N端规则介导的蛋白酶体降解ATGL促进脂质储存

正文部分：

肥胖是一些常见疾病的主要危险因素，脂质储存过多是肥胖的主要原因。在细胞水平上，脂质合成与分解的平衡很大程度上决定了脂质的储存水平。

ATGL是脂肪分解的限速酶，其水平或活性与多种代谢状态相关。人类ATGL功能缺失突变导致中性脂质沉积病伴肌病。ATGL基因缺陷的小鼠心脏中积累大量的脂质，导致心脏功能障碍和过早死亡。有趣的是，脂肪组织特异性过表达或敲除ATGL似乎都是有益的。脂肪ATGL过表达的小鼠对饮食诱导的肥胖具有保护作用。ATGL基因敲除小鼠体重略有增加，但葡萄糖耐量和肝脏胰岛素敏感性改善。通过药理学抑制ATGL对高脂饮食( HFD )诱导的肥胖和肝脏脂肪变性有益。因此，ATGL水平或活性的时间和空间调节对于决定生理结果至关重要。

ATGL蛋白在非脂肪组织中低表达，但在白色脂肪组织( WAT )和棕色脂肪组织( BAT )中高表达。研究表明，ATGL的表达可以通过转录和转录后水平进行调控。目前对ATGL的转录、定位和激活的控制的研究有了很大的进展，但ATGL完整的体内调控机制还远未清楚。

最近，Jiesi Xu等人在《Diabetes》杂志上发表了一篇名为“N-end Rule–Mediated Proteasomal Degradation of ATGL Promotes Lipid Storage”的文章，发现ATGL蛋白水平受N-末端调节途径E3连接酶UBR1和UBR2的调控。N端规则途径是短寿命蛋白的某些N端残基被一类泛素连接酶识别，从而被蛋白酶体降解的蛋白水解系统。研究者证明，敲入N端突变ATGL ( F2A ) (命名为ATGL F2A/F2A)的小鼠表现出更高的脂解水平，并抵抗HFD诱导的肥胖和肝脏脂肪变性。

实验结果：

一、蛋白酶体活性与蠕虫、果蝇和哺乳动物细胞中的脂质储存正相关

为了寻找新的中性脂质储存调节因子，研究者在秀丽隐杆线虫中进行了RNA干扰( RNAi )筛选，发现两个蛋白酶体组分基因: pas-5和pbs-4在敲低时会导致脂质储存降低（图1A），继续筛选其他蛋白酶体组分发现几乎所有核心组分和少数调节组分的敲低都引起了类似的表型。这表明适当的脂质储存离不开蛋白酶体。同时，在果蝇的遗传筛选中，当过表达蛋白酶体的调节亚基Rpn2时，果蝇唾液腺中的脂质储存显著增加。这些发现表明蛋白酶体促进蠕虫和果蝇中的脂质储存。

另外，研究者还检测了蛋白酶体抑制剂MG132对蠕虫和哺乳动物细胞脂质储存的影响。发现MG132处理后，虫体内脂肪含量降低，并且呈剂量依赖性(图1B )。同样，在MG132处理的HepG2细胞中，脂滴的大小、数量以及甘油三酯水平均降低(图1C - F)。这些结果表明，在蠕虫、果蝇和哺乳动物细胞中，蛋白酶体活性与脂质储存呈正相关。

二、Atgl水平受蛋白酶体活性调节

接下来，研究者对蛋白酶体活性与脂质储存之间关系的机制进行了探索。前期工作表明，通过蛋白酶体抑制剂处理，ATGL的水平升高。因此，研究者分析了蛋白酶体活性、ATGL水平和脂质储存之间的联系。在正常和油酸( OA )负载细胞中用MG132处理后，内源性ATGL水平显著增加。有趣的是，与对照相比，OA处理也提高了ATGL的蛋白水平(图1G )。

为了检测MG132介导的OA细胞脂质储存抑制是否与ATGL的升高有关，研究者在HepG2细胞中敲低ATGL，发现敲低ATGL显著抑制了MG132处理引起的脂质储存减少(图1C - F)。

与之前的发现一致，MG132处理后ATGL泛素化的水平增加(图1H )。与MG132相反，溶酶体H+ - ATPase抑制剂bafilomycin A1处理不影响OA处理和未处理细胞中内源性ATGL水平(图1I )。这表明ATGL主要通过泛素-蛋白酶体途径降解。总之，这些数据表明蛋白酶体活性调节脂质储存，至少部分是通过ATGL降解。

图1. ATGL通过泛素-蛋白酶体系统降解

三、E3连接酶Ubr1和Ubr2影响ATGL稳定性和细胞内脂质储存

接下来研究者尝试鉴定ATGL泛素化和降解可能依赖的E3连接酶。候选的E3连接酶至少应满足两个条件：1.当突变时，其在体内应具有脂质代谢相关表型；2.影响ATGL的泛素化。ATGL具有一个不稳定的N端残基--苯丙氨酸( F )，该残基在脊椎动物中是保守的(图2A )。此外，有报道显示Ubr1-/-小鼠的肥胖程度降低。

基于此，研究者检测了ATGL的稳定性是否受UBR1的调控。与阴性对照相比，UBR1 RNAi增加了ATGL蛋白水平。类似地，将属于UBR蛋白家族，发挥冗余作用的UBR2敲低后，HeLa细胞中内源性ATGL蛋白水平升高，UBR1 / UBR2双RNAi细胞中ATGL蛋白水平较对照显著升高(图2B )。ATGL RNAi导致脂质储存增加，而敲低UBR1或UBR2后，ATGL RNAi HepG2细胞(图2C - F)中脂滴的大小和数量减少，甘油三酯积累水平降低。这表明UBR1和UBR2影响ATGL调控的脂质储存。

研究者还发现UBR1和UBR2均与ATGL-Flag相关(图2G和H)。进一步确定了ATGL被UBR泛素化的赖氨酸残基。与之前发现ATGL的多聚泛素化信号位于蛋白的N端相一致，在带Flag标签的全长ATGL和N端片段中(1-160aa)均检测到泛素化信号，且UBR1敲低后，全长和N端ATGL的泛素化信号均显著降低。在ATGL的N端patatin结构域中寻找UBR1依赖的泛素化位点。该区域有6个赖氨酸( K )残基，当第68、74、78、92或135位的赖氨酸突变为精氨酸( R )时，UBR1敲低增加了ATGL蛋白水平，而ATGL ( K100R )对UBR1的敲低没有响应，表明K100是ATGL的UBR1依赖性泛素化位点(图2I)。

图2. N端规则途径泛素连接酶UBR1和UBR2调节培养细胞中ATGL的稳定性和脂质储存

四、N端规则残基影响ATGL的稳定性

研究者将ATGL的N端不稳定残基苯丙氨酸( F )突变为稳定残基丙氨酸( A )或缬氨酸( V )，发现ATGL F2A和F2V突变体比WT更稳定(图3A和B)。MG132存在时，泛素化ATGL ( F2A )的水平低于ATGL ( WT ) (图3C )。此外，UBR1和UBR2的敲低增强了ATGL ( WT )蛋白的水平，但对ATGL ( F2A )突变体没有影响(图3D )。这表明ATGL的N端苯丙氨酸残基对于UBR1和UBR2调节的蛋白质稳定性很重要。

ATGL在脂肪细胞中高表达，ATGL介导的脂解作用对于禁食期间提供能量生产所需的游离脂肪酸( FFA )至关重要。然后研究者检测ATGL ( F2A )突变体是否影响3T3L1脂肪细胞的脂解和脂质储存。在基础状态的3T3L1脂肪细胞中，表达ATGL ( WT )和ATGL ( F2A )的细胞中，FFA和甘油释放评估的脂肪分解水平相当，但ATGL ( F2A )细胞在4 h时甘油释放增加(图3E和F)。异丙肾上腺素刺激脂肪分解导致FFA和甘油释放增加，并且这种增加在ATGL ( F2A )细胞中大于ATGL ( WT )细胞(图3E和F)。N端规则残基替换不影响ATGL与ATGL激活剂CGI58或ATGL (附图2F和G)抑制剂G0S2的结合。相应地，受刺激的ATGL ( F2A )表达中脂滴大小和数量减少，甘油三酯积累减少。

图3. N端规则残基影响ATGL的稳定性和ATGL介导的脂解作用

五、ATGL ( F2A ) Knock - In小鼠脂肪组织中脂解和脂肪酸B氧化水平升高

接下来，为了揭示稳定ATGL在小鼠体内的作用。研究者构建了ATGL ( F2A )基因突变的敲入小鼠。与对照小鼠相比，Atgl F2A / F2A小鼠ATGL水平在性腺WAT和BAT中分别增加了3倍和1.5倍(图4A和B)。与脂肪组织类似，Atgl F2A / F2A小鼠肌肉中ATGL蛋白水平升高。随着蛋白水平的增加，ATGL ( F2A )引起体外(图4C和D)脂解增强。当小鼠喂食HFD 8周后，ATGL ( F2A )导致标记的甘油三酯中FFA释放增加(图4E)。

先前的研究报道过表达ATGL导致过氧化物酶体增殖物激活受体a ( PPARa )信号和脂肪酸b -氧化( FAO )的激活。同样，与对照组相比，高脂喂养的Atgl F2A / F2A小鼠性腺WAT中PPAR α信号和FAO相关基因的表达水平更高(图4F )。脂肪合成和脂肪分解相关基因的表达水平没有受到显著影响(图4F )。此外，利用[ 3H ]棕榈酸酯直接测定FAO发现，高脂喂养的Atgl F2A / F2A小鼠WAT中FAO增强(图4G )。这些数据表明Atgl F2A / F2A小鼠脂肪组织中ATGL蛋白水平和甘油三酯水解酶活性增加。

图4. Atgl F2A / F2A小鼠脂肪组织中脂解增加

六、Atgl F2A / F2A小鼠对饮食诱导的肥胖和肝脏脂肪变性具有抵抗作用

接下来，研究者检测了ATGL ( F2A )对肥胖发生发展的影响。Atgl+/+和Atgl F2A / F2A小鼠从8周龄开始配对喂养高脂饲料16周。

Atgl F2A / F2A小鼠体重增长小于Atgl+/+小鼠(图5A )。与Atgl+/+小鼠相比，高脂喂养的Atgl F2A / F2A小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性得到改善(图5B - D)。为了确定ATGL ( F2A )对能量平衡的影响，研究者测量了O2消耗，CO2 产生和能量消耗，发现这些水平在HFD喂养的Atgl F2A / F2A小鼠中更高(图5E和F)。

Atgl F2A / F2A小鼠喂食HFD后，肝脏重量、WAT和BAT重量均降低(图5G)，脂肪组织切片中WAT和BAT中脂肪细胞的大小也减少。由于高脂喂养的Atgl F2A / F2A小鼠肝脏重量降低，研究者进一步分析了ATGL ( F2A )在肝脏中的作用。与Atgl+/+小鼠相比，HFD喂养的Atgl F2A / F2A小鼠肝脏甘油三酯和总胆固醇水平以及肝脏脂滴积累显著降低，肝脏损伤指标ALT水平降低(图5K-M )。与对照组小鼠相比，Atgl F2A / F2A小鼠肝脏中ATGL蛋白水平升高。为了进一步确定Atgl F2A / F2A小鼠肝脏中脂质积累减少是否归因于脂质降解的增强，研究者测定了FAO水平。参与FAO和脂肪酸转运的基因表达水平显著升高(图5N )。与对照组相比，HFD喂养的Atgl F2A / F2A小鼠肝脏中FAO水平显著升高(图5O)。这些结果表明Atgl F2A / F2A小鼠能够抵抗HFD诱导的肥胖和肝脏脂肪变性。

图5. Atgl F2A / F2A小鼠对饮食诱导的肥胖具有抵抗力

七、肝脏敲低UBR1抑制HFD诱导的脂肪肝

随后研究者检测了UBR1介导的ATGL降解在小鼠体内的生理效应。在Atgl +/+或Atgl F2A / F2A小鼠肝脏中敲低UBR1 ( AAV-TBG-shUbr1 )。甲状腺素结合球蛋白( TBG )启动子保证了肝脏中基因的敲除。对照组动物接受AAV - TBG - shCon。肝脏敲低UBR1不影响正常饮食喂养或禁食小鼠的肝脏甘油三酯水平。HFD喂养的Atgl F2A / F2A小鼠体重增加减少，肝脏脂质积累减少，血浆ALT水平降低，这些有益的作用不受肝脏敲低UBR1的影响，这表明在Atgl F2A / F2A小鼠中，UBR1介导的ATGL降解被抑制。然而，在高脂喂养的Atgl+/+小鼠中，肝脏敲低Ubr1导致肝脏脂质积累和血浆ALT水平降低(图6A - C)。

然后，研究者在HFD喂养的Atgl+/+和Atgl F2A / F2A小鼠中检测了肝脏Ubr1敲低与否对能量平衡和葡萄糖稳态的影响。与Atgl +/+小鼠相比，Atgl F2A / F2A小鼠的VO2、VCO2和能量消耗显著增加。无论基因型如何，敲低Ubr1均不影响其水平。敲低Ubr1虽然改善了Atgl +/+小鼠的葡萄糖稳态，但对Atgl F2A / F2A小鼠的葡萄糖稳态没有影响(图6D - F)。为了检测胰岛素通路的活性，高脂喂养的Atgl +/+和Atgl F2A / F2A小鼠腹腔注射1单位/ kg胰岛素，Atgl F2A / F2A小鼠肝脏中p - AKT ( Ser473 )和p - AKT ( Thr308 )水平增强，敲低肝脏Ubr1不影响Atgl F2A / F2A小鼠肝脏中胰岛素通路的活性(图6G )。这些数据表明Atgl F2A突变对HFD诱导的小鼠肝脏脂肪变性和葡萄糖稳态的有益影响不受肝脏Ubr1敲低的影响。

肝脏基因表达水平分析显示，在Atgl +/+小鼠中，Ubr1缺失下调了Pparg及其靶基因Fabp4的表达，而在Atgl F2A / F2A小鼠中，这种作用被削弱，参与FAO和脂肪分解的基因表达水平增强(图6H )。接下来，研究者在体内检测UBR1是否调控ATGL水平。Atgl +/+小鼠敲低Ubr1后ATGL蛋白水平升高，Atgl F2A / F2A小鼠敲低Ubr1后ATGL蛋白水平不受影响( 图6I )。相应地，通过敲低Atgl +/+小鼠肝脏Ubr1降低了ATGL的多聚泛素化水平(图6J )。这些数据表明，在HFD条件下，肝脏敲低Ubr1降低了脂质合成，增加了FAO。此外，Atgl F2A / F2A小鼠Ubr1敲低前后的表型相似性表明，UBR1在体内发生N端规则介导的ATGL降解。

我们进一步检测了肥胖小鼠中UBR1与ATGL水平的相关性。发现ob / ob小鼠中ATGL蛋白水平下调，UBR1水平上调，这表明UBR1与ATGL水平呈负相关(图6K )。这些结果表明ATGL的N端规则介导的蛋白酶体降解调节肝脏脂质代谢和胰岛素敏感性。

图6. 肝脏敲低UBR1减轻HFD诱导的肝脏脂肪变性

讨论：

本研究发现具有典型的不稳定N端残基的ATGL通过N端规则途径进行调控。敲低E3泛素连接酶UBR1和UBR2，或用蛋白酶体抑制剂处理，可提高ATGL水平，减少脂质储存。重要的是，稳定的ATGL [ ATGL ( F2A ) ]对HFD诱导的小鼠肥胖和相关的肝脏脂肪变性具有有益的影响。