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摘要
在三阴性乳腺癌（TNBC）中，p53失活可增加其侵袭性和耐药性。本研究在p53失活的TNBC中发现了一个新的蛋白质漏洞，并设计了具有更高的结合力和VHL募集能力的PROTAC靶向降解MDM2。2D/3D培养体系和TNBC患者肿瘤（包括复发肿瘤）中p53突变/缺失TNBC细胞中的MDM2缺失会导致细胞凋亡，而正常细胞不会。该MDM2-PROTAC在体内稳定发挥作用，在TNBC异种移植小鼠中可靶向肿瘤细胞，而对正常细胞无明显毒副作用，显著延长了小鼠生存期。转录组学分析显示应用PROTAC后p53家族靶基因上调。本研究表明，MDM2对于p53诱导TNBC凋亡至关重要，PROTAC靶向MDM2降解优于现有的MDM2抑制剂，是TNBC的潜在治疗策略。
背景
在多种恶性肿瘤中，p53失活使其更具侵袭性及耐药性。研究表明，TNBC中p53失活率可达65-88%。TP53突变普遍存在于TNBC中，错义突变会削弱其转录因子功能，而无义突变会导致p53蛋白丢失。与其他类型乳腺癌相比，转移和复发风险大大增加，患者生存期降低，且在非裔美国人中更为常见。MDM2是鼠双微体基因，编码MDM2蛋白。MDM2最初在鼠BALB/c3T3成纤维细胞系中发现，后证实也在人的多种组织中存在。目前认为，MDM2蛋白是p53蛋白的负调控因子，能够结合p53并抑制其功能，促进肿瘤的发生和发展。由于p53失活率高，抑制p53与其负调节分子MDM2结合的化合物在TNBC中疗效并不显著。目前TNBC的标准治疗方案均涉及DNA损伤化疗，可能导致心脏和其他毒性。尽管近年肿瘤免疫及靶向治疗飞速发展，但TNBC治疗方案仍有限，亟需探索新的治疗策略。
小鼠发育遗传学研究表明，除非p53同时缺失，否则MDM2缺失对胚胎是致命的。这表明如果p53缺失，细胞不会受到MDM2缺失的影响。Mdm2/MDM2作为原癌基因，在多种癌症中过表达，而正常细胞中其表达较低，Mdm2/MDM2在缺乏功能性p53的癌细胞中可能至关重要。最近，我们报道了MDM2缺失诱导p53表达缺失老鼠肉瘤和T细胞淋巴瘤细胞的凋亡。然而，小鼠中癌细胞存活对MDM2的依赖性是否转化为p53失活的人类癌症，尤其是那些具有突变型p53的癌症，尚不清楚。
PROTAC是由靶向配体和E3泛素连接酶募集配体组成的异双功能分子，可诱导特定细胞蛋白的选择性降解。凭借其催化活性，PROTAC能够在比小分子抑制剂更低的浓度下发挥作用，因此毒性更小。本实验通过设计和合成新的MDM2 PROTAC YX-02-030来靶向降解MDM2，以评估MDM2降解对p53失活TNBC的影响。该PROTAC有效结合MDM2并募集VHL E3连接酶从而使MDM2降解，有效杀死2D和3D培养模型、患者外植体和肿瘤异种移植物中的p53突变或缺失的TNBC细胞。我们发现，当p53失活时，MDM2是TNBC细胞存活所必需的，靶向MDM2的PROTAC是其潜在治疗方法，优于现有的MDM2抑制剂。
结果
1. 设计及合成新型靶向MDM2的PROTAC
尽管有研究表明，在多种p53失活的癌症中，MDM2水平升高，但尚不清楚MDM2是否为p53失活的恶性肿瘤细胞生存所必需的。因此，我们设计并合成了一种新的靶向MDM2的PROTAC，YX-02-030，以探索TP53突变率高（如TNBC）的癌症中MDM2是否为必需。
MDM2-PROTAC（YX-02-030）用醋酸取代临床可用的MDM2抑制剂RG7112的哌嗪基上的3-（甲基磺酰基）丙基尾部，生成RG7112D（图1A）。酰胺键将RG7112D与VHL-amine偶联，VHL- amine是VHL E3连接酶招募配体（图1A）。得到的双功能分子YX-02-030有效抑制MDM2-p53结合，与MDM2有较高的亲和力，抑制VHL-HIF1α结合，并有效地在GST-MDM2和His-VHL之间形成三元复合体。因此，该MDM2靶向PROTAC具有成为有效蛋白降解剂所必需的结合力和形成三元复合物的能力。
图1
2. 蛋白酶体介导的MDM2降解需要三元复合物的形成
3. MDM2-PROTAC激活野生型p53，在诱导野生型p53的乳腺癌细胞凋亡方面比MDM2抑制剂更有效
为表征MDM2-PROTAC的生物学效应，首先将其与MDM2抑制剂进行对比，MDM2抑制剂可以阻止p53野生型乳腺癌细胞中MDM2-p53的结合，据报道，这些细胞对MDM2抑制剂Nutlin敏感。使用MDM2抑制剂（Nutlin，RG7112，RG7112D）和PROTAC处理p53野生型MCF7和DU4475细胞，与抑制剂处理相比，PROTAC处理后MDM2表达明显下降（图2A）。所有化合物都均增加了p53蛋白水平（图2A），并以浓度依赖的方式降低了细胞存活率（图2B）。值得注意的是，PROTAC在MCF7和DU4475细胞中的IC50低于Nutlin，低于或等于RG7112D和RG7112。同样，与接受相同浓度MDM2的抑制剂相比，MDM2-PROTAC处理后的细胞中检测到Caspase-3及cPARP表达增加（图2C、图2D），细胞凋亡更明显（图2E）。此外，与Nutlin及其衍生物类似，MDM2-PROTAC处理MCF7细胞导致促凋亡p53靶基因BAX、NOXA、PUMA的mRNA和蛋白水平升高（图2F和2G）。
为探索MDM2-PROTAC是否会影响3D培养体系中细胞的存活。将MCF7细胞置于3D培养的同一天，用MDM2-PROTAC或MDM2抑制剂处理。与暴露于MDM2抑制剂或对照组的细胞相比，PROTAC处理的细胞中mammosphere的形成显著减少（图2H），并显著降低其存活率（图2I），Caspase-3/7活性增加（图2J）。此外，MDM2-PROTAC处理后的mammosphere有解体现象，但MDM2抑制剂组没有明显解体（图2）。因此，MDM2-PROTAC激活p53野生型乳腺癌细胞中的p53，在2D和3D培养体系中均可引起凋亡，并显示出比MDM2抑制剂更优异的效果。
图2
4. p53失活的TNBC细胞对PROTAC治疗敏感
为检测MDM2-PROTAC是否可以杀死p53突变或缺失的TNBC细胞。使用PROTAC治疗三种不同的功能获得型p53点突变（分别为R280K，R248Q，R175H）的TNBC细胞系（MDA-MB-231，HCC-1143，HCC-1395）。三种p53突变株对PROTAC均敏感，IC50范围较窄（4.0-5.3μM），而对MDM2抑制剂不敏感（图3A）。两种p53缺失TNBC细胞系（MDAMB-436，MDA-MB-453）在应用PROTAC后，其存活率呈剂量依赖性下降，IC50范围（4.5-5.5μM）与p53突变株相似，而RG7112和RG7112D则对其没有影响（图3A）。表明p53缺失或突变不会影响PROTAC的敏感性。
MDM2是一种高度保守的蛋白，研究PROTAC对MDM2缺失/未缺失的p53缺失小鼠肉瘤细胞的作用。Mdm2+/+ p53−/−肉瘤细胞对PROTAC的敏感性与人类TNBC细胞一样（IC50：5.8μM，图3B），而Mdm2−/− p53−/−肉瘤细胞对其治疗完全耐药，但仍对其他化合物敏感（如ABT-263，图3B）。这表明该PROTAC必须在MDM2存在时才具有细胞毒性。
为了进一步验证MDM2靶向降解是p53失活TNBC细胞死亡的原因，我们进行了如图1I-K所示的复合竞争实验。增加RG7112或VHL-amine的浓度，分别与MDM2-PROTAC竞争结合MDM2或VHL，阻断MDM2-PROTAC诱导的TNBC细胞死亡（图3C）。VHL抑制剂VH298也得到了类似的结果。表明MDM2-PROTAC通过形成三元复合物靶向MDM2，杀死p53失活的TNBC细胞。
图3
5. 敲低MDM2，验证PROTAC在p53失活TNBC细胞中诱导凋亡
为表征PROTAC引起的细胞死亡类型，使用图3A中确定的IC50浓度进行了动力学实验。随着时间的推移，MDM2-PROTAC抑制p53突变/缺失TNBC细胞扩增（图3D）。MDM2-PROTAC治疗24小时内，Annexin-V阳性率（图3E）和Caspase-3活性（图3F）显著升高，并增加了亚g1细胞凋亡（图3G）及cPARP（图3H）的表达，但当使用MG132抑制MDM2降解、阻断VHL与PROTAC的结合或抑制VHL活性时，c-PARP表达减少（图H）。这表明，PROTAC诱导p53突变或缺失的TNBC细胞凋亡，需要三元复合物的形成，从而降解MDM2。
为验证PROTAC的凋亡作用及其对MDM2的特异性，在p53突变和缺失的TNBC细胞系中用shRNA敲低MDM2（图3I），敲低后降低TNBC细胞增殖（图3J），增加细胞凋亡（图3K）及cPARP表达（图3I），及亚g1细胞凋亡DNA（图3K）。MDM2敲低反映PROTAC对p53失活TNBC细胞的毒性作用，这为支持PROTAC的MDM2特异性提供了证据。此外，全转录组分析表明MDM2-PROTAC处理的MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞中差异表达基因与MDM2敲除之间存在显著正相关（图3L）。表明该PROTAC特异性作用于MDM2。
6. MDM2-PROTAC治疗可降低p53失活TNBC的克隆形成能力并增加细胞凋亡
对MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞进行集落形成实验，确定PROTAC介导的MDM2降解是否会改变p53失活TNBC细胞的克隆潜能。MDM2-PROTAC处理后，集落数量显著减少（图4A），而MDM2抑制剂对其几乎没有影响。
在3D培养中检测PROTAC是否有效阻止TNBC细胞mammosphere形成并消除已经形成的mammosphere。对于MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞，与MDM2抑制剂和对照相比，PROTAC作用后形成的mammosphere均明显减少（图4B）。在已经形成的mammosphere中，PROTAC处理后，其面积显著减少（图4C）。值得注意的是，PROTAC浓度比MDM2抑制剂低3倍时，MDA-MB-231和MDA-MB-436 mammosphere的面积分别减少49.5%和43.8%。与MDM2抑制剂相比，PROTAC治疗后mammosphere的Caspase-3/7活性随着时间的推移显著增加（图4D），存活率降低（图4E）。表明MDM2-PROTAC在2D和3D培养模型中均可诱导p53失活的TNBC细胞凋亡。
图4
7. MDM2-PROTAC在体内可稳定有效地杀死TNBC细胞
小鼠体内药代动力学表明，MDM2-PROTAC具有中等代谢稳定性，半衰期为25.9分钟（图5A），并具有出色的体内稳定性，单次腹腔注射10mg/kg剂量后，小鼠血浆水平在6小时内保持稳定（图5B）。使用MDA-MB-231和MDA-MB-436 TNBC细胞进行异种移植，待肿瘤生长到80mm3时，予以MDM2-PROTAC、RG7112D治疗。与RG7112D相比，PROTAC治疗后小鼠存活时间显著延长（图5C），肿瘤体积显著减小（图5D）。PROTAC治疗72小时后从一组小鼠中收取肿瘤标本检测蛋白表达。MDM2-PROTAC治疗组小鼠MDM2蛋白表达缺失，cPARP表达增加，凋亡增加（图5E，图5F，图5H，图5I），Caspase-3活性增强（图5G）。值得注意的是，MDM2-PROTAC治疗后，在免疫正常的C57Bl/6小鼠或免疫缺陷小鼠中没有观察到明显的毒性迹象。小鼠体重正常，全血细胞计数、脾脏、骨髓和肠道的组织学和细胞含量正常。表明该PROTAC在体内对p53失活的TNBC肿瘤有明显的疗效，对正常组织无明显毒性。
因为RG7112的临床试验显示了造血细胞毒性，为了进一步研究MDM2-PROTAC是否对正常细胞有毒性作用，我们检测了MDM2-PROTAC治疗后p53是否稳定，其靶基因是否影响正常造血细胞。首先，在治疗3天后（与图E-I相同的方案），评估来自C57Bl/6小鼠的脾细胞和骨髓细胞。在被照射的小鼠（阳性对照）中，p53稳定，且p53靶标（BAX、NOXA和PUMA）蛋白和mRNA水平增加，但在MDM2-PROTAC处理的小鼠中没有观察到类似现象。正常人CD34+细胞的存活在几乎不受MDM2-PROTAC的影响，但在RG7112处理后存活力显著下降。此外，在CD34+细胞中，MDM2-PROTAC处理后p53靶基因BAX、NOXA和PUMA的mRNA水平没有变化，但RG7112处理后上述mRNA显著增加。表明MDM2-PROTAC对癌细胞具有特异性，不激活正常小鼠或人类造血细胞中p53介导的凋亡基因上调。
图5
8. 靶向MDM2降解诱导患者来源的三阴性乳腺癌外植体凋亡
为了评估MDM2-PROTAC对三阴性乳腺癌患者细胞的作用，从5名三阴性乳腺癌患者获得新鲜的、手术切除的肿瘤标本，进行测序，发现所有样品都发生了TP53错义突变，其中两个具有相同的热点（R248Q）p53突变，一个具有3个TP53突变（图6A）。在保存肿瘤结构的同时，将每个患者的肿瘤切片放入外植体培养体系中，用MDM2-PROTAC和对照、RG7112D进行治疗。在治疗的4天内，与RG7112D对照相比，接受MDM2-PROTAC处理的患者肿瘤中MDM2蛋白丢失，而VHL蛋白没有变化（图6B）。MDM2-PROTAC治疗的患者肿瘤凋亡水平、Caspase-3和cPARP增加（图6B）。免疫组化也证实了上述结论，同时正常乳腺上皮和基质细胞未受PROTAC的影响（图6C）。
MDM2-PROTAC显著提高TNBC外植体中Caspase-3/7的活性（图6D），降低存活率（图6E），而MDM2抑制剂对其没有效果。正常的乳腺上皮簇基本不受MDM2-PROTAC治疗的影响（图6D，6E）。表明靶向MDM2降解是TNBC的一种可行、无毒的治疗策略。
图6
讨论
既往研究认为，一旦p53失活，细胞不再需要MDM2。然而，我们的研究挑战了这一看法，揭示了MDM2是p53突变和缺失的人类肿瘤细胞，特别是三阴性乳腺癌细胞持续生长和存活所必需的。通过设计和合成一种新的MDM2-PROTAC，YX-02-030，特异性靶向MDM2，在体内外均显著促进了三阴性乳腺癌细胞凋亡，同时对正常细胞无明显影响。该研究为治疗侵袭性三阴性乳腺癌患者开辟了一条全新的途径，这些患者往往存在p53突变或缺失，从而更易获得耐药性。此外，由于PROTAC具有催化活性，这使得它们能够在比常规小分子抑制剂更低的浓度下使用，因此具有更低的毒性。
END｜2024 summer
