CRL2APPBP2泛素连接酶识别C-degron的分子基础

文摘   2024-09-29 17:22   天津  

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摘要

E3 泛素连接酶通过与泛素介导的蛋白水解底物中的不稳定蛋白基序(称为degrons)选择性结合来决定真核蛋白降解的特异性。蛋白质暴露的C端残基可以充当C-degrons,作为专用cullin-RING E3泛素连接酶(CRL)复合物的一部分被不同的底物受体(SR)识别。APPBP2是Cullin 2-RING连接酶(CRL2)的SR,已被证明可识别 R-x-x-G/C-degron;然而,识别的分子机制仍然难以捉摸。通过解析与不同 R-x-x-G/C-degron 结合的活性CRL2的几种低温电镜结构,我们揭示了CRL2APPBP2二聚体和四聚体组装以及C-degron识别的分子机制。结构研究,辅以实验和细胞分析,表明 APPBP2 通过二分机制特异性识别 R-x-x-G/C-degron;精氨酸和甘氨酸在 C-degron 识别中起关键作用,它们可以容纳由两个残基隔开的不同口袋。此外,结合口袋足够深,使APPBP2能够与位于C端上游或最多三个残基的基序相互作用。总的来说,我们的研究不仅为CRL2介导的蛋白质周转提供了结构见解,而且还为未来基于结构的化学探针设计提供了基础。


背景介绍

真核细胞的主要蛋白水解系统,泛素-蛋白酶体系统(UPS),介导泛素介导的底物蛋白降解,并通过消除不需要的、异常的或调节性的短寿命蛋白,在蛋白质质量控制机制中发挥关键作用。在泛素与底物偶联(泛素化)的过程中,E3泛素连接酶桥接E2泛素偶联物和底物,并催化泛素从E2转移到底物。因此,E3连接酶被认为决定了UPS的特异性,并且在大多数情况下,它直接识别其底物中称为degrons 的特定基因序列。degron的一个重要特性是可转移性,因此degron的融合可以赋予其他长寿蛋白质不稳定性。Degrons主要由几个氨基酸长度的短线性基序组成。第一个鉴定的degron是位于蛋白N末端(N-degrons)的degrons,导致N-degron 通路(以前称为“N 端规则通路”)被发现,但直到最近几年,才发现一组不同的C-degron通路靶向位于蛋白质C末端的类似degron基序。

Cullin-RING E3泛素连接酶(CRL)构成了最大的E3连接酶家族,在人类基因组中编码了8种cullin蛋白(CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5、CUL7 和 CUL9),包含300多种不同的复合体。通常,cullin 蛋白分别通过其N端和C端区域与接头蛋白和RING型蛋白(RBX1或RBX2)结合,并通过接头蛋白进一步连接可互换的底物受体(SR)。通过这种方式,特定的CRL由cullin成员表示,上标为底物识别受体的名称。例如,CRL2由五个亚基组成:CUL2作为cullin 支架,RBX1作为募集E2酶的催化亚基,Elongin B-Elongin C(EB-EC)异二聚体作为接头蛋白,FEM1B作为SR。

最近有报道,CUL2的特异性SR靶向不同的C-degrons和潜在的分子机制。KLHDC2与C-degrons结合,末端为二甘氨酸;FEM1B和 FEM1A/1C可识别以精氨酸(Arg/C-degrons)结尾的C-degrons,上游序列在选择性中发挥作用。据报道,CRL4的SR Cereblon 靶向C末端环酰亚胺degron,Gln/C-degron被TRIM7识别,Ala 尾部作为 C-degron 发挥作用以募集 CRL2或Pirh2,CRL4靶向di-Glu C-degron。在上述C-degron通路分支中,序列特异性C末端残基被多亚基E3连接酶的SR或单个E3连接酶的功能结构域结合。

APPBP2作为CRL2特异性SR发挥作用,据报道可结合共享C端 Arg-x-x-Gly 基序(以下简称“R-x-x-G/C-degrons”)的C -degrons,在与底物相互作用的关键残基Arg 和Gly之间具有恰好两个间隔氨基酸。在大多数情况下,基序位于靠近极端 C末端的位置,与C端相隔一个或两个残基(分别为R-x-x-G-x 或R-x-x-G-x-x)。然而,APPBP2靶向特定C-degrons介导蛋白质更新的分子机制仍然难以捉摸。

在这里,我们用不同的 R-x-x-G/C-degron 肽解决了组装的CRL2的几种低温电子显微镜(cryo-EM)结构,包括XP_211896 的C-degron(R-x-x-G-P)、XP_211896 的一种变体 [以下简称“XP_211896(+AA)”] (R-x-x-G-P-A-A),和MRPL28(R-x-x-G-Q)。我们发现,在所有复杂结构中,APPBP2 通过二分机制识别 R-x-x-G/C-degron 肽;C-degron内的Gly和Arg分别被位于APPBP2深袋中的小裂隙和带负电荷的凹陷识别;R-x-x-G基序的主链基团与APPBP2氢键键合,占Arg和Gly之间的两个间距残基。此外,CRL2APPBP2结构揭示了APPBP2与CUL2和EB/EC组装成泛素连接酶寡聚体复合物的模式。体外结合测定证实了Gly、Arg和其他 degron 残 基对APPBP2 结合以及介导与C-degron相互作用的APPBP2结合口袋残基的重要性。这些发现得到了体内蛋白质稳定性测定的支持,表明CRL2APPBP2和R-x-x-G/C-degron之间的相互作用有效地控制了细胞中通过UPS途径的底物周转。总体而言,我们的结构方法辅以生化、生物物理和细胞生物学实验,为CRL2APPBP2 E3连接酶机制对R-x-x-G/C-degron的选择性提供了结构见解,并作为未来设计用于靶向蛋白质降解的小分子配体的基础。


结果分析

1、APPBP2识别共享R-x-x-G基序的C-degrons

图1

为了研究APPBP2的R-x-x-G/C-degron结合特性,我们在细菌中表达全长人APPBP2,但未能获得可溶性蛋白,这可能是由于其热稳定性低。鉴于 APPBP2 在活性 CRL2 复合物的背景下与异二聚体接头蛋白 EB-EC 结合,这可能会促进其热稳定性,我们共表达和纯化了 APPBP2-EB-EC 三元复合物,它在溶液中主要表现为二聚体,确实比单独的 APPBP2 稳定得多(图 1A和SI附录,图 S1 A和B)。然后,我们通过等温滴定量热法(ITC)结合测定检测APPBP2-EB-EC的C-degron结合亲和力。选择小泛素样修饰剂(SUMO)融合肽进行体外结合实验,因为与合成的短肽相比,它们的溶解度更高。测试了SUMO融合16-mer肽与APPBP2结合的能力,包括 XP_211896、MRPL28、ASCC3 和肽35的肽,我们之前证明它们以R-x-x-G/C-degron 依赖性方式被APPBP2靶向。所有带有R-x-x-G/C-degron的SUMO融合蛋白都与APPBP2-EB-EC结合,KD 范围为1.7至3.7μM,而阴性对照单独使用SUMO不结合(图1 B和C以及SI附录,表S1)。综上所述,这些结果表明APPBP2直接与R-x-x-G/C-degon结合。

2、与 R-x-x-G/C-degron 结合的CRL2APPBP2的结构

为了获得对CRL2APPBP2 E3连接酶复合物组装和APPBP2识别C-degron的分子机制的分子见解,我们重构了由 NEDD8 修饰的 CUL2Δ-RBX1(SI附录,图S1C)(28)、APPBP2 和 EB-EC 二聚体(图1A和SI附录,图S1D)组成的完全组装的CRL2APPBP2。CUL2Δ 代表人 CUL2的一种变体,其固有无序区域(残基117至134)被删除以避免不需要的蛋白水解。据报道,CUL2Δ可以与其野生型(WT)对应物一样有效地进行类泛素化 。因此,我们将含有 neddylated CUL2Δ 的重组复合物命名为“CRL2APPBP2复合物”。由五个亚基组成的CRL2APPBP2复合物已高纯度纯化(SI 附录,图 S1D)。静态光散射(SLS)实验表明,CRL2APPBP2的分子量为387 kDa,是预期大小的两倍,表明CRL2APPBP2在溶液中呈二聚体状态(SI 附录,图S1E)。

接下来,我们选择假定蛋白XP_211896的C-degron作为模型R-x-x-G/C-degron 进行结构研究。将过量的XP_211896 C-degron 肽与CRL2APPBP2一起孵育,以获得CRL2APPBP2-C-degron 复合物。复杂颗粒的冷冻电镜数据集是从单个样本中收集的。与 SLS 实验一致(SI 附录,图S1E),颗粒被分类为二聚体状态,出乎意料地也被分类为四聚体状态,分别以3.27 Å 和3.26 Å的分辨率进行分离(SI 附录,图S2和表S2)。

3、CRL2 的二聚体和四聚体组装

在CRL2APPBP2二聚体(dimerAB)的结构中,两个CRL2APPBP2原聚体(A和B)形成一个中心对称的二聚体(图1 D和E以及SI附录,图S3A)。APPBP2、EB、EC 和CUL2的N 末端区域(CUL2NT)在每个原聚体中都可见(图1 A、D和E)。尽管我们使用NEDD8 修饰的 CRL2 来重构CRL2APPBP2,但我们没有观察到CUL2、RBX1或NEDD8的 C 端区域的映射,这与以前的研究一致,表明NEDD8修饰释放了CUL2的C端WHB结构域,并增加了CUL2的C端区域及其相关RBX1的动态特性 。

在每个原聚体中,APPBP2通过疏水相互作用与CUL2和EC结合(SI附录,图S3 B 和 C)。在APPBP2二聚体界面处发现C2H2锌指,Zn2+由APPBP2原聚体(APPBP2 A和 APPBP2B)的Cys54和His89配位(SI附录,图S3 D和E)。通过生成APPBP2双突变体C54A/H89A,我们发现与EB-EC组装的突变体APPBP2(APPBP2-EB-EC)或整个突变 CRL2 复合物 (CRL2APPBP2) 表现为单体(SI附录,图S1 E和F以及S4 A和 B),表明APPBP2-EB-EC和CRL2APPBP2二聚体受锌介导的APPBP2二聚化控制。

此外,来自一个原聚体(APPBP2 A)的APPBP2也与来自另一个原聚体(分别为 CUL2B和 ECB)的CUL2和EB相互作用以稳定二聚体(SI 附录,图S3 F和G)。两个 CRL2APPBP2二聚体(dimerAB和dimerCD)进一步二聚化形成CRL2APPBP2四聚体(SI 附录,图 S5)。

4、APPBP2 对 R-x-x-G-x/C-degron 的识别

鉴于溶液中CRL2APPBP2二聚体均一,所有结构中具有相同的APPBP2结构和C-degron识别模式,我们选择CRL2APPBP2二聚体进行结构分析。APPBP2 由高度保守的结构域组成:一个跨越α1至α3的N端VHL框,负责CUL2-EB-EC 结合,以及一个由跨越α6 至α27的11个TPR重复序列(TPR1-11)和两个短螺旋(α28至α29)组成的蛋白质-蛋白质相互作用结构域(SI 附录,图 S6)。XP_211896 C-degron 肽以 1:1 的比例与APPBP2结合(图 2A),肽的最后7个残基(-7LTRNKGP-1)可见并插入由 TPR 重复序列6至11(TPR6-11)形成的APPBP2深袋中(图2 A 和B以及SI附录,图S7A)。值得注意的是,肽残基从C端开始编号,C 端的残基为“-1”,倒数第二个残基为“-2”,依此类推。以R-x-x-G-P结尾的C-degron肽与APPBP2的口袋残基广泛相互作用(图2 C-G)。Leu-7和Thr-6与Tyr483、Tyr345和Tyr515形成疏水相互作用,Thr-6主链羰基与 Ser479 侧链形成氢键(图 2C);Arg-5与Asp387、Asp388和Ser441形成有利的静电相互作用,其主链羰基氢原子键合到Tyr345的侧链上(图 2D);Asn-4的主链羰基与Tyr345和Arg437的侧链形成氢键(图 2E);Lys-3与Val342、Tyr345和 Leu472形成疏水相互作用,并分别通过其主链羰基和侧链ε-氨基与His476和Tyr468 的侧链形成氢键(图2E);Gly-2与APPBP2的Tyr338和Tyr341的侧链形成两个主链氢键,通过范德华力与 Leu384 和 Arg437 相互作用(图 2F);肽的Pro-1通过其主链羧基与APPBP2的Arg380和Asn434的侧链形成两个氢键,并与APPBP2 Leu472和 His476形成疏水相互作用(图 2G)。C-degron和APPBP2残基的Arg、Asn 和 Lys 之间形成的主链氢键网络赋予了-5RNKG-2基序刚性,解释了关键Arg和Gly之间的确切两个间距残基。综上所述,这些分子间相互作用表明APPBP2以序列特异性方式识别 R-x-x-G/C-degron(图 2H)。

图2

鉴于Pro的主链羰基只有一个氧原子与APPBP2残基氢原子键合,我们推测APPBP2 可以容忍R-x-x-G/C-degron的C末端的额外残基。一致地,在R-x-x-G-P(+AA) 的C端添加di-Ala不会显著损害APPBP2的结合亲和力(KDs:2.6 vs. 2.4 μM),而在 C端添加5个丙氨酸残基(+AAAAA)会使与APPBP2的结合降低20倍以上(KDs:>50 vs. 2.4 μM)(图 3A)。结合数据表明,APPBP2在R-x-x-G的C末端耐受至少1至3个残基;然而,结合亲和力随着添加的残基数量的增加而下降。这与以下事实一致:从我们的肽组筛选中回收的大多数APPBP2肽底物是R-x-x-G-x 或 R-x-x-G-x-x,很少有底物在甘氨酸后包含两个以上的残基(9)。C端脯氨酸(-P)的截短仅略微降低了 APPBP2 结合亲和力(KDs:2.4 vs. 3.5 μM)(图 3A),表明 R-x-x-G 可以位于最末端C端。然而,最后2个残基的截短(-GP)使结合亲和力降低了>5.0 倍(KDs:2.4 vs. 13 μM),而最后3个残基的截短(-KGP)完全消除了结合(图3A和 SI附录,表S1)。与结构分析一致,完整的C末端R-x-x-G基序是高APPBP2结合亲和力所必需的,基序的缩短或重新定位会极大地影响与 APPBP2 的相互作用。

图3

接下来,我们将点突变引入C-degron肽中,以评估单个残基在与APPBP2结合中的作用。有趣的是,P-1A将APPBP2结合减弱了~3.3倍(KDs:7.9 vs. 2.4 μM)(图3B),表明疏水残基在末端位置更受欢迎。G-2A和G-2V分别将APPBP2结合亲和力降低了 ~2.0-(KDs:4.8 vs. 2.4 μM)和~5.0倍(KDs:13 vs. 2.4 μM)(图 3B),表明只有最小的残基(如Gly或Ala)在倒数第二个位置受到青睐,而较大的Val侧链则不被容忍。R-x-x-G基序中的Arg对APPBP2结合最关键,正如R-5A突变所揭示的那样,该突变将结合亲和力减弱了18倍(KDs:44 vs. 2.4 μM)。Arg和Gly的双重突变R-5A/G-2V完全消除了结合[图3B和SI附录,表S1],为二分相互作用模式提供了证据。总体而言,结合数据表明Arg和Gly在R-x-x-G基序中与APPBP2结合中的关键作用,以及APPBP对以R-x-x-G/A-x0-3结尾的C-degrons的偏好。

5、诱变方法定义参与 R-x-x-G/C-degron结合的关键APPBP2残基

我们进一步突变了APPBP2的口袋残基,并通过ITC实验检测了APPBP2突变体的 C-degron结合亲和力。APPBP2的Glu387和Glu388都与R-x-x-G基序内的Arg发生静电相互作用,E387R/E388R双突变体消除了结合,表明静电相互作用在与C-degron 结合中起着重要作用(图 3C)。与APPBP2的Tyr345和Arg437与degron肽的主链形成氢键的发现一致,R437M将结合亲和力降低了>20倍(KDs:>50 vs. 2.4 μM),Y345A/R437A与R-x-x-G/C-degron 有结合,强调了分子间氢键在C-degron结合中的重要性(图 3C)。鉴于Arg380和Lys430与Pro的主链羰基发生静电相互作用,R380E/K430E 还将结合亲和力降低了>20 倍(KDs:>50 vs. 2.4 μM)(图 3C)。根据肽的主链羰基与His476和Ser479的侧链氢键的发现,H476E/S479E也将C-degron 结合亲和力减弱了~10 倍(KDs:> 25 vs. 2.4 μM)(图3C 和SI附录,表S1)。上述所有APPBP2突变体都保持了EB-EC结合亲和力,因为它们中的每一个都与EB-EC共纯化(SI 附录,图 S4 C-G),表明突变仅损害了C-degron 结合亲和力,而不会影响蛋白质折叠。总的来说,结合数据进一步验证了APPBP2-degron结合界面。

6、APPBP2 对 R-x-x-G-x-x-x/C-degron 的识别

为了了解APPBP2耐受在其极端C末端添加额外残基的分子机制,我们解决了 CRL2APPBP2的冷冻电镜结构,该结构与XP_211896 C-degron的变体结合,该变体包含两个额外的C末端Ala驻留,RNKGPAA [“XP_211896(+AA)”],R-x-x-G-x-x-x/C-degron的代表。与XP_211896 C-degron 结合的CRL2APPBP2类似,XP_211896(+AA) 结合的CRL2APPBP2的颗粒也表现出二聚体和四聚体状态,分别以 3.30 Å 和 3.54 Å 的分辨率分离(SI附录,图S8和表S2)。

CRL2APPBP2-XP_211896(+AA)二聚体和四聚体的组装方式与CRL2APPBP2-XP_211896 观察到的方式相同(SI 附录,图 S9)。在CRL2-XP_211896(+AA)二聚体中,肽的最后 9 个残基(-9LTRNKGPAA-1)是可见的,并显示良好的图谱质量(SI 附录,图 S7B)。总体而言,APPBP2与R-x-x-G-x-x/C-degron的相互作用方式与观察到的R-x-x-G-x/C-degron相同(图 4A)。C末端的两个额外残基-2AA-1很好地容纳在口袋中,导致APPBP2可耐受R-x-x-G基序下游的1至3 个额外残基。Pro-3的主链羰基与 Arg380的胍基团氢原子键合,这也与Ala的主链羰基产生良好的静电相互作用(图 4A)。虽然插入口袋深处,但肽的Ala-2和Ala-1与 APPBP2 残基的接触较少,这与 APPBP2 与具有相似结合亲和力的R-x-x-G-x和R-x-x-G-x-x C-degrons 结合的发现
一致(图 3A)。

图4

7、APPBP2对R-x-x-G-Q/C-degron的识别

为了了解APPBP2的底物选择性,特别是它对R-x-x-G基序中甘氨酸后残基的偏好,我们用MRPL28 C-degron解析了CRL2APPBP2的结构,以RASGQ结尾。与CRL2APPBP2的其他 C-degron结合结构类似,具有R-x-x-G-Q/C-degron的CRL2APPBP2颗粒也组装成二聚体和四聚体,分别以3.22 Å和3.44 Å的分辨率分离(SI 附录,图 S10 和表 S2)。CRL2APPBP2-MRPL28 二聚体和四聚体的整体结构与其他C-degron结合的CRL2APPBP2结构中观察到的结构相似(SI 附录,图 S11)。

C-degron(-7QKRASGQ-1·)的最后7个残基可见并插入先前鉴定的degron结合口袋中(SI 附录,图 S7C)。在CRL2APPBP2-MRPL28复合物中,MRPL28 C-degron与APPBP2 的相互作用方式与XP_211896的C-degron相同(图 4B),Gln-1与APPBP2 Glu469 形成有利的静电相互作用。通过将所有degron结合结构叠加在APPBP2上,我们发现三个C-degrons 内的R-x-x-G基序采用相同的构象(图 4C),表明APPBP2以保守的方式识别R-x-x-G/C-degrons。为了研究APPBP2是否利用相同的表面以与所有R-x-x-G/C-degrons类似的方式结合,我们进一步研究了APPBP2-EB-EC及其degron结合突变体Y345A/R437A和E387R/E388R与两个先前报道的R-x-x-G/C-degrons,即 ASCC3(-RPRGLR)和肽35(-RNKGK)的结合。结合数据显示,与WT APPBP2 不同,WT APPBP2与两个C-degrons结合,KD范围为1.7至3.5 μM,两个degron 结合突变体Y345A/R437A和E387R/E388R均未与ASCC3或肽35结合(图3 D和E)。总体而言,结构分析,辅以诱变和体外结合实验,表明 APPBP2 使用相同的表面来识别共享R-x-x-G/C-degrons的不同底物。

8、在基于细胞的分析中验证 APPBP2 介导的底物识别和降解

为了验证C-degron结合残基在APPBP2中的功能作用,我们在慢病毒表达载体中构建了一系列APPBP2突变体,并在称为全局蛋白稳定性(GPS)的基于细胞的系统中测试了它们的活性。GPS是一种基于荧光的报告系统,用于监测活细胞中蛋白质稳定性的变化。该系统基于编码DsRed的双顺反慢病毒表达载体,用作慢病毒盒的内部表达参考,以及从内部核糖体进入位点翻译的GFP融合。在这种方法中,GFP/DsRed 比率用于读出融合伴侣对GFP稳定性的影响。

对于基于细胞的测定,我们首先使用CRISPR/Cas9生成HEK293T APPBP2 敲除 (KO)细胞。然后,我们用编码WT或突变体APPBP2互补 DNA(cDNA)的慢病毒构建体转导KO细胞,然后用GPS肽进行回收和第二次转导(图 5A)。作为 APPBP2 的代表性底物,我们设计了一些GPS报告基因,编码各种R-x-x-G基序的23聚体 C-degron肽,这些基序在Gly后具有一个、两个或三个C末端残基:GPS-肽35、GPS-MRLP28、GPS-XP_211896(均共享R-x-x-G-x基序)、GPS-ASCC3(R-x-x-G-x-x)(9)和XP_211896(+AA)(R-x-x-G-x-x-x)。

图5

与解析的结构和ITC实验一致,C-degron结合口袋突变体Y345A/R437A和E387R/E388R未能挽救所有测试底物的降解(图 5B),尽管它们的表达水平与WT APPBP2相当,如免疫印迹所示(图 5C)。总而言之,基于GPS细胞的测定证明了 APPBP2 C-degron结合口袋在体内R-x-x-G/C-degron识别中的重要性。总体而言,结构生物学数据和体内GPS测定很好地支持了APPBP2介导的R-x-x-G/C- degron通路的模型(图 5D)。

最后,我们研究了寡聚CRL2APPBP2状态对C-degron结合和底物周转的重要性。C54A/H89A APPBP2突变体(SI附录,图S12A)的表达不组装成寡聚复合物,在体内仍能降解底物(SI 附录,图S12B),在体外,它与具有相似亲和力的C-degrons结合(图3 D和F以及SI附录,表S1),并且能够催化底物多泛素化为WT APPBP2(SI附录, 图S12 C和D)。总而言之,这些数据表明APPBP2的寡聚状态对于承载R-x-x-G/C-degron的底物的多泛素化和随后的周转不是必需的。

9、不同 C-degron 识别模式之间的比较

已经解决了几种C-degron复合体,包括KLHDC2与Gly/C-degron的复合体(SI 附录,图S13A)、TRIM7与Gln/C-degron的复合体(SI 附录,图S13B)、FEM1B/C与Arg/C-degron的复合体(SI 附录,图S13 C和D)和 DCAF12与diGlu/C-degron的复合体(SI 附录,图S13E),这使我们能够将它们与带有R-x-x-G/C-degron的APPBP2进行比较(SI附录, 图S13F)。APPBP2-C-degron与其他E3连接酶/SR-C-degron复合物之间存在一些差异。首先,所有 degron结合蛋白都采用不同的结构,利用Kelch重复序列(KLHDC2)、PRY-SPRY结构域(TRIM7)、锚蛋白重复序列(FEM1蛋白)、WD40结构域(DCAF12)或TPR重复序列(APPBP2)(SI附录,图S13)。其次,将R-x-x-G/C-degron插入APPBP2的深袋中(SI附录,图 S13F),这相当于一条死胡同,而在其他C-degron结构中,degron肽位于凹槽中(SI附录,图S13 A-E)。第三,与其他C-degron相比,R-x-x-G基序并不严格位于C-degron的极端C末端,并且APPBP2在口袋中有足够的空间的情况下,在容忍R-x-x-G下游1到3个额外残基时表现出可塑性(SI附录,图 S13F)。第四,R-x-x-G/C-degron中的Arg和Gly分别通过静电和范德华相互作用被 APPBP2识别(图2H和 SI附录,图S13F)。尽管FEM1C和FEM1B也利用二分机制来识别Arg/C-degron,但它们具有不同的底物结合特性和序列选择性(SI 附录,图S13 C和D)。


讨论

在哺乳动物细胞中,UPS是去除不需要的、受损的或调节蛋白的主要途径。E3连接酶用作监测系统,通过识别底物的确定结构或序列基序来介导底物多泛素化和降解。据报道,通过募集特异性E3连接酶,特异性N端和C端蛋白序列分别作为N-和C-degrons发挥作用。最近证明通过不同SR的CRL可以识别C -degrons 库,并且诱变方法与结构方法相结合可以阐明CRL底物选择的分子机制。在这里,我们提出了组装的CRL2APPBP2结合的几种结构,其中包含共享R-x-x-G基序的示例C-degrons。

出乎意料的是,CRL2APPBP2采用Zn2+介导的同型二聚体,RBX1进一步介导两个二聚体的二聚化,生成四聚体CRL2APPBP2。SR介导的CRL2APPBP2二聚化先前已证明用于其他CRL 复合体,作为识别底物中多个degron的一种手段或促进不同的赖氨酸受体位点利用,总体上增加了底物泛素化。然而,不组装成二聚体的APPBP2突变体能够像WT APPBP2一样有效地促进底物泛素化和降解,这表明带有R-x-x-G/C-degon的底物的周转不需要寡聚化。然而,我们不能排除寡聚状态可能促进非C-degron的 APPBP2底物降解的可能性。此外,我们不能排除寡聚状态代表部分自身抑制状态,正如最近报道的CRL2KLHDC2和 CRL4DCAF1 E3连接酶一样。

通过解析与不同C-degron肽结合的CRL2APPBP2的几种结构,我们发现R-x-x-G基序中的精氨酸和甘氨酸,被APPBP2通过二分结合机制被识别,构成了APPBP2靶向的主要 C-degron决定簇。此外,R-x-x-G基序的主链基团通过在所有结构中与APPBP2残基形成氢键来刚性化,这不允许主链上发生任何构象变化,从而解释了在所有底物的Arg和Gly之间严格存在两个间距残基的事实。然而,C末端的R-x-x-G基序位置是灵活的,并且相对于其与C端的距离在一定程度上表现出可塑性,正如我们的体外和体内试验所揭示的那样,C端以R-x-x-G-x(XP_211896和MRPL28)、R-x-x-G-x-x(ASCC3)和R-x-x-G-x-x-x [XP_211896(+AA)]结尾。这一发现与APPBP2的深C-degron结合口袋一致,它容纳额外的C末端残基以避免空间冲突。与其他SR C-degron结合槽相比,口袋深度是独一无二的,这些槽太浅,无法容忍额外的C端残留基。

另一个有趣的特征是,APPBP2靶向以R-x-x-G结尾的底物的能力与KLHDC2、KLHDC3和KLHDC10对以甘氨酸结尾的C -degrons的特异性部分重叠。事实上,我们之前发现CRL2KLHDC2和CRL2APPBP2都可以控制以RXXGG结尾的底物的周转,例如PTOV1(RGMGG),这增加了R-x-x-G/C-degron可能与其他C-degron通路合作以消除不需要的蛋白质的可能性。除了R-x-x-G/C-degron口袋外,APPBP2可能还有一个替代的底物结合口袋,如其他SR如FEM1B。最近,发现CRL2APPBP2通过以泛素化依赖性方式介导PRDM16的降解来调节米色脂肪代谢。然而,PRDM16(SGAFHPINHL)的C端序列与R-x-x-G/C-degron没有表现出任何相似性。未来鉴定APPBP2底物的研究将阐明其底物范围,从而阐明其生理意义。

来自COSMIC数据库(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/)的数据表明,APPBP2过表达和突变与不同类型的肿瘤有关。除了预测会破坏APPBP2折叠的突变外,APPBP2-degron结合界面上还发生了两个单一突变,即E388K和E469K。Glu388与R-x-x-G 基序的Arg形成静电相互作用,而Glu469与R-x-x-G基序下游的残基形成极性相互作用。因此,这两个突变可能会削弱APPBP2的degron结合亲和力,从而损害CRL2APPBP2介导的蛋白质周转的复杂调节。因此,我们的研究不仅揭示了寡聚 CRL2APPBP2组装和 APPBP2识别R-x-x-G/C-degron 的潜在机制,而且还阐明了靶向CRL2APPBP2 E3 连接酶的小分子抑制剂和PROTAC分子的设计,具有治疗意义。



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