg kg-1)是异速比例的小鼠剂量，对应于用于治疗老年血液恶性肿瘤的低剂量(每天15 mg m-2)，达到纳摩尔人血浆浓度。PBS治疗小鼠的平均肿瘤体积在18天内增加了4倍，而DAC治疗小鼠的肿瘤体积减少了8倍以上，其中2只(6只DAC治疗中)最小的肿瘤变为无瘤(图5a)。DAC产生了CD8+、CD4+和NK TIL升高的高度免疫原性TME(图5b)。CD8+ CD103+ TRM细胞的比例增加了大约四倍(图5c) 。DAC治疗的肿瘤具有两倍的经典1型树突状细胞(cDC1)(图5d)，这是TRM细胞的最佳基质32。相比之下，免疫抑制性骨髓源性抑制细胞(MDSCs)和肿瘤相关巨噬细胞在dac治疗的肿瘤中明显减少(图5e)。此外，在DAC处理的小鼠中，更多的NK TIL表达颗粒酶B (GzmB)和穿孔素(PFN)，更多的CD8+和NK TIL在体外刺激后产生IFNγ和TNF(图5f,g)。因此，抑制DNA甲基化强烈地抑制了GEMM肿瘤的生长并重建了抗肿瘤免疫。
在最后一次DAC或载体治疗后1天收集的CD45-EpCAM+ GFP+晚期肿瘤细胞，通过RT-qPCR分析比较GEMM中的关键先天免疫基因。DAC上调Ripk1和Ripk3 (necroptosis)、Gsdmd和Gsdme (pyroptosis)、Irf7 (IFN通路)和Cxcl9(趋化因子)。其他一些先天性免疫基因在GEMM肿瘤细胞中显示出与DAC相关的增加，但无统计学意义。
图5 DAC抑制乳腺肿瘤生长，促进抗肿瘤免疫
a-g, DAC对强力霉素诱导ErbB2ΔEx16小鼠乳腺肿瘤1个月前肿瘤生长和免疫应答的影响。DAC (5mg kg−1，第1周;2mg kg-1(第2周)或PBS在红色箭头所示的天数给予。
a， 小鼠的平均肿瘤生长情况(左图)以及单独处理的对照小鼠(中)和DAC处理小鼠(右)的肿瘤生长曲线。
b， 小鼠活体细胞浸润CD8+ T细胞(左)、CD4+ T细胞(中)或NK细胞(右)的百分比。
c， 用对照或DAC处理的小鼠，抗原经历的CD44+ CD8+ TIL中CD103+ TRM TIL的百分比。
d， 肿瘤中每106个骨髓细胞中CD103+树突状细胞(DC)的数量。
e， DAC或对照药物处理小鼠肿瘤活细胞中Gr-1+ CD11b+ MDSC(左)或CD11b+ F4/80+肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的百分比(右)。
f， 表达GzmB和PFN的CD8+ TIL(左)或NK TIL(右)在对照或DAC处理小鼠肿瘤中的百分比。
g， 用肉豆蔻酸磷酯(PMA)和离子霉素在体外激活小鼠肿瘤后产生IFNγ或TNF的CD8+ TIL(左)或NK TIL(右)的百分比。所示数据为平均值+ s.e.m。和是两个独立实验的代表。
a，采用Student's t检验比较第18天肿瘤体积(载体(PBS) n=4, DAC n=6);b-e，学生t检验或Mann - Whitney检验。f,g，采用Holm-Sidak法进行I型误差修正的多重t检验(载体(PBS) n=4, DAC n=4，因为两只DAC处理的小鼠均治愈)*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001。源数据中提供了精确的P值。
7、DAC抑制4T1肿瘤，增强抗肿瘤免疫
8、DAC通过多种途径抑制沉默的免疫基因
图6:DAC上调的基因与晚期肿瘤中下调的基因重叠。
a， 从肿瘤可触及时开始，用载药(PBS)(n=7)或DAC治疗2个周期的小鼠原位4T1肿瘤生长(0.2mg kg−1,n=8);1mg kg−1,n=5;5mg kg−1,n=7)。红色箭头表示治疗。
b， 通过RT-qPCR分析接受两周期DAC (1mg kg−1)治疗的小鼠与未接受PBS治疗的小鼠(每组n=4)相比，原位4T1肿瘤中免疫相关基因的相对mRNA表达。分析其产物参与焦亡(红色)、坏死(蓝色)、炎症因子(橙色)和I型IFN通路(绿色)的基因。将各靶基因mRNA归一化为Gapdh，再将DAC处理组的比值归一化为载药对照组的比值。
c， 体外暴露于DAC后4T1显著DEGs的火山图。采用DESeq2算法(Wald检验)确定双侧P值。使用FDR方法调整P值以进行多重比较。
d， 在GEMM乳腺肿瘤免疫编辑过程中显著下调的基因与DAC处理4T1乳腺肿瘤细胞时显著上调的基因之间存在重叠。Venn图表示在4T1 RNA-seq和GEMM RNA-seq中均表达的基因。统计数据是用Fisher精确检验计算的。红色和蓝色部分的数字表示不重叠的基因。下表:84个重叠基因在晚期转化的肿瘤细胞中下调，在体外DAC处理的4T1中上调。ISG以紫色突出显示。
e， 在4T1中，前150个GO术语的相互作用网络与DAC上调基因显著相关(q<0.05)。该网络由EnrichmentMap基于GO术语和共享基因的相似性确定。颜色表示由图聚类识别的无监督聚类。无监督集群被人工分类为更广泛的功能组。富集统计量:单侧Fisher精确检验。使用q值法调整P值以进行多重比较。所示数据为平均值+ s.e.m。和是两个独立实验的代表。
a，通过计算每个样本的曲线下面积值来比较肿瘤生长曲线，然后使用Holm-Sidak多重比较进行单因素方差分析。b，多重t检验。FDR的计算采用Benjamini、Krieger和Yekutieli的两阶段升压法。* P≤0.05, * *P≤0.01,* * * P≤0.001,* * * * P≤0.0001。d，使用Biorender.com创建。源数据中提供了精确的P值。
9、4T1的DAC活性取决于细胞毒性淋巴细胞
接下来，我们研究了哪些免疫途径有助于改善DAC介导的肿瘤控制。杀伤淋巴细胞CD8+和NK TIL的肿瘤细胞消除依赖于PFN将诱导死亡的颗粒酶传递到肿瘤中。在PFN缺陷小鼠中，DAC对4T1原位肿瘤的保护作用被减弱，这表明细胞毒性淋巴细胞杀伤在DAC保护中的关键作用(图7a)。
10、DAC对B16的活性依赖于多种先天途径
由于I型IFN通路是DAC抑制的最丰富的先天免疫通路，我们比较了DAC对野生型(WT)和Ifnar1 - / -小鼠的治疗，以确定I型IFN是否需要DAC介导的保护。由于Ifnar1−/−小鼠仅在C57/BL6背景下可用，而在该背景下没有小鼠TNBC细胞系，我们比较了DAC在携带B16F10黑色素瘤的WT和Ifnar1−/−C57BL/6小鼠中的作用(图7b)。DAC仍能强烈抑制ifnar1缺陷小鼠的肿瘤。然而，无论是否添加DAC, Ifnar1−/−小鼠中B16的生长速度大约是WT小鼠的两倍(对照组:WT与Ifnar1−/−:通过Šidák多重比较检验的双向方差分析(ANOVA)， P=0.044)。在DAC处理的WT和Ifnar1−/−小鼠中，B16肿瘤浸润免疫细胞数量相当，尽管在Ifnar1−/−小鼠中，CD8+和NK TIL表达的PFN、GzmB和IFNγ减少。因此，尽管DAC的疗效仅弱依赖于IFNI信号，但DAC增强了杀伤淋巴细胞的抗肿瘤功能。
为了评估B16保护是否通过DAC诱导坏死性死亡或焦亡介导，将携带可触及B16肿瘤的小鼠用低剂量DAC (1 mg kg - 1)或PBS处理两个周期，并通过免疫印迹分析肿瘤裂解物，以激活触发不同形式细胞死亡的蛋白质。caspase 3(不表达GSDME的细胞凋亡，表达GSDME的细胞焦亡)，GSDME(焦亡)和磷酸化混合谱系激酶结构域样蛋白(pMLKL)(坏死)(图7c)。与载体治疗的黑色素瘤相比，DAC治疗的所有三种死亡介质都被激活。经历炎症性细胞死亡而非凋亡的细胞会迅速渗透其细胞膜并吸收细胞不需要的染料，如碘化丙啶和4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)。为了量化DAC在体内诱导的炎症细胞死亡，携带B16-eGFP肿瘤的小鼠接受两个周期的DAC或PBS治疗，在最后一次注射后48小时静脉注射碘化丙啶，10分钟后收获肿瘤。在染色液中加入DAPI，用渗透膜标记细胞。与对照小鼠肿瘤相比，DAC处理的肿瘤含有更多同时使用两种染料的GFP+肿瘤细胞(图7d)。在Gsdme、Gsdmd或Ripk3敲除或未敲除B16-eGFP肿瘤的小鼠中，也测量了DAC诱导的炎症细胞死亡。虽然未经处理的WT B16肿瘤中只有百分之几的人接受了染料，但约20%的DAC处理的WT B16肿瘤细胞同时接受了这两种染料，这表明炎症细胞死亡的频率很高。与DAC处理的WT或Gsdmd−/−肿瘤相比，约有一半的DAC处理的Gsdme−/−或Ripk3−/−肿瘤染色(图7d)。因此，DAC诱导GSDME介导的焦亡和RIPK3依赖性的坏死亡，这两种类型的ICD。
为了确定哪些先天免疫途径有助于DAC在B16中的抗肿瘤活性，用两个周期的DAC或PBS治疗可触及WT、Irf3−/−Irf7−/−、Gsdme−/−、Ripk3−/−或Gsdmd−/−B16肿瘤的小鼠。Irf3−/−Irf7−/−细胞缺乏IFNI信号传导的关键转录因子。DAC显著延缓了WT和Gsdmd−/−肿瘤的生长(图6e, P=0.02)。DAC的抗肿瘤作用(在WT肿瘤小鼠中P=0.012)对Irf3−/−、Irf7−/−、Gsdme−/−或Ripk3−/−肿瘤不再显著(图7e, P分别= 0.18、0.16或0.23)。此外，在所有敲除肿瘤中，DAC诱导的CD8+ TIL和GzmB在CD8+和NK TIL中的升高均减弱。因此，多种先天免疫途径- I型IFNs,GSDME介导的焦亡和RIPK3介导的坏死-有助于DAC介导的B16生长抑制和免疫刺激。
图7 |炎症细胞死亡和IFN信号传导有助于DAC的肿瘤控制。
a， 原位4T1肿瘤在WT(左)或Prf1−/−(右)小鼠中经载药(PBS)或DAC (1 mg kg−1)治疗2个周期后可触及肿瘤的生长情况(每组n = 5-7)。
b， 小鼠皮下B16F10肿瘤的生长情况(左)或Ifnar1−/−(右)小鼠分别用载药或DAC (1 mg kg−1)治疗2个周期，当肿瘤变得可触及时(每组n = 5)。
c， 在B16F10肿瘤皮下攻击小鼠时，从可触及肿瘤开始，用载体(PBS)或DAC (1 mg kg - 1)治疗2个周期。所示为代表性肿瘤裂解物检测caspase 3、GSDME、pMLKL、MLKL和β-肌动蛋白负载对照的免疫印迹。实验重复了两次，结果相似。
d， 小鼠植入WT、Gsdme−/−、Ripk3−/−或Gsdmd−/−B16F10-eGFP肿瘤后，用PBS(载药)或DAC (1 mg kg−1)治疗2个周期，从肿瘤可触及时开始。最后一次注射DAC 48 h后，小鼠静脉注射碘化丙啶(PI)， 10 min后安乐死。所示为DNA染色、碘化丙啶染色和DAPI (DAPI+ PI+)染色的肿瘤细胞百分比，以鉴定坏死细胞死亡的细胞(每组n = 6-7)。右图为载药或DAC处理WT荷瘤小鼠后CD45−eGFP+ B16F10肿瘤细胞碘化丙啶和DAPI染色的代表性流图。
e， 小鼠WT、Gsdme−/−、Ripk3−/−、Irf3−/−、Irf7−/−或Gsdmd−/−B16F10肿瘤细胞用载药或DAC (1 mg kg−1)处理2个周期(每组n = 5-7)。
a,e，红色箭头表示治疗时间。所示数据为平均值+ s.e.m。和是两个独立实验的代表。a,b,e，通过计算每个样本的曲线下面积值来比较肿瘤生长曲线，然后进行学生t检验。d，单因素方差分析采用Fisher最小显著性差异检验。* P≤0.05, * *P≤0.01,* * * P≤0.001,* * * * P≤0.0001。源数据中提供了精确的P值。
本研究使用侵袭性乳腺癌GEMM来无偏倚地研究新形成肿瘤中肿瘤和免疫细胞基因表达的变化。肿瘤细胞基因表达的变化集中在抑制允许肿瘤被先天和适应性免疫途径识别的基因上，而不是改变促进肿瘤细胞内在增殖的基因。因此，至少在这个模型中，早期肿瘤基因编辑是真正的“免疫编辑”，以降低肿瘤的免疫原性。许多关键的免疫通路基因在肿瘤形成早期被表观遗传抑制，在肿瘤晚期通过抑制DNA甲基化而被抑制。I型和II型IFN通路基因和ISG的改变尤为突出。我们的研究表明，免疫编辑主要依赖于表观遗传调节，因为在免疫编辑过程中被抑制的基因和那些被低剂量DAC抑制的基因重叠，抑制DNMT可以恢复免疫控制。一致地，DAC增加了DNA去甲基化和免疫基因的染色质可及性。本研究揭示了TIL在肿瘤发生早期如何改变其表型、基因表达、功能以及与肿瘤细胞的相互作用。T细胞衰竭发生迅速，在癌基因诱导后1个月内发生。
在早期肿瘤发生中捕捉基因表达在技术上具有挑战性，因为肿瘤进化最初发生在少数难以检测的细胞中。以前没有研究使用单细胞分辨率来表征肿瘤刚被检测到时开始的免疫编辑变化。GEMM为研究肿瘤免疫编辑提供了特别有价值的资源，因为肿瘤在致癌基因诱导后不久就会原位出现，并且可以很早就同步和捕获。相比之下，可移植的肿瘤细胞系已经在小鼠体内传代了许多代，并且在肿瘤植入时已经被编辑过。人类患者来源的异种移植肿瘤也来源于已经编辑的可检测肿瘤。此外，免疫能力强的患者来源的异种移植小鼠模型无法用于研究免疫选择压力下的肿瘤变化。在人类身上研究免疫编辑是具有挑战性的，但对于那些经常接受筛查的遗传易发癌症的患者来说，这是可能的。
GEMM可用于了解肿瘤细胞的进化变化如何影响TME中的其他细胞。这项研究仅仅是个开始。未来在更多时间点使用scRNA-seq的GEMM研究可以提供更详细的免疫编辑进化图像，以及它如何创建支持肿瘤持久性、血管化和侵袭性的TME。它可以捕获肿瘤特异性T细胞的激活和克隆扩增，揭示免疫编辑如何驱动T和NK细胞功能障碍、骨髓细胞抑制和肿瘤逃逸。其他GEMM的研究可以确定先天和适应性免疫基因编辑的突出性是否是不同癌症的共同特征，并描述不同肿瘤如何对免疫监视或其起源组织特有的其他挑战作出反应。这项研究没有足够的测序深度来捕捉骨髓细胞或基质的变化。需要对选定的细胞亚群进行更深入的测序或测序，以评估肿瘤与这些其他TME细胞的相互作用。空间转录组学可以提供一种方法来了解免疫细胞排斥的分子基础，以及区分与浸润性免疫细胞共存或组织三级淋巴样结构的肿瘤。
在肿瘤诱导或DAC治疗前消耗特异性免疫细胞亚群将提供不同免疫细胞类型对免疫监视和免疫治疗保护的相对贡献的信息。以前，使用靶向肿瘤的小干扰RNA(siRNA)敲低参与癌症免疫的基因表明，这些GEMM肿瘤可以依赖于细胞毒性淋巴细胞产生免疫原性和免疫保护。比较免疫缺陷小鼠的基因编辑还可以揭示肿瘤编辑在多大程度上是由避免免疫监视和其他选择压力驱动的。
免疫编辑过程中的免疫刺激基因高甲基化在癌症基因组DNA低甲基化增加的背景下是显着的。在最近的一项前列腺癌研究中，循环肿瘤细胞比正常前列腺细胞含有更多大的低甲基化基因组区域。然而，在大多数前列腺癌中，这些低甲基化区域内的一些基因持续受到抑制，但DNMT抑制剂不会抑制这些基因。这些持续被抑制的基因在参与脂质抗原加工和递呈以及细胞IFN反应的基因中富集，这些基因可以通过抑制EZH2而被抑制，这表明除了DNA甲基化之外，其他表观遗传机制也有助于免疫基因的抑制。组蛋白修饰即使在DNA甲基化降低的情况下也能抑制基因表达，而其他抑制基因表达的表观遗传药物可能会单独增加肿瘤免疫或增加DAC的作用。
在晚期肿瘤中，唯一与免疫不直接相关的沉默基因模块涉及线粒体代谢和氧化磷酸化。肿瘤代谢重编程，编排从氧化磷酸化到糖酵解的转换，也具有支持免疫逃避的免疫编辑功能，因为它消耗T细胞功能所需的TME中的葡萄糖。最近的一项研究比较了免疫正常和免疫缺陷小鼠的黑色素瘤细胞系肿瘤编辑，发现了IFNγ驱动的肿瘤免疫逃避途径，该途径驱动代谢重编程。肿瘤的代谢重编程在多大程度上是由肿瘤代谢需求的增加和抑制淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的需求驱动的，可以通过比较免疫功能小鼠和缺乏功能性杀伤淋巴细胞的小鼠(即WT与Prf1−/−或NSG (NOD scid γ)小鼠)的肿瘤编辑来描述。
诱导细胞毒性T细胞和记忆T细胞需要危险信号，这两者对于免疫肿瘤控制都是至关重要的。这些危险信号可由IFN或炎性先天免疫途径提供，其作用可通过下游ISG、炎性细胞因子和趋化因子的激活而放大。虽然本研究已经证实了先天免疫产生IFNI在促进抗肿瘤免疫中的重要性，但肿瘤免疫学研究很少关注II型IFN和炎症途径作为危险信号来帮助产生有效的、长期的抗肿瘤免疫。虽然还没有直接比较IFNI与肿瘤中其他先天免疫反应的有效性，但诱导急性炎症，这是募集和激活免疫细胞的更强危险信号，可能更有效地诱导抗肿瘤保护。到目前为止，使用STING激动剂激活IFNI的临床尝试一直令人失望，部分原因可能是慢性IFNI信号促进PD-L1表达，减少抗原特异性T细胞运输、扩增、代谢重编程和功能。
在乳腺癌GEMM中，IFNI信号在免疫编辑基因中以及在免疫编辑基因和DAC低表达基因之间的重叠中最为显著地富集，这为肿瘤IFNI有助于免疫监视提供了额外的证据。肿瘤中IFN的诱导主要是由细胞质中的DNA错位引发的，这可能来自基因组DNA(在一些肿瘤中由于染色体不稳定或DNA损伤而从细胞核释放)、线粒体DNA或内源性逆转录元件的逆转录。本研究没有分析细胞质DNA，除了ERV之外, ERV通常被排除在RNA-seq分析之外，因为它们的重复序列使它们难以定位到基因组。我们在DAC治疗的4T1肿瘤中没有发现一致的ERV激活，这表明ERV可能不是新形成的乳腺肿瘤中刺激IFNI的主要DNA来源。细胞质DNA测序，特别是使用长读技术，可以帮助确定IFN刺激DNA的来源，以及它在肿瘤编辑过程中是否以及如何改变。
在其他先天免疫途径中，坏死下垂和热下垂相关基因在早期和晚期肿瘤中没有DEG。这些基因在早期和晚期GEMM肿瘤细胞以及乳腺组织中要么不表达，要么只弱表达，因此不需要编辑。即便如此，灵敏的RT-qPCR发现这些通路中的一些关键基因在晚期肿瘤中被抑制。因为乳房不是粘膜组织，正常组织和乳腺肿瘤都不像经常暴露于感染的组织部位产生的肿瘤那样容易发炎。事实上，B16黑色素瘤敲除实验(图7b-e)强烈表明，坏死下垂和焦下垂基因和途径在该肿瘤的免疫监测中发挥重要作用。未来，在先天免疫更活跃的皮肤或结肠等组织中产生的GEMM肿瘤中，对先天免疫基因进行免疫编辑是值得研究的。
在这种乳腺癌GEMM中，大多数已知的先天免疫途径被从头开始(坏死性下垂、焦亡)或免疫编辑(I型和II型IFN)抑制。这种抗检查点阻断(CPB)的GEMM12在低剂量DAC治疗后得到免疫控制。鉴于DAC具有较强的抗肿瘤免疫作用，在抗CPB肿瘤中，CPB是否与低剂量DAC协同作用值得进一步研究。除了T细胞共刺激之外，免疫编辑还破坏了免疫细胞用来识别和消除肿瘤的许多途径。逆转免疫编辑过程中抑制的通路将是增加免疫治疗反应性癌症比例的一种有吸引力的策略。低剂量DAC可能提供一种安全的方法来逆转许多破坏免疫监视的免疫编辑变化。在这种GEMM的免疫编辑过程中，共刺激被抑制，但这只是许多编辑途径之一。通过敲除肿瘤中的Irf3和Irf7或使用Ifnar1 -/-小鼠来破坏B16肿瘤的IFNI信号传导，对DAC的疗效有适度的影响，这表明DAC诱导的其他免疫活性补偿了IFNI信号传导的损失。
DAC诱导的IFNγ信号传导和来自焦亡和坏死细胞的危险相关分子模式(如HMGB1和ATP)的释放也可以改善树突状细胞的成熟和功能，从而提高CD8+ T细胞的免疫。低剂量DAC激活了B16中两种有效的ICD诱导剂:GSDME介导的焦亡和RIPK3-和MLK1介导的坏死性凋亡。敲除Gsdme或Ripk3对肿瘤的免疫控制有适度但显著的影响。这些结果，综合起来，表明先天免疫途径是多余的，以重新诱导有效的免疫监视。这些途径中的任何一种都可以作为促进淋巴细胞效应功能的危险信号，但有些可能比其他更有效，并且将它们结合起来(如DAC治疗)可能比单独诱导任何一种途径更有效。
最近的乳腺癌研究发现CD8+ TIL亚群与先天和先天样淋巴细胞受体共表达细胞毒性蛋白，包括γδ T细胞抗原受体(TCRs)， NK激活受体和FcεR。这些TIL可能潜在地使用这些激活受体而不是传统的TCR来绕过对MHC-1和肿瘤特异性或相关抗原的需求，这些抗原是肿瘤细胞免疫编辑的途径。我们的CD8+ TRM TIL包含表达先天和先天样受体的细胞。Chou等人描述的CD8+ TRM TIL和Fcer1g+具有高细胞毒性潜能的先天样T细胞(ILTCKs)中的细胞都表达Fcerg1、Gzmb和Klrb1c(编码NK1.1)。然而，在我们的研究中，CD8+ TRM TIL标记，如Chn2，没有在ILTCK中表达，这表明这些可能是不同的细胞群。TNBC肿瘤细胞系小鼠模型中的Chn2+ CD8+ TRM TIL与小鼠模型和乳腺癌患者的CPB反应性有关。未来的研究将对CD45+细胞进行更深入的测序，结合TCR谱分析和功能分析，可以鉴定出可能成为新的免疫治疗靶点的效应细胞亚群，特别是对于不表达TCRs44识别抗原的免疫荒漠肿瘤。
DAC对CPB耐药肿瘤免疫控制的深刻改善表明，尽管DNMT抑制剂在实体瘤患者中的临床研究令人沮丧，但进一步的DAC研究是有必要的。然而，本研究和其他临床前研究表明，抑制肿瘤基因表达所需的浓度低于给予患者的剂量。高剂量胞苷类似物抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡，并直接抑制细胞毒性淋巴细胞增殖和效应功能。DAC在血液学恶性肿瘤中的临床获益有多少与免疫相关尚不清楚。低剂量的DAC可以通过增加NK激活受体的表达、IFNγ的产生和细胞毒性来增强白血病患者的NK。然而，浓度越高，NK就会死亡。提高DAC有效性的一种可能方法是测试不引起淋巴细胞周期阻滞或死亡的低剂量。缺乏疗效的其他原因可能是，大多数试验涉及少量经过大量预处理的患者，并且没有根据肿瘤的基因甲基化或免疫特性对患者进行分层。因此，拒绝使用DNMT抑制剂来改善实体瘤的免疫治疗还为时过早。最近的临床研究表明，DAC与其他抗癌疗法联合治疗卵巢癌、复发性转移性宫颈癌或非小细胞肺癌具有抗肿瘤疗效。DAC治疗的肝癌患者出现坏死肿瘤病变并伴有炎症和CD8+ T细胞浸润，提示DAC可以通过诱导肿瘤炎症来调动抗肿瘤免疫。
