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摘要
高危人乳头瘤病毒(HPV)是宫颈癌的病原体。2024年3月发表于Redox Biology 杂志的一篇文章中，研究人员报道了HPV16 E6E7通过激活戊糖磷酸途径(PPP)促进宫颈癌细胞增殖，发现HPV16 E6主要通过增加葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)酶活性来激活PPP。机制上，HPV16 E6通过抑制G6PD的乳酸化促进G6PD二聚体的形成，并进一步指出G6PD K45在G6PD介导的抗氧化应激中发生乳酸化。这项HPV癌蛋白介导恶性转化的新机制的发现可能为治疗宫颈癌和HPV相关癌症提供有效的策略。
研究介绍
HPV16是宫颈癌中检测到的主要HPV类型(约占60%)，其E6和E7病毒癌基因或其他高危型HPV基因的持续表达是宫颈癌的驱动因素。然而，与HPV感染相关的癌变机制的细节仍然缺乏。代谢重编程是癌症的一个标志。戊糖磷酸途径(PPP)在肿瘤细胞中通常被过度激活。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)是PPP中的限速酶，介导PPP氧化产生NADPH，维持细胞内氧化还原稳态。非氧化性PPP为核苷酸合成提供了底物。强有力的证据表明，对PPP依赖性的增加为癌细胞增殖和肿瘤发展提供了NADPH和代谢中间体。然而，HPV是否激活PPP促进HPV致癌尚不清楚。乳酸化是一种新的翻译后修饰，值得注意的是，通过质谱鉴定的全球乳酸化图谱分析表明，参与PPP、糖酵解和三羧酸循环的几种酶被乳酸化修饰。然而，G6PD是否可以通过乳酸化修饰以及G6PD的乳酸化位点尚不清楚。
在本研究中，作者发现HPV16 E6是PPP激活的关键调节因子，特别是氧化PPP，以增加NADPH和谷胱甘肽水平对氧化应激的反应。机制上，HPV16E6抑制G6PD K45的乳酸化，提高G6PD酶的活性。作者进一步证明了HPV16E6介导的G6PD激活对于其在体外和体内促进癌细胞生长的作用至关重要。
研究结果
1. HPV16 E6E7重连PPP
和文献报道一致，在作者目前的研究中，重组慢病毒异位稳定表达HPV16 E6E7促进了C33A细胞(HPV阴性宫颈癌细胞系)和原代人角化细胞(PHKs)的细胞增殖，减少了细胞凋亡，维持了永生化MEF细胞的生长并减轻了衰老。为了筛选E6E7为促进细胞增殖改变的代谢途径，使用表达E6E7或空载体的PHKs通过液相色谱-质谱(LC-MS)鉴定代谢物的差异。作者观察到参与PPP代谢和核苷酸代谢的底物表达增加(图1A)。此外，KEGG分析显示，富集的代谢物参与了代谢途径、癌症中的中心碳代谢和PPP(图1B)。PPP为核苷酸合成提供了前体。因此，作者研究了HPV是否重新编程了PPP。作者观察到，在表达HPV16 E6E7的PHKs和C33A细胞中，NADPH、NADPH/NADP+、GSH/GSSH、GSH水平和DNA合成显著增加(图1C-F)。
图1
NADPH是清除活性氧(ROS)所必需的，在脂肪酸合成过程中被消耗[17]。结果显示，在表达E6E7的细胞中，脂质合成水平升高，ROS水平降低(图g - j)。作者还检测了细胞内过氧化氢(H2O2)，与Vector相比，表达HPV16 E6E7的C33A和PHKs细胞内过氧化氢(H2O2)显著减少(图1K)。蛋白质羰基化提供了氧化损伤的全面评估。它是氧化应激的标准标志物。同样，在表达HPV16 E6E7的细胞中，蛋白质羰基化水平较低(图1L)。这些结果表明HPV16 E6E7可以对PPP进行重编程。
图1续
Science & Technology
2. HPV16 E6重新编程PPP
作者进一步研究了E6和E7癌蛋白在HPV感染中的新作用。发现在稳定表达E6的C33A和PHKs细胞中，NADPH、NADPH/NADP+、GSH/GSSH和GSH水平明显高于表达E7的C33A和PHKs，相应的ROS水平明显降低(图2A-F)。
图2
作者体外实验发现，与HPV16 E7相比，表达HPV16 E6的C33A和PHKs细胞内H2O2显著降低(图2G)，蛋白质羰基化水平较低(图2H)，脂质合成增加(图2E-F)以及DNA合成增加(图2I-L)，增殖加快(图2M)。体内异种移植实验中，与来自HPV16 E7或仅载体细胞的肿瘤相比，裸鼠注射表达HPV16 E6的细胞的肿瘤生长速度和大小明显增加(图2N)。因此，这些结果表明HPV16E6激活PPP，导致细胞增殖和肿瘤生长。
图2续
为了证实E6通过PPP激活促进细胞增殖，作者将PPP抑制剂6-An给予表达E6或E7的C33A和PHKs。6-An对PHKs和C33A的最大半抑制浓度(IC50)分别为81.06 μM和26.78 μM。与E7相比，6-An在第6天显著降低了表达E6的PHKs细胞的增殖(图3A-B)，G6PD的下调也显著抑制了E6诱导的增殖(图3C, D)。体内异种移植实验中，与表达HPV16 E7的细胞相比，用6-An或G6PD KD处理后，裸鼠注射表达HPV16 E6的细胞产生的肿瘤体积更小(图3E, F)。
图3
此外，与表达HPV16 E7的细胞相比，6- An处理后，表达HPV16 E6的PHKs细胞的NADPH、NADPH/NADP+、GSH/GSSH和GSH水平显著降低(图3G-J)。与NADPH水平的变化相反，表达E6的细胞中6- An介导或G6PD -KD介导的ROS水平升高比表达E7的细胞更显著(图3K-L)。作者还检测到与表达HPV16 E7的细胞相比，表达HPV16 E6的PHKs细胞在6-An或G6PD-KD处理后，细胞内H2O2明显降低(图3M)，蛋白质羰基化水平也较低(图3N)。总之，这些数据表明HPV16E6通过重编程PPP促进细胞增殖。
图3续
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3. HPV16E6激活G6PD
为了确定HPV介导PPP重编程的机制，作者接下来研究了HPV16 E6E7是否影响G6PD的表达。作者发现在表达HPV16 E6E7的C33A和PHKs细胞中，G6PD的酶活性显著增加，但G6PD蛋白和mRNA的表达均未受到影响(图4A-D)。作者还发现HPV16 E6显著增加G6PD酶活性，而E7不显著(图4E-F)。G6PD以失活单体和酶活性二聚体的形式存在。二琥珀酰亚酸(DSS)交联分析显示，HPV16 E6E7或HPV16 E6的异位表达导致G6PD二聚体水平升高。HPV 16E7只有轻微的积极作用(图4 G-H)。因此，HPV16E6促进活性G6PD二聚体的形成。
图4
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4. HPV16E6通过抑制G6PD乳酸化促进G6PD二聚体的形成
作者接着研究了E6如何促进G6PD二聚体的形成。分析GEO数据库发现p53信号通路发生了显著变化(图5A)。先前的报道表明，癌蛋白HPV16 E6促进p53降解，p53直接与G6PD结合以阻止活性二聚体的形成。因此，作者探索HPV是否以p53依赖的方式调节G6PD酶活性。用MG132孵育表达HPV16 E6或载体的PHKs细胞，抑制E6介导的p53降解(图5B)。作者发现MG132并没有消除E6诱导的酶活性增加或G6PD二聚化(图5C-D)。此外，作者构建了敲除E3泛素连接酶UBE3A的PHKs细胞系。与之前的报道一致，UBE3A的敲低显著增加了p53水平。然而，UBE3A的敲低并没有抑制G6PD的酶活性和二聚体的形成(图5E-G)。这些结果表明HPV16E6以p53独立的方式调节G6PD酶的活性。
图5
最近的研究表明，乳酸化也作为赖氨酸残基的翻译后修饰，并直接调节酶活性。因此，作者研究了G6PD的酶活性是否受到乳酸化的调节。首先，使用表达E6、E6E7或载体的C33A和PHKs细胞来测定全局细胞内乳酸化水平。作者观察到表达E6或E6E7癌蛋白的细胞水平显著降低(图6A)。泛乳酸化抗体从异位表达HPV16 E6的C33A和PHKs细胞中免疫沉淀的G6PD量明显低于表达E7或仅表达载体的细胞，但G6PD总量没有任何变化(图6B)。同样，表达E6的C33A和PHKs细胞的细胞内乳酸水平显著降低(图6C)。乳酸钠(LA)的补充显著增加了泛乳酸化抗体检测到的G6PD免疫复合物(图6D)。为了证实HPV16 E6介导的对G6PD乳酸化的抑制会影响其酶活性，作者在添加乳酸钠的培养基中培养表达E6的细胞后，测量了G6PD酶活性。作者的数据显示，乳酸钠的加入显著降低了G6PD的酶活性(图6E)。DSS交联实验还显示，乳酸钠处理减少了G6PD二聚体的形成(图6F)。这些结果表明，乳酸化修饰通过减少二聚体的形成来抑制G6PD的酶活性。
研究表明，细胞内乳酸可以作为乳酸化的底物。因此，作者检测了乳酸脱氢酶A (LDHA)的表达。qPCR(图6G)和免疫印迹(图6H)显示，与对照载体相比，表达E6的C33A细胞和PHKs中LDHA的表达显著降低。综上所述，这些结果表明HPV16E6通过减少乳酸生成来抑制G6PD的乳酸化修饰，增加二聚体的形成，从而增强G6PD酶的活性。
图6
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5. K45是受HPV16 E6癌蛋白调控的G6PD乳酸化的关键位点
为了确定G6PD的乳酸化位点，作者从PDB数据库中获得了G6PD (PDB: 2BH9)与结构和催化NADP+络合的x射线结构。人源G6PD的每个亚基都有两个NADP+结合位点，一个催化NADP+辅酶结合域和一个结构NADP+结合域。NADP+的敲低抑制G6PD二聚体的形成并降低其酶活性。这些研究表明NADP+在G6PD二聚化和酶活性的调控中起重要作用。
因此，作者选择了靠近NADP+结合区的10个赖氨酸作为潜在的修饰位点(图7A)。来自不同物种的序列比对显示，相同的10个赖氨酸残基(K45、K46、K47、K171、K205、K238、K288、K403、K408和K508)是保守的(图7B)。为了确定哪些残基是乳酸化的目标，作者将10个假定的赖氨酸残基中的每一个突变为丙氨酸(A)，并分别分析了这些突变的活性。观察到，在内源性G6PD被敲除的PHKs和C33A细胞中，G6PD WT或K45A、K408A、K508A突变的异位表达显著恢复了G6PD活性(图7C-D)。乳酸化修饰基序在结构上与苏氨酸相似;因此，G6PD的K45T、K408T和K508T突变被用来模拟持续的乳酸化。只有重新表达G6PD K45T突变不能恢复酶的活性(图7E)。为了进一步阐明K45乳酸化的功能，作者发现，在内源性G6PD敲低的PHKs和C33A细胞中，再表达K45A的细胞中NADPH、NADPH/NADP、GSH和GSH/GSSG水平显著高于再表达K45T的细胞。与NADPH和GSH的变化一致，与K45A相比，K45T的重新表达相应提高了ROS、H2O2和蛋白质羰基化水平。DSS交联实验进一步证明，与K45A变体相比，K45T突变显示出形成二聚体的能力受损(图7F)。
图7
赖氨酸也发生乙酰化修饰。据报道，K403是一个主要的G6PD乙酰化位点。为了进一步阐明赖氨酸45是一个主要的乳酸化位点，403、408、508和45位点的赖氨酸突变为丙氨酸。再表达G6PD突变的C33A和PHKs细胞用抗G6PD抗体免疫沉淀，并用Western blot检测乙酰化(Kac)水平。作者发现G6PD K45突变不会改变G6PD乙酰化水平(图7G-H)。进一步阐明K45是一个潜在的乳酸化修饰位点而不是乙酰化修饰位点。作者利用在线分子对接工具分析了乙酰辅酶a或L-乳酸结合G6PD K45的能力。作者发现L-lactate与G6PD K45的对接分数(208.85)明显高于Acetyl-CoA的对接分数(175.97)。这表明G6PD K45更容易发生乳酸化修饰而不是乙酰化修饰。分子对接还模拟了存在或不存在K45la、K408la和K508la的情况下G6PD及其辅酶(催化NADP+和结构NADP+)的结合构象。在Lys45侧链之后的修饰，催化NADP+与修饰后的Lys45形成氢键，结合位点明显移位，结合亲和力由12.38 kcal/mol降至8.26 kcal/mol。相比之下，K408la和K508la的结合亲和力分别有所增加或略有下降。因此，K45la扭曲了催化NADP+与G6PD之间的原始结合域，从而降低了G6PD的活性(图7I)。综上所述，这些结果表明HPV16E6抑制G6PD K45的乳酸化，从而通过促进G6PD二聚体的形成来增强其酶活性。
图7续
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6. G6PD活性在体外和体内对HPV调控的肿瘤增殖至关重要
为了深入了解HPV16 E6-G6PD调控轴在HPV癌变中的作用，作者在体外研究了G6PD K45A和K45T突变对细胞生长的影响。在内源性G6PD被敲除的表达HPV-16 E6的PHKs、C33A细胞和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中，异位表达WT G6PD或K45A突变，而不是表达K45T突变，显著促进细胞生长(图8A-C)。对内源性G6PD KD的HPV16+宫颈癌SiHa细胞也进行了同样的观察(图8D)。G6PD是细胞PPP代谢的关键酶，它产生细胞内必需的还原剂NADPH来中和细胞ROS。因此，在培养液中添加活性氧清除剂n -乙酰-L-半胱氨酸(NAC)，研究G6PD介导的PPP氧化代谢是否参与细胞增殖调节。与表达K45T的细胞相比，在培养基中添加NAC进一步促进了表达K45A的细胞的生长(图8E)。作者还阐明了HPV16 E6-G6PD轴在衰老中的作用。β-半乳糖苷酶染色显示，重新表达G6PD K45A，而不是K45T，显著减少了MEF的衰老(图8F)。
图8
进一步的体内异种移植实验显示，在内源性G6PD敲低SiHa和C33A细胞中，稳定过表达WT G6PD或K45A突变，而不是K45T，促进了肿瘤的生长(图8G-H)。最后，在C33A和SiHa移植瘤中检测G6PD酶活性。作者发现肿瘤里，K45A突变的重新表达导致G6PD酶活性显著高于K45T(图8I-J)。综上所述，G6PD的乳酸化修饰降低导致酶活性增加，对HPV16E6介导的肿瘤细胞体外和体内生长具有重要意义。
图8续
讨论
总之，作者发现了一种潜在的HPV致癌机制，其形式是HPV16E6刺激G6PD酶活性，导致PPP活性升高。作者进一步确定了K45作为G6PD乳酸化的潜在位点。作者认为，在HPV感染细胞中增加G6PD乳酸化或用6- An抑制G6PD酶活性可能有助于减少HPV的致癌作用。本研究中描述的针对小鼠肿瘤模型G6PD酶活性的结果支持了这一假设，证明具有治疗价值。
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END
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