Cancer Discov｜一种新型泛素化级联调节肿瘤的综合应激反应和生存

先前对BIRC6的研究主要集中在阻断线粒体凋亡通路中的作用，这一功能主要归因于其BIR结构域。2023年3月，这篇发表在CANCER DISCOVERY 杂志的文章首次报道了BIRC6的UBC结构域对于癌症子集的适应性至关重要，并且还发现了一个以前未被识别的由UBA6、BIRC6、KCMF1和UBR4组成的蛋白质泛素化级联。BIRC6复合物调节着ISR的关键调节因子HRI的稳定性，为非整倍体癌细胞的靶向治疗提供了新的途径。以下是文章的主要内容。

一、通过同质性分析鉴定BIRC6泛素化模块

作者在癌症依赖图谱(DepMap)项目中应用基于广义最小二乘(GLS)原理的回归方法，该项目包含了对1086个细胞系进行的CRISPR-Cas9功能丧失筛选的数据集，确定了由≥3个基因组成的50个共本质基因模块。从中发现了迄今为止尚未被认识到的共质复合物，包括一个由参与蛋白质泛素化的四个基因组成的模块:UBA6、BIRC6、KCMF1和UBR4，统称为BIRC6模块(图1A)。分析这些基因的本质特征可见，UBA6和BIRC6分别仅在3.5%和4.1%的细胞系中是强烈必需的。相比之下，KCMF1和UBR4在68.0%和65.1%的细胞系中分别是强烈必需的(图1B)。这些发现表明E3连接酶(KCMF1和UBR4)对更广泛的癌细胞类型的生存能力至关重要，而对特定癌症类型的选择性是由E1 (UBA6)和E2 (BIRC6)酶决定的。通过计算每个细胞系中四个组成基因的Chronos基因效应值的平均值并绘制癌症类型，作者发现上皮细胞来源的细胞系通常比间充质组织来源的癌细胞系更依赖BIRC6模块，并且在乳腺癌、头颈癌和食管癌中对该模块的依赖尤其丰富(图1C)。

图1

二、BIRC6依赖性的体内外验证

作者通过7天的细胞活力测定实验，发现BIRC6模块四个基因的耗竭对依赖BIRC6细胞系的增殖和存活率的影响显著大于非依赖细胞系(图2A)。BIRC6耗竭对细胞适应度的强烈影响，以及BIRC6依赖性的选择性特征，表明该E2连接酶是该模块的关键组成部分，这使研究人员在后续研究中重点关注该酶。为了深入了解BIRC6缺失影响细胞活力的机制，作者在三种依赖和三种非依赖细胞系中评估了BIRC6敲除后的细胞周期谱和凋亡水平。发现BIRC6缺失导致三种依赖细胞系中s期细胞比例的一致减少，而三种非依赖细胞系中则没有(图2B)。利用膜联蛋白V染色发现BIRC6耗尽后，所有三种依赖细胞系均诱导早期和晚期凋亡，但只有一种非依赖细胞系诱导凋亡(图2C)。因此，抑制BIRC6影响依赖细胞系的增殖和生存。在体外证实了BIRC6的选择性重要性后，作者试图评估在体内抑制BIRC6的影响，特别是对肿瘤生长和维持的影响。作者将表达多西环素(DOX)诱导靶向BIRC6shRNA (shBIRC6-2)的ZR751乳腺癌细胞植入NRG小鼠乳腺脂肪垫。肿瘤形成后，经过DOX处理后的小鼠，即敲除BIRC6后肿瘤有较强的消退，同时观察到抑制BIRC6可使肺和肝脏的转移负担减少10倍以上。(图2D)

图2

三、BIRC6模块的生化研究

为了评估BIR和/或UBC结构域是否是BIRC6的依赖性所需要的，作者展开一种竞争试验，直接比较了两种不同细胞群的增殖/生存:一种携带沉默突变，另一种携带破坏性突变，在残基355和4666处进行Cys到Ala的突变体分别破坏BIR或UBC结构域的功能(图3A)。在依赖的HCC202细胞中，第7天UBC结构域的沉默突变比破坏性突变占主导地位。相比之下，无法在非依赖性JIMT1细胞中观察到沉默突变与UBC破坏突变的比例有任何显著变化。此外，在HCC202细胞的BIR结构域中发现了等量的沉默和破坏性突变，这表明BIR结构域对于维持这些依赖细胞的生存能力是可有可无的(图3B)。总的来说，这些观察结果表明，由UBC结构域赋予的BIRC6 E2泛素偶联酶功能，而不是BIR结构域功能，对依赖细胞的生存至关重要。

然后作者通过共免疫沉淀分析了BIRC6与BIRC6模块的其他成员之间的生化相互作用。利用抗flag抗体检测到内源性带Flag标记的BIRC6与UBA6和KCMF1结合(图3C)，同时V5表位标记的UBA6 (UBA6-V5)和KCMF1 (KCMF1-V5)与内源性BIRC6共沉淀(图3D，3E),这些观察结果证实了UBA6 (E1)、BIRC6 (E2)和KCMF1/UBR4 (E3)在物理上相互作用，并表明这些成员共同形成了泛素连接酶复合体，其功能对上皮癌细胞亚群的增殖/生存至关重要(图3F)。

图3

四、BIRC6耗尽后ISR的激活

为了探究BIRC6选择性依赖的机制，作者分析了BIRC6抑制后诱导的转录变化。在依赖的细胞系模型中，通过sgRNA抑制BIRC6后，超过700个基因的表达显著改变。其中包括与G2-M检查点进展、E2F 靶基因相关的基因下调，以及凋亡相关基因的上调。相比之下，BIRC6是唯一一个在非依赖模型中表达有显著变化的基因(图4A)。此外，参与未折叠蛋白反应(UPR)的基因仅在依赖BIRC6生存的细胞系中被高度上调(图4B)。UPR，也被称为内质网应激信号，是响应内质网中未折叠或错误折叠蛋白质积累而激活的自适应途径。UPR由三个独立的信号通路组成:磷酸化eIF2α(p-eIF2α)/ATF4通路、ATF6通路和IRE1/XBP1通路。通过检测BIRC6抑制导致的mRNA和蛋白表达变化，作者仅发现依赖模型中p-eIF2α/ATF4通路靶点的稳健诱导。相比之下，BIRC6敲除无法在两种非依赖性细胞系中诱导p-eIF2α/ATF4通路激活 (图4C)。此外，即使在依赖细胞中，也没有发现ATF6和IRE1/XBP1通路激活的迹象。这些观察结果表明，p-eIF2α/ATF4信号的选择性激活是依赖细胞中抑制BIRC6复合物的常见结果。

p-eIF2α/ATF4信号通路除了被PERK激活外，也可以被其他三种eIF2α激酶中的任何一种激活:HRI、PKR和GCN2(图4D)。这些eIF2α激酶的应激依赖性激活及其随后触发p-eIF2α/ATF4信号通路的能力被统称为ISR。依赖细胞中BIRC6缺失时，UPR中p-eIF2α/ATF4片段的选择性激活与ISR激活相似。因此，BIRC6泛素连接酶复合物的阻断导致了ISR的选择性激活。

图4

五、HRI在BIRC6抑制时触发ISR

为了测试ISR激活对于抑制BIRC6复合体后观察到的活性丧失是否必要，作者使用了ISR的小分子抑制剂(ISRIB)，通过促进eIF2B鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)复合体的组装来抵消eIF2α磷酸化对蛋白质翻译的抑制作用。研究发现，ISRIB治疗不仅恢复了ISR激活的下游效应，包括ATF4和ATF3的诱导(图5A)，而且还挽救了UBA6、BIRC6、KCMF1和UBR4损耗引起的生存能力损失(图5B)。相比之下，敲除ISR的核心转录调控因子ATF4无法挽救随后BIRC6缺失导致的活性丧失。这说明抑制BIRC6复合物会以依赖ISR但不依赖ATF4的方式导致细胞活力的丧失。

为了阐明BIRC6缺失和ISR激活之间的联系，作者进行了基因组规模的CRISPR-Cas9功能缺失筛选，以确定BIRC6依赖性的抑制因子。通过评估单个sgRNA的丰度及比对文库，发现HRI (EIF2AK1)在HCC202细胞中富集程度最高，在SNU503细胞中富集程度第三(图5C和D)，但没有发现任何其他eIF2激酶显著富集。这一观察结果证实了BIRC6耗竭对HRI的选择性要求。

为了确认是否是HRI的缺失(而不是其他eIF2α激酶)挽救了BIRC6抑制造成的生存能力损失，首先在HCC202和SNU503细胞中使用CRISPR-Cas9基因靶向消除HRI或PERK，并测量随后的BIRC6敲除对ISR激活和细胞生存能力的影响。作者发现HRI的缺失，而不是PERK的缺失，阻断了ISR的激活，包括eIF2α的磷酸化和ATF4及 ATF3表达的升高，并削弱了细胞活力的下降，这些都是在BIRC6敲除后强烈诱导的(图5E和F)。同样，PKR和GCN2的缺失也无法阻止SNU503细胞中抑制BIRC6引起的ISR激活。此外，HRI的缺失挽救了UBA6、KCMF1和UBR4引起的生存能力损失。总的来说，这些观察表明HRI是将BIRC6复合物的抑制与ISR的激活联系起来的关键效应。

 图5

六、BIRC6 复合物泛素化 HRI

在通过免疫印迹检测排除了HRI上调是ISR激活导致的次要变化的可能性后，作者使用环己亚胺追踪试验检测了BIRC6敲除的后果，从而测试HRI稳定性是否受到BIRC6的调控。发现异位表达的v5标记HRI蛋白(HRI- v5)在缺乏BIRC6的细胞中半衰期比对照细胞长2.6倍，表明BIRC6耗尽导致HRI稳定(图6A)。进一步研究BIRC6复合物是否直接泛素化HRI，在MG132和ISRIB存在时，检测到泛素化形式的HRI，而BIRC6的缺失减少了这些泛素化形式的出现(图6B)。此外，作者发现异位表达的HRI-V5蛋白与内源性表达的UBR4共沉淀，并且在MG132存在的情况下，该复合物在两种依赖(HCC202;图6C)和非依赖性(JIMT1)细胞株都更丰富，表明HRI和UBR4之间的物理相互作用，它们是BIRC6复合物的假定底物结合组分。总之，这些观察结果确定HRI是BIRC6复合物的直接泛素化/降解靶点。

先前的研究证实，HRI的磷酸化是其激酶活性的一个标志。为了测试抑制BIRC6复合物是否会导致HRI磷酸化状态的改变，作者使用Phos-tag分子将磷酸化的蛋白质捕获在SDS-PAGE凝胶中，发现BIRC6的缺失导致HCC202细胞中磷酸化和非磷酸化形式HRI的表达增加(图6D)。因此，BIRC6复合物可能通过稳定该激酶的表达而不是主动触发其磷酸化来增强HRI的活性。

图6

七、高度非整倍体肿瘤细胞富集BIRC6依赖性

作者生成并探索了一个专注于癌症相关遗传变化的数据集，询问是否可以用这些癌症相关基因变化的特征来预测对BIRC6的依赖。该分析显示，非整倍性程度与BIRC6依赖性之间存在显著关系(图7 A , 7B)。事实上，BIRC6与UBA6和UBR4在具有高非整倍性评分的细胞中是最显著富集的遗传依赖性(图7 C)。一致地，非整倍体得分高的细胞系组对BIRC6的依赖明显高于非整倍体得分低的细胞系组(图7 D)。同样，对BIRC6依赖性最强的细胞比对BIRC6依赖性最低的细胞系表现出明显高的非整倍体评分(图7E)。

图7

讨论

最近的研究强调了HRI在各种应激条件下维持翻译稳态的关键作用，包括氧化应激、线粒体应激和错误折叠蛋白的细胞质积累。然而，尽管HRI在许多不同的情况下在触发ISR方面发挥着重要作用，但对HRI调控的分子细节仍然知之甚少。作者目前的工作证明了BIRC6泛素连接酶复合物在破坏HRI稳定方面的关键作用，这反过来又是癌细胞亚群生存所必需的。在这些癌细胞中，HRI介导的应激信号通路的本构激活可能需要通过BIRC6复合物介导的HRI降解来抵消(图8)。即癌症需要适应以耐受增加的细胞压力，这是癌症的一个关键标志。此外，鉴于ISR激活时间延长具有不可逆的细胞毒性，肿瘤中ISR基础激活的升高可能代表了癌症的独特脆弱性。BIRC6依赖性的高选择性和BIRC6在调节ISR中的特定作用共同使这种泛素连接酶成为一个有前景的肿瘤治疗靶点。

图8

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责编：吕鉴可