HPV18 E7通过降解PTPN14抑制LATS1激酶以及激活YAP1

越来越多的证据表明，Hippo通路是包括人类乳头瘤病毒在内的肿瘤病毒的目标。高危HPV E7的致癌活性需要YAP1活性，但HPV E7激活YAP1的机制尚未阐明。最近发表于mBio杂志的一篇文章中，研究人员报道了HPV 18E7通过降解肿瘤抑制因子PTPN14，抑制LATS1激酶，降低YAP1的磷酸化。这些数据支持HPV癌蛋白可以抑制Hippo信号以激活YAP1，并加强PTPN14与人上皮细胞中Hippo信号之间的联系。

高危人乳头瘤病毒（HPV）癌蛋白灭活细胞肿瘤抑制因子以重编程宿主细胞信号通路。HPV E7蛋白结合并降解肿瘤抑制因子PTPN14，从而促进YAP1癌蛋白的核定位，抑制角化细胞分化。YAP1是一种转录辅助激活因子，可驱动上皮细胞的干细胞性和自我更新。YAP1活性受到高度保守的Hippo通路的抑制，Hippo通路在人类癌症中经常失活。MST1/2和LATS1/2激酶构成Hippo激酶级联的核心。活性LATS1激酶在苏氨酸1079上磷酸化，并通过在丝氨酸127等氨基酸上磷酸化YAP1来抑制YAP1。在这里，我们测试了高风险（致癌）HPV18 E7对Hippo通路活性的影响。我们发现，无论是敲除PTPN14还是HPV18 E7降解PTPN14，都能降低人角质形成细胞中LATS1 T1079和YAP1 S127的磷酸化水平，并抑制角质形成细胞的分化。相反，PTPN14依赖性分化需要LATS激酶和PTPN14中的某些PPxY基序。PTPN14促进分化既不需要MST1/2激酶，也不需要假定的PTPN14磷酸酶活性位点。综上所述，这些数据表明HPV18 E7使PTPN14失活或降解PTPN14可降低LATS1活性，促进YAP1活性并抑制角化细胞分化。

1、敲除PTPN14可降低人角化细胞中YAP1 S127和LATS1 T1079的磷酸化

HPV感染人角质形成细胞，敲除PTPN14或HPV E7介导的PTPN14降解可促进YAP1在层状上皮基底层的核定位。然而，PTPN14在Hippo信号传导中的作用尚未在人角质形成细胞中进行测试，PTPN14控制YAP1的机制也尚未建立。为了验证E7降解PTPN14抑制Hippo信号传导的假设，我们监测了PTPN14存在和不存在时Hippo通路的活性。首先，我们直接操纵PTPN14。我们用慢病毒载体转导hTERT永活的人角质形成细胞（N/Tert-1），以传递Cas9和两种不同的靶向PTPN14的sgRNA之一，或非靶向对照sgRNA。破坏肌动蛋白细胞骨架激活Hippo激酶，我们用肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素D处理细胞以诱导Hippo信号传导。YAP1 S127磷酸化（YAP1 pS127），反映了YAP1活性的降低，在细胞松弛素D处理90分钟内，在每个非靶向对照细胞系中，相对于总YAP1升高（图1A）。相比之下，在经细胞松弛素D处理的PTPN14敲除细胞系中，YAP1 pS127水平较低。在细胞松弛素D处理90分钟后，与对照细胞相比，PTPN14敲除细胞中YAP1 pS127/总YAP1的比例有统计学意义的下降(图1B)。

图1 在敲除PTPN14的角质形成细胞中，YAP1 S127的磷酸化减少

在观察到YAP1 pS127在敲除PTPN14的角质形成细胞中被抑制后，我们试图确定敲除PTPN14是否会降低LATS的磷酸化，而LATS是LATS激酶活性的一个标志。为了补充细胞松弛素D处理实验，我们通过将细胞从生长底物中分离来诱导Hippo激酶活性。将两组独立的非靶向对照或PTPN14敲除的N/Tert-1细胞进行低密度培养，然后胰酶化分离，悬浮培养10分钟。在对照细胞中，YAP1 pS127水平在悬浮后升高，但在PTPN14敲除细胞中，YAP1 pS127的升高很低或可以忽略不计（图2A和B）。同样，在非靶向对照细胞中，LATS1 T1079 （LATS1 pT1079）的磷酸化在脱离后比在PTPN14敲除细胞中增加得更多。每个PTPN14敲除细胞系中YAP1 pS127/总YAP1的比率和LATS1 pT1079/总LATS1的比率与匹配的对照细胞系相比有统计学意义的下降（图2C）。Western blot在N/Tert-1细胞中未检测到LATS2蛋白。NF2结合LATS激酶并将其拴在质膜上。当Hippo信号激活时，NF2 S518的磷酸化会减少。去磷酸化的S518表明NF2和Hippo信号通路活跃。培养细胞在悬浮液中降低了对照和敲除PTPN14的N/Tert-1细胞中NF2 pS518的水平（图2），表明敲除PTPN14改变了LATS1和YAP1的磷酸化，但不改变NF2。

图2 在PTPN14敲除的角质形成细胞中，LATS1 T1079的磷酸化减少

2、HPV18 E7介导的PTPN14降解降低了人角化细胞中YAP1 S127和LATS1 T1079的磷酸化

为了测试PTPN14被高危HPV E7癌蛋白降解是否也会降低YAP1和LATS1的磷酸化，我们使用了表达HPV18 E7、HPV18 E7 R84S或载体对照的N/Tert-1细胞。HPV18 E7 R84S不能结合或降解PTPN14，但可以使RB1失稳。同样，细胞松弛素D处理或悬浮培养用于刺激Hippo活性。随着时间的推移，在细胞松弛素D处理的载体对照细胞中，YAP1 pS127相对于总YAP1增加，但在野生型HPV18 E7细胞中没有（图3A和B）。在HPV18 E7 R84S细胞中，PTPN14蛋白水平和细胞松弛素D处理后YAP1 pS127的诱导均部分恢复。使用细胞分离刺激Hippo激酶活性也有类似的效果。在载体对照和HPV18 E7 R84S细胞中，细胞脱离后YAP1 pS127和LATS1 pT1079表达增加，但在野生型HPV18 E7细胞中，细胞脱离依赖性增加较小（图3C和D）。综上所述，这些数据支持HPV18 E7能够抑制hippo依赖性磷酸化LATS1 T1079和YAP1 S127，依赖于其结合和降解PTPN14的能力。

图3 HPV18 E7介导的PTPN14降解降低了YAP1 S127和LATS1 T1079的磷酸化

3、PTPN14促进分化和Hippo通路活性

敲除PTPN14可降低上皮分化基因的表达，抑制细胞脱离诱导的分化基因的表达。为了测试PTPN14对分化的影响是否与其对YAP1磷酸化的影响相关，我们首先测试了PTPN14敲除对N/ Tert-1细胞分化的影响。钙处理诱导角化细胞中的分化基因表达，我们证实，与匹配的对照组相比，钙处理的PTPN14敲除细胞中分化标记基因Keratin 10 （KRT10）和involucrin （IVL）的转录水平降低（图4）

图4 敲除PTPN14损害角质形成细胞分化

观察到PTPN14限制了分化基因的表达，促使我们测试反过来是否也是正确的：升高的PTPN14水平可以增加分化基因的表达。用慢病毒编码HA标记的多西环素诱导的PTPN14 （pLIX-PTPN14）转导N/Tert-1角化细胞。在多西环素处理的N/Tert-pLIX-PTPN14细胞中，IVL和KRT10转录物水平升高（图5A）。这一发现与我们之前的报道一致，即PTPN14过表达增加了原代人包皮角质形成细胞（HFKs）中分化标记基因KRT1和IVL的表达。在证实增加PTPN14可以促进N/tert-1细胞的分化后，我们测试了它是否改变了Hippo蛋白的磷酸化。多西环素处理诱导PTPN14，增加YAP1 pS127和LATS1 pT1079，适度降低NF2 pS518（图5B）。总的来说，PTPN14过表达增加了YAP1 pS127和LATS1 pT1079的磷酸化，促进了分化基因的表达。相反，敲除PTPN14可抑制YAP1 pS127和LATS1 pT1079，降低分化基因的表达。

图5 PTPN14促进角质细胞分化和Hippo通路活性

4、PTPN14 PY1/2基序是诱导角质细胞分化所必需的

接下来，我们使用PTPN14过表达来确定PTPN14的哪个区域上调分化。Hippo通路的几种蛋白质组分通过互补的WW结构域和PPxY （PY）基序相互作用。PTPN14包含两组PY基序，并具有C端酪氨酸磷酸酶结构域。然而，PTPN14磷酸酶结构域的氨基酸序列与活性蛋白酪氨酸磷酸酶的共识序列不同，可能很少或没有催化活性。我们设计了两个突变体，每个突变体都缺乏一个PY基序对，第三个突变体在假定的磷酸酶活性位点的保守活性半胱氨酸上含有一个丝氨酸点突变体C1121S（图6A）。我们用编码野生型（WT）和突变型PTPN14的慢病毒转导HFKs，然后测量KRT1分化标记转录水平（图6B）。KRT1水平在WT PTPN14、PTPN14∆PY3/4和PTPN14 C1121S细胞中升高，而在PTPN14∆PY1/2细胞中无升高。

PTPN14 PY1/2基序与WWC1的WW结构域具有高亲和力结合（KIBRA）。因此，我们测试了WT或PY突变形式的PTPN14是否在人角质形成细胞中与WWC1结合。用PTPN14 sgRNA转染N/Tert-Cas9细胞以消除内源性PTPN14，然后用pLIX载体编码WT或突变HA标记的PTPN14进行转导。虽然PTPN14∆PY1/2的稳态水平低于WT PTPN14或PTPN14∆PY3/4，但实验中仍有部分PTPN14∆PY1/2的表达和免疫沉淀。WT诱导PTPN14后，PTPN14和KRT10蛋白水平升高。用强力霉素和裂解物处理细胞，进行抗HA免疫沉淀。野生型PTPN14和PTPN14∆PY3/4共免疫沉淀相当数量的WWC1（图6C）。即使考虑到PTPN14∆PY1/2突变体的较低表达，与WT PTPN14或PTPN14∆PY3/4相比，PTPN14∆PY1/2共免疫沉淀的WWC1量可以忽略不计。我们得出结论，PTPN14诱导角质细胞分化的能力需要与WWC1结合的PY基序，而不是PTPN14 C1121残基。

图6 诱导分化需要PTPN14 PY1/2基序

5、PTPN14诱导角质细胞分化需要LATS激酶

我们之前使用siRNA敲低联合PTPN14过表达的方法证明了PTPN14促进分化基因表达需要YAP1。这一发现是基于观察到虽然YAP1及其平行TAZ基因的敲除增加了分化基因的表达，但PTPN14过表达并不能进一步增加YAP1/TAZ缺失细胞中分化基因的水平。我们的数据进一步支持PTPN14对由YAP1介导分化的主导作用，而不是TAZ。我们还观察到，在HFK中敲低LATS1或LATS2可降低分化基因表达的基础水平。

在这里，我们使用相同的敲低加过表达策略来确定PTPN14诱导角质细胞分化所需的Hippo途径的几个额外成分。我们用靶向YAP1和TAZ、LATS1和LATS2或非靶向对照的siRNA转染HFKs。转染24小时后，用编码PTPN14或GFP的慢病毒转导细胞，然后在转染72小时后收集细胞总RNA。在sicontrol处理的细胞中，PTPN14的表达增加了KRT10、KRT1和IVL的水平(图7)。与我们之前的发现一致，HFK中YAP1和TAZ的敲低增加了分化基因的表达，但与sicontrol转染的细胞相比，PTPN14在YAP1/TAZ缺失的细胞中不能进一步增加分化。尽管PTPN14在用两组不同的靶向LATS1和LATS2的siRNA处理的细胞中保留了一定的增加KRT10、KRT1和IVL RNA的能力(图7A)，在整个实验过程中，LATS敲低细胞中所有三种分化标记基因的水平都很低。在缺乏LATS激酶的情况下，PTPN14并没有增加KRT10、KRT1或IVL的水平，超出未处理的对照细胞中观察到的水平。

接下来，我们测试了PTPN14是否需要MST1和MST2、NF2或WWC1及其类似物WWC2和WWC3来诱导分化。我们用靶向MST1、MST2、NF2或所有三个WWC基因的siRNA转染HFK，用编码GFP或PTPN14的慢病毒转导细胞，并测量KRT10转录水平。MST1和2的缺失不影响PTPN14诱导KRT10的能力（图7B）。与敲除LATS1和LATS2类似，NF2的敲除虽然没有完全消除PTPN14诱导KRT10的能力，但也限制了它们的表达（图7C）。WWC基因缺失具有中间效应，但在WWC1/2/3缺失的情况下，PTPN14仍能诱导KRT10数倍。ptpn14诱导的分化减少的程度与WWC1缺失的程度相关(图7D)。这些数据支持LATS激酶和NF2是PTPN14完全诱导分化所必需的。

图7 PTPN14诱导KRT10表达需要LATS激酶和NF2

6、敲除PTPN14可促进HEK - TER细胞的非锚定生长并降低YAP1 pS127

最后，我们在人类细胞转化实验中测试了PTPN14基因敲除的效果。HEK TER细胞是人胚胎肾（HEK）细胞，表达人端粒酶（hTERT）的催化亚基、猿猴病毒40 （SV40）大T抗原（LT）和ras的致癌等位基因（H-ras V12）。细胞是不朽的，但没有附着在基质上就不能生长。HEK细胞通过表达SV40小T （ST）抗原获得不依赖于锚定生长的能力。ST通过与Hippo通路上游STRIPAK复合物的PP2A亚基相互作用激活YAP1并转化HEK TER细胞。我们之前报道过HPV16 E7可以促进HEK细胞的非锚定生长。HEK TER细胞中的HPV16 E7转化活性广泛映射到降解PTPN14所需的区域。

为了测试PTPN14敲除是否促进HEK TER细胞的锚定非依赖性生长，我们生成了CRISPR/Cas9编辑的不表达PTPN14的HEK TER细胞。纳入LATS1/2敲除HEK TER细胞以验证Hippo通路抑制促进HEK TER生长，并纳入稳定表达SV40 ST的HEK TER细胞作为阳性对照。在软琼脂实验中，缺乏PTPN14、LATS1/2或表达SV40 ST的HEK TER细胞很容易形成菌落（图8A），而转染非靶向sgRNA的HEK TER细胞表现出最小的非锚定依赖性生长。与我们在人角化细胞中的发现和之前的报道一致，SV40 ST降低了YAP1的磷酸化，细胞松弛素D在HEK TER sgNT细胞中诱导YAP1 pS127的作用比在PTPN14、LATS1和LATS2缺失的细胞或表达SV40 ST的细胞更强烈（图8B和C）为了测试PTPN14敲除是否促进HEK TER细胞的锚定非依赖性生长，我们生成了CRISPR/Cas9编辑的不表达PTPN14的HEK TER细胞。纳入LATS1/2敲除HEK TER细胞以验证Hippo通路抑制促进HEK TER生长，并纳入稳定表达SV40 ST的HEK TER细胞作为阳性对照。在软琼脂实验中，缺乏PTPN14、LATS1/2或表达SV40 ST的HEK TER细胞很容易形成菌落（图8A），而转染非靶向sgRNA的HEK TER细胞表现出最小的非锚定依赖性生长。与我们在人角化细胞中的发现和之前的报道一致，SV40 ST降低了YAP1的磷酸化，细胞松弛素D在HEK TER sgNT细胞中诱导YAP1 pS127的作用比在PTPN14、LATS1和LATS2缺失的细胞或表达SV40 ST的细胞更强烈（图8B和C）。

图8 在HEK细胞中，敲除PTPN14可促进非锚定生长并降低YAP1磷酸化

我们的发现首次证明了病毒蛋白HPV18 E7靶向Hippo通路组分抑制LATS激酶活性，而LATS激酶是YAP1上游的中心调控步骤。PTPN14在层状上皮的基底层特异性表达，因此我们发现PTPN14可以在人角化细胞中控制YAP1以及LATS磷酸化，支持PTPN14是YAP1和Hippo通路的基层角化细胞特异性调节剂。我们之前的工作支持PTPN14降解和YAP1/TEAD转录活性是高危HPV E7转化活性所必需的。HPV癌蛋白与细胞靶点之间的其他直接相互作用，如E7/RB1和E6/p53，对HPV癌变至关重要，但迄今为止尚未成为治疗干预的可处理靶点。了解E7降解PTPN14激活YAP1的机制有可能为HPV疾病提供新的治疗机会，并阐明HPV E7蛋白如何促进基底上皮身份的特性。我们未来的研究还将使用E7和PTPN14作为工具，以更好地了解控制人类上皮细胞中Hippo信号传导和YAP1活性的复杂相互作用。