介绍
泛素-蛋白酶体系统（UPS）是调节真核生物蛋白质水平的重要途径。UPS通过将泛素（UB）共价结合到底物蛋白上来调节其功能和稳定性。UPS中蛋白质底物的选择性在很大程度上由E3连接酶控制，E3连接酶通过识别蛋白质序列中的降解子（degrons）分子基序，发挥了确定底物特异性的关键作用。一些E3连接酶检测到原生序列内的降解子，这些序列在蛋白质合成、折叠或复合物组装过程中发生错误时被暴露出来，而其他E3连接酶则识别翻译后修饰的降解子。目前已经确定了位于蛋白质N或C末端的终端降解子，并且一些E3连接酶通过将底物结合域（SBDs）与降解子来调节蛋白质水平。然而，由于这种降解信号(degron)在许多非底物蛋白中也存在，因此需要确保只有真正的底物被靶向泛素化。即如何区分真正的底物和那些天然带有类似降解信号的氨基酸序列的蛋白质
在“The Eukaryotic Proteome Is Shaped by E3 Ubiquitin Ligases Targeting C-Terminal Degrons“文章中研究人员发现CRL2亚家族通过KLHDC2 识别C-末端Gly-Gly降解信号来靶向底物，KLHDC2的SBD结合具有C-末端Gly-Gly序列的肽类序列（图1）。
图1 KLHDC2结合具有C-末端Gly-Gly序列的肽类序列
在本研究中，研究人员描述了人类KLHDC2的结构和功能，其通过其两种组装之间的相互转化进行调节。一种是同源四聚体形式：KLHDC2的C端Gly-Ser基序模拟了一个降解信号（C-degron），并与另一个亚基的底物结合域发生作用，构成一个四聚体；另一种是单体形式，而真正的底物会捕获KLHDC2单体形式的CRL2KLHDC2，通过neddylation驱动E3连接酶活化并随后对底物进行泛素化。C-degron mimicry可以模拟C-degron序列，并通过E3连接酶的特定区域与其相互作用，从而抑制E3连接酶的活性。这种自我抑制机制可以确保E3连接酶只选择特定的C-degron底物进行泛素化，并维持与C-degron底物相关的生物学功能。
结果
KLHDC2识别NEDD8的二甘氨酸羧基末端
先前研究已经发现KLHDC2会识别降解以Gly-Gly结尾的SELK、USP1和EPHB2等真正底物，却不会降解以Gly-Gly结尾的UB和Ub-like蛋白质（UBLs）。该研究确定了KLHDC2如何结合C-degron：通过确定其SBD与来自EPHB2的肽段的晶体结构，KLHDC2侧链呈托底状环抱底物C端的Gly-Gly残基（图2A）。时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）竞争性结合实验表明，NEDD8能够与KLHDC2 SBD形成复合物，并且抑制KLHDC2与Ric8B的相互作用，而UB无法竞争（图2B）。在UB转移实验中，neddylated CRL2KLHDC2优先将UB连接到SELK或USP1上，而不是转移到自由的NEDD8（图2C、D）。该研究表明，KLHDC2的SBD与蛋白质互作体形成复合物是必要但不充分的，CRL2KLHDC2复合物有区分SBD蛋白质互作体和真正底物的手段，后者可以保护KLHDC2免受自动泛素化。
图2. KLHDC2 对NEDD8的二甘氨酸(C端)显示出选择性
KLHDC2的C端可以模拟C-degron
研究发现KLHDC2的C端可以模拟C-degron。该研究通过确定KLHDC2与EloBC底物受体复合物的晶体结构，揭示了该复合物的调控机制，发现KLHDC2的每个亚基的SBD都被相邻KLHDC2的C端占据（图3A）。C端的丝氨酸、倒数第二个甘氨酸和前4个氨基酸与真正的底物降解物结合到KLHDC2的孤立SBD中完全重合（图3A和3B）。该研究使用表面等离子体共振（SPR）测量KLHDC2 SBD和肽之间的相互作用的亲和力，发现野生型KLHDC2肽与KLHDC2 SBD结合的KD值为1.4 mM，仅比生理底物USP1的N端UBL域（KD值为0.26 uM）或GFP-RIC8B（KD值为0.46 uM）的肽的KD值低3-5倍（图3C）。与KLHDC2 C端丝氨酸替换为甘氨酸相比，亲和力增加（图3C）。因此，KLHDC2 C端模仿了一个降解物，但其序列具有中等亲和力。
图3 KLHDC2的C端Gly-Ser充当C-degron模拟物
KLHDC2-EloBC形成底物类似物诱导的四聚体
通过多角度光散射和沉降速度分析等技术发现，KLHDC2-EloBC底物受体复合物是一个具有非常稳定四聚体结构的复合物（图4A和4B）。其中，KLHDC2的C端模拟蛋白序列（C-degron-mimic）与SBD相互作用有助于维持四聚体结构的稳定性（图4C和4D）。
KLHDC2蛋白质复合物中不同结构域和亚基之间的结构相互作用，这些相互作用对于复合物识别和降解特定目标蛋白质非常重要，KLHDC2的SBD和BC-box-EloBC复合物与之前的结构相同，但是由于不同的亚基之间存在相互作用，导致了特定的四聚体构象（图4C-E）。文章中指出，两个四聚体化元素（TE）定义了这种特定的几何构型，并防止了KLHDC2 SBD和C-degron模拟物之间过度的头-尾结合，从而避免了纤维结构的形成（图4E）。同时，文章也描述了具体的相互作用和残基之间的相互作用，揭示了如何在KLHDC2亚基之间形成四聚体的细节。KLHDC2相关区域进行突变，进一步验证了KLHDC2各个亚基对四聚体形成非常重要（图4F）。
图4. KLHDC2-EloBC在溶液中形成依赖于C-degron mimic的四聚体
KLHDC2-EloBC四聚体被自我抑制以阻止底物结合
进一步研究发现KLHDC2-EloBC复合物对底物结合的自我抑制作用。实验结果显示，FAM-SELK可以捕获从缓慢的四聚体/单体平衡转化中存在的单体KLHDC2-EloBC（图5A）。此外，实验还探究了底物浓度和孵育时间对KLHDC2-SELK相互作用的影响，发现KLHDC2-SELK相互作用随着孵育时间和底物浓度的增加而增强（图5B和5C）。总之，发现KLHDC2-EloBC对于底物结合的亲和力很低，需要较长的孵育时间才能形成复合物。研究人员使用结构建模和8.2 A°分辨率的冷冻电镜（EM），以进一步证实他们的发现（图5D）。他们得出结论，在CUL2-RBX1存在下，KLHDC2-EloBC四聚体的解离加速，可能是由于四聚体和CUL2和RBX1的WHB和RING结构域之间的空间冲突。并且KLHDC2四聚体化可能促进其自身泛素化作用，只有KLHDC2寡聚体（WT没有底物和-GG有或没有底物）才会发生自体泛素化（图5E和5F）。
图5 KLHDC2-EloBC四聚体不与蛋白质底物结合
缓慢的结合速率保护NEDD8免受CRL2KHLDC2介导的泛素化作用
先前研究发现NEDD8会结合KLHDC2的SBD区域，但为什么NEDD8不会被KLHDC2的？因此，研究人员进一步研究影响NEDD8作为泛素化底物的能力的因素，以及与E3连接酶复合物CRL2KLHDC2的相互作用。实验使用动力学测定和定性泛素化反应来比较NEDD8与其他底物（如USP1和SELK）的行为，发现尽管NEDD8与KLHDC2亲和力相当，但相对于其他底物，NEDD8作为泛素化底物的能力较差。研究发现在不同的底物和NEDD8-CRL2KLHDC2预孵育时间下进行的*UB转移实验，并发现NEDD8结合KLHDC2的速率相对较慢（图6A和6B）。然而，通过在C-端尾巴中插入2、4或6个残基，可以提高NEDD8与KLHDC2结合的速率，从而被有效泛素化（图6D—F）。因此，C-degron mimicry诱导的KLHDC2四聚体化可以排除NEDD8作为底物，因为其结合速率较慢，而真正的底物具有足够捕获单体形式的neddylated CRL2KLHDC2的结合速率。
图6 KLHDC2-EloBC底物模拟诱导四聚体通过校对机制选择真正的底物
C-降解信号模拟介导的四聚体化对CRL2KLHDC2泛素化的多种影响
那四聚体的形成对CRL2KLHDC2泛素化有什么影响呢？研究人员针对这一问题进一步研究C-degron模拟介导的四聚体化对NEDD8转移到CRL2KLHDC2，以及对CAND1的抑制作用和COP9 信号介导的去泛素化产生影响。实验发现，KLHDC2-EloBC单体，在一些情况下与底物蛋白结合，更容易被泛素化，且CAND1抑制作用会更弱（图7A）。并且四聚体之间存在抑制CSN去泛素化的作用（图7B）。此外，KLHDC2-EloBC单体的存在使CUL2泛素化速率增加。这可能是由于KLHDC2-EloBC单体在结构上暴露了与NEDD8转移酶相邻的位点，促进了neddylation的发生（图7C）。相比于只有CUL2-RBX1，添加单体KLHDC2-EloBC -KK会使N泛素化速率增加17倍（图7D）。此外，KLHDC2 TE1突变会消除蛋白质底物对CRL2KLHDC2的激活作用（图7E）。因此，单体CRL2KLHDC2复合物可以促进NEDD8化酶的催化反应。
图7 KLHDC2 C-degron模拟诱导的四聚体化影响多种CRL2KLHDC2的生物化学活性
KLHDC2的C-degron mimicry在细胞中的作用
研究人员检测了影响KLHDC2四聚体形成的突变体对CUL2去泛素化的影响，并在U2OS细胞中检测了这些突变体对KLHDC2蛋白水平的影响。细胞数据与体外生化数据一致，表明KLHDC2的C-degron mimicry介导的四聚体化抑制了CSN介导的CUL2去泛素化，并促进了其自身泛素化（图8A和8B）。在接下来的实验中，研究者们测试了不同突变体对底物降解的影响。在KLHDC2敲除细胞系中，USP1 N-片段的稳态水平略微但一致地增加，而全长USP1的水平未发生改变（图7C和7D）。而外源表达KLHDC2会降低未结合的NEDD8水平，表明KLHDC2水平精细调节细胞中的NEDD8水平。KLHDC2单体的表达（例如CD6和-KK）进一步降低了USP1 N-片段和未结合的NEDD8水平（图7E和7F）。这些结果表明， C-degron介导的四聚体形成，在下调CRL2KLHDC2活性和调节细胞中KLHDC2和NEDD8水平方面发挥作用。
图8 KLHDC2-EloBC在细胞中形成C-degron-mimic依赖性的四聚体，控制CUL2KLHDC2的功能。
总的来说，这项研究为深入了解KHLDC2靶向特定蛋白降解的特异性和选择性的分子机制提供了重要见解。这也凸显了了解参与泛素化的蛋白质的结构和生化特性的重要性，这是许多细胞通路中的重要调控过程。本文的主要内容是关于E3连接酶（E3 ligase）自我抑制机制的研究。该研究发现，通过C-degron mimicry，E3连接酶可以保持C-degron底物的特异性，并维持与之相关的生物学功能。研究人员发现，C-degron mimicry技术可以模拟C-degron序列，并通过E3连接酶的特定区域与其相互作用，从而抑制E3连接酶的活性。这种自我抑制机制可以确保E3连接酶只选择特定的C-degron底物进行泛素化，并维持与C-degron底物相关的生物学功能。此外，研究还揭示了C-degron mimicry如何通过改变E3连接酶的构象来实现自我抑制，并揭示了与这种抑制机制相关的分子机制。
小贴士
1、KLHDC2是一种蛋白质，其SBD（Substrate Binding Domain）结构用于与底物结合。KLHDC2与EloBC一起形成一个复合物，即KLHDC2-EloBC底物受体复合物。EloBC是一个由Elongin B和Elongin C两个亚基组成的复合物，也是与底物结合相关的蛋白质复合物。因此，KLHDC2-EloBC底物受体复合物是由KLHDC2和EloBC两个蛋白质复合物共同组成的，用于识别和结合底物并将其引导到泛素连接酶（E3）进行泛素化。
2、"Neddylated"是一个生物化学术语，指的是蛋白质上结合了NEDD8（神经元前体细胞分化因子8）分子。NEDD8是一个类似于泛素的小蛋白，可以共价结合到蛋白质的赖氨酸残基上，这个过程被称为neddylation，类似于泛素化。个过程能够激活CRL（Cullin-RING E3 ligase）复合物，促进其介导蛋白的降解。
3、CAND1是一种蛋白质，它在泛素连接酶结合和去泛素化酶结合过程中起着重要的调节作用。在泛素连接酶结合过程中，CAND1与未活化的泛素连接酶结合，从而抑制其活性。在去泛素化酶结合过程中，CAND1也能够抑制去泛素化酶的活性。因此，CAND1的存在可以对细胞内泛素化和去泛素化过程进行调节。
4、COP9 signalosome（CSN）是一个高度保守的蛋白质复合物，对于多种细胞过程的调节起着关键作用，包括蛋白质降解、DNA损伤应答、细胞周期进展和发育等。CSN参与调节泛素-蛋白酶体系统（UPS），该系统负责分解大多数细胞内蛋白质。CSN被认为是Cullin-RING泛素连接酶（CRLs）活性的调节因子。CSN与CRLs相互作用并去除一个称为Nedd8的小肽段，该肽段对于激活CRLs是必要的。这样做，CSN抑制了CRLs的活性，并防止其底物的降解。
责编：吕鉴可
