E3泛素连接酶UFM1促进ER来源的60s核糖体亚基的回收利用

摘要

UFM1是一种泛素样蛋白，调控在单核糖体蛋白uL24（也被称作RPL26）上的单赖氨酸残基。UFM1聚合（UFM化）能够促进60S核糖体亚基的回收，在核糖体相关质控调节的核糖体破裂后释放，在分泌蛋白转入ER的共翻译转递的过程中锚定。本篇文献通过结构和生化分析证明E3泛素连接酶UFM1在ER膜中大型核糖体亚基的终止后释放和回收中的作用。

背景介绍

像其他泛素样蛋白一样，UFM1是通过E1-E2-E3酶联传递与其底物结合，而在这个过程中，E3连接酶赋予了这个过程的“特殊选择权”。

UFM1是由三个亚基组成——UFL1、DDRGK1、CDK5RAP3。其中，UFL1和DDRGK1形成了E3连接酶最小催化单位。而在DDRGK1上的跨膜结构域使UFM1固定到ER膜表面，以限制UFM1对ER停靠核糖体的识别。因此，UFM化与ER上蛋白稳态的维持有着密不可分的联系。

uL24在60S多肽通道出口的定位表明，UFM1调节的位点作为影响ER核糖体和SEC61转位子之间连接的重要位置。本篇文章假设uL24的UFM化通过紧密的核糖体-转座子连接，削弱了终止后60S亚基和SEC61转位子之间的功能。重点是未鉴定的UFM化的“阅读器”的存在，能够识别uL24连接的UFM1分支且诱导扰乱SEC61和终止的60S亚基之间的紧密连接。

结果

在UFM1上添加mT标签，观察实验结果发现mT-UFM1的显著细胞靶标是uL24，在敲除了E1（UBA5）的细胞里水平降低，在缺失ER膜上去UFM化的UFSP2的细胞中水平显著提升。通过对WT和敲除UBA5细胞进行比较后发现， E2酶UFC1在敲除UBA5细胞中完全不发挥作用。同时，团队研究人员发现验证的富含链霉亲和素的蛋白质中，在UBA5敲除后影响效果显著的蛋白主要是富集在ER膜定位蛋白上，包括转定位、ER靶向和N-糖基化机制的复合物。在敲除了UFSP2的细胞中，E3酶复合物在催化UFM1转移到uL24后仍然结合60S。

为了理解UFM1与UFM化的60S以及其催化关联反应的产物之间的相互联系，研究人员分析了在K562细胞中UFM化的uL24和UFM1亚基的分布。结果表明，在WT细胞中，UFM化的uL24和UFM1主要与游离的60S结合。而在UFM1敲除后，UFM1与uL24结合已UFM化的60S更多。如果诱导核糖体与异霉素和结合或是抑制UFSP2，就会增加UFM化60S数量，从而进一步加速UFM1亚基与60S的结合。在ATP的作用下，UFM1三个亚基用E1、E2和E3进行体外UFMylation重建，能够与60S共沉淀。

总之，这些结果证实了uL24 UFM化对于E3（UFM1）与60S的持续关联非常关键。游离60S亚基上的uL24是UFMylation的首选底物。

正如之前所分析的结果，冷冻电镜解析发现核糖体外的60S亚基能够与eIF6结合。通过体内UFM化的60S细胞电镜解析出了60S-UFM1-E3(UFM1)复合物的3D构象图。在体内和体外重建复合物中，E3(UFM)1都适配同样细长夹角样的外形，从出口通道横跨到tRNA结合物位点上。

60S-UFM1-E3（UFM1）分子模型解释了与E3（UFM1）连接的整个视角以及如何在60S上阅读UFM1调节的。UFM1并不直接与UFL1结合，是DDRGK1和CDK5RAP3组成一个复杂的连接网，和UFL1形成复合物。

E3（UFM1）复合物中，UFL1作为中心架构组成了短N端α螺旋，进入肽基转移酶中心（PTC），并连接两个螺旋和一个C-末端球状结构域。DDRGK1包含一个N-末端跨膜域和一个灵活的连杆区域，其余部分由一个长α-螺旋组成，连接到WH基序和pWH，pWH与UFL1的N-末端pWH结构域互补为复合WH，形成最小E3连接酶复合物的重要组成。CDK5RAP3亚基则通过一个由两个球状结构域GD1和GD2的长CC结构域对UFL1-DDRGK1主干进行包装。

E3（UFM1）与60S的相互作用是多模式的，三个亚基在相互作用中都有贡献。UFL1的C-末端球状结构域通过补充的夹在28S核糖体RNA（rRNA）螺旋H38和H69之间，构成了活性80S核糖体中功能上重要的位点，即A位点手指（H38）——协调A位点tRNAs。因此，UFL1的C端结构域覆盖了所有三个tRNA结合位点（图2e，f）。E3（UFM1）的这种结合模式与任何tRNA结合都是相互排斥的。UFL1与60S最亲密的相互作用发生在E位点附近和核糖体L1茎，其中UFL1的WH4和WH5以及CDK5RAP3的GD2共享广泛的接触，可以稳定这种原本灵活的元素。WH骨干由DDRGK1和UFL1的C端WH结构域和CDK5RAP3的CC区域组成，向uL24延伸（图3b），取代了rRNA段H25ES7的尖端和uL13的C端α-螺旋，都与UFL1建立联系。这些数据共同提出了一个模型，即uL24聚合UFM1形成一个亲密相互作用网络的联系，允许E3（UFM1）读取60S调节。

在冷冻电镜中观察到的单UFM化的60S颗粒清楚地表明了在（细胞质）RQC期间没有肽酰-tRNA或新生链的60S状态。此外，DDRGK1的EBM位于隧道出口的通用绑定点可能会排除SEC61的绑定。再加上本机结构中eIF6的存在，表明观察到的粒子在从SEC61分离后终止后出现60S亚基。

Pull Down结果显示E3（UFM1）的所有三个亚基的也都得到了很强的富集(Fig.4a)。冷冻电镜分析则表现出比Pull Down结果更高的异质性，其中最显著的特点是在分子的蛋白连接出口处存在SEC61复合物。UFL1捕获的粒子的3D分类揭示了E3（UFM1）-60S相互作用的三种不同状态(Fig. 4b)。在状态1复合物中，我们只观察到占据tRNA结合位点的UFL1 C-末端结构域的密度，以及UFL1-CDK5RAP3区域，在uL24区域没有观察到UFM1或E3（UFM1）的其余部分的密度，rRNA H25ES7处于其规范位置。相比之下，在状态2中，我们观察到uL24已经UFM化，E3（UFM1）与状态3一样几乎完全识别。

由于UFL1的C端区域，包括PTC回路，存在于所有三种状态中，我们推测E3（UFM1）60S识别的第一步是将L1茎与UFL1 C端区域结合和/不与tRNA的亚单位间表面结合。

相比之下，单独敲除CTD结构域并不影响UFM化，而删除CTD近端CC螺旋，以及部分相邻的无序结构域，会导致UFMy化几乎完全消失。这些结果证实了28S rRNA螺旋H38和H69之间CTD的重要性（图3c），并表明了CC结构域和潜在的无序区域在稳定E3（UFM1）和60S之间起始识别方面的作用。UFL1 C端在将E3锚定细胞中的核糖体方面的重要性可能为对60S的偏好提供了解释。

为了测试EBM和UFIM在UFM化中的作用，我们表达了野生型DDRGK1或敲除EBM（ΔEBM）或UFIM变体（UFIM（mt））。敲除EBM轻微增加了uL24 UFM化（图4d，左），但对E3（UFM1）与60S的共沉积没有明显影响。相比之下，UFIM破坏完全废除了稳定的E3（UFM1）-纤维体关联，同时增强了uL24的UFM化。UFIM（mt）表达细胞中UFM化uL24的很大一部分与细胞质核糖体有关，其中大多数已经UFM化的uL24在ER结合的核糖体上。由此可以得出结论，即E3（UFM1）在60S上持续结合其UFMylated产品需要UFM1和DDRGK1之间的β增强，并表明这种相互作用有助于EBM在隧道出口附近定位，以促进SEC61与核糖体的分离。

接下来，我们直接测试了UFM化在促进SEC61-60S解离中的作用。与野生型细胞相比，在敲除UFC1的UFM化缺陷细胞中，SEC61解离率大幅降低。而在UFM1敲除的细胞中，即使在30分钟后也很少发生分离。这些数据支持了UFM1共轭的结论，以便在终止后将60S亚基与转位器及时分离。

研究人员提出假设，UFSP2能够对连接UFM1和uL24的异肽键进行水解，同时释放60S并回收UFM1和E3（UFM1）。UFSP2的遗传消融导致膜相关uL24的UFM化大幅增加，并导致E3（UFM1）与60S的共沉淀增加。由于UFSP2从其寡聚体伙伴和膜锚ODR4分离时不稳定。实验发现，用UFSP1治疗大大减少了60S的uL24 UFMylation和E3（UFM1）亚基的共沉淀（图5a，b）。因此，脱UFM化从ER锚的E3（UFM1）中释放60S核糖体，将60S亚基释放到细胞质中。

讨论

本篇文章主要揭示了异三聚体E3（UFM1）在具有60S核糖体的复合物中的细长C形结构。值得注意的是，我们的生化和结构数据都将E3（UFM1）本身确定为其自己的60S修饰的阅读器，这导致了稳定的60S连接和ATP驱动的SEC61-60S结的破坏。在这里，UFM1共轭是关键，通过DDRGK1 UFIM协调E3（UFM1）的结合，并同时定位DDRGK1的EBH，使其与三聚体SEC61复合物发生连续冲突。同时研究人员建模型解释了E3（UFM1）与自由60S亚基的顺序接合，该亚基破坏了SEC61的结合，并最终在去UFMylation后从ER膜释放60S亚基（图5c）。

终止后60S亚基也必须有UFM1独立的方式从ER转位器分离，因为哺乳动物细胞可以适应UFM1或其结合装置的工程删除。然而，E3（UFM1）是否以及如何用结合的肽基-tRNA甚至80S核糖体与ER RQC衍生的60S亚基接合，仍有待阐明。由于E3（UFM1）与60S亚基35上的EFL1-SBDS结合位点发生尾部冲突（扩展数据图2c），持久的E3（UFM1）关联确保ER的终止后60S亚基不能重新参与翻译，直到它们被deUFMylation从ER释放出来（图5c）。

虽然需要进一步的研究来了解这些步骤是如何协调的，但UFM1路径与60S许可因子EFL1和SBDS的基本关系表明，该UBL在协调核素体回收和质量控制方面发挥了迄今为止未被重视的作用。