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摘要
黑色素瘤的主要治疗障碍是多种细胞状态的共存，这些细胞状态以不同的代谢特征为标志。从增殖性到侵袭性黑色素瘤表型的转变伴随着铁死亡易感性的增加，本文发现黑色素瘤细胞状态之间的铁死亡抵抗机制依赖于分泌APOE和APOE高表达，这可以作为黑色素瘤铁死亡不良反应的潜在生物标志物。
背景介绍
黑色素瘤细胞通过一系列分化状态转变的能力已成为有效和持久治疗的关键障碍。虽然黑色素瘤的突变在保护机制中发挥作用，但最近的高分辨率单细胞研究揭示了非遗传的适应性机制对耐药性的作用。特别是在多阶段细胞状态转变过程中，癌细胞获得了对脂质过氧化物解毒能力的依赖。同时，具有间充质和耐药表型的侵袭性癌细胞中脂质修复酶谷胱甘肽过氧化物酶4 （GPX4）的缺失导致脂质ROS的积累，引发铁依赖性细胞死亡，称为铁死亡。
在黑色素瘤中，诱导铁死亡的药物，如（IKE）或(1S, 3R)-RSL3 （RSL3）联合BRAF激酶抑制剂，在体外减少侵袭性黑色素瘤细胞的集落形成，可能是因为它们的谷胱甘肽水平较低。因此，靶向去分化状态是克服黑色素瘤耐药和防止复发的可行策略。然而，仍然缺乏对细胞内在代谢如何影响耐药/侵袭性黑色素瘤细胞的全面理解。此外，对黑色素瘤细胞状态共存如何影响致铁死亡药物治疗效果的理解在很大程度上是不完整的。鉴于黑色素瘤细胞通过分泌致瘤因子促进生长和侵袭的能力，除了癌细胞的内在机制外，耐药的表型可塑性和铁死亡易感性可能涉及自分泌或旁分泌回路。因此，了解黑色素瘤抵抗铁死亡脆弱性的细胞自主和非自主机制的多样性，对于设计针对耐药克隆的更有效的治疗策略至关重要。
结果分析
1、脂质重塑将铁死亡易感性与黑色素瘤细胞状态联系起来
为了评估膜脂组成的变化是否与黑色素瘤细胞状态对铁死亡的不同敏感性有因果关系，作者分析了12个黑色素瘤细胞系，这些细胞系代表了渐进式分化的细胞模型。根据特定基因集和转录因子的富集程度将这些细胞系分为四个亚型。黑素细胞(M)和短暂性(T)亚型表达更成熟的黑素细胞特征，以高水平的MITF为标志。更多的去分化神经嵴（NC）样和未分化(U)亚型共享低水平的MITF和高水平的受体酪氨酸激酶AXL（图1A）。正如预期的那样，大多数属于U亚型的黑色素瘤细胞以及在较小程度上属于NC亚型的黑色素瘤细胞都敏感于1类（IKE）和2类（RSL3）铁死亡诱导剂（FINs）（图1B）。在敏感的NC/U亚型中，细胞死亡伴随着bodipyc11染色的增加，这被自由基捕获抗氧化剂（RTA）利普斯汀（lipp -1）阻断（图1C）。相反，M和T黑色素瘤细胞状态显示出对细胞死亡的抗性（图1B）。
三维（3D）培养更好的模拟体内细胞相互作用和耐药过程，这可能影响铁死亡。M229细胞（MITF high，T亚型）对IKE具有抗性，没有可检测到的脂质过氧化迹象（图1、D和E）。相反，M229R细胞（MIT Flow， U亚型）的球体发生了铁死亡，伴随着脂质过氧化物的lip1抑制Bodipy C11染色（图1，D至F）。
图1 脂质重塑将铁死亡易感性与黑色素瘤细胞状态联系起来
2、APOE表达可区分黑色素瘤细胞状态
为了确定与黑色素瘤细胞状态相关的脂质代谢基因特征，作者进行了53个人类黑色素瘤细胞系的RNA测序数据集，这些细胞系被细分为四个亚型。集群1包括M和T亚型，统称为增生性（PRO），集群2包括NC和U亚型，统称为侵袭性（INV）（图2A）。进一步对前1200个差异基因进行差异表达（DE）分析，鉴定出186个基因（图2B）。在KEGG数据库中，鉴定胆固醇代谢的途径基因富集在过度代表性分析（ORA）中（图2C），载脂蛋白E （APOE）被确定为顶级差异基因，在PRO[第1组（M， T）]中高表达，在INV[第2组（NC， U）]中低表达。类似的APOE表达模式在癌症基因组图谱（TCGA）皮肤黑色素瘤（SKCM）的大肿瘤表达谱中也很明显，这些肿瘤被分为四种黑色素瘤亚型（图2D）。
之所以关注APOE，是因为这种34 kda的蛋白参与脂肪酸代谢，而且肿瘤来源的APOE在黑色素瘤进展过程中受到抑制。此外，APOE受MITF的转录控制，这表明这种载脂蛋白可能是黑色素瘤状态脂质代谢中的一部分。与RNA表达一致，在MITF high PRO黑色素瘤细胞中，APOE蛋白在细胞内和作为分泌蛋白的水平都很高，而当从T细胞过渡到NC样细胞时，APOE蛋白水平逐渐下降，在MITF low INV亚型中无法检测到（图2、E和F）。探讨APOE表达是否与暴露于BRAFV600E/k 和MEK （trametinib）抑制剂治疗后出现耐药黑色素瘤表型相关。为了解决这种可能性，使用来自黑色素瘤患者来源的异种移植物的单细胞RNA-seq数据进行分析，描绘了黑色素瘤细胞状态在治疗压力下转变的动力学。APOE在PRO黑色素瘤谱系中高度表达，而在耐药NC样和INV黑色素瘤状态中随着时间的推移而下调，具有更大的转移潜力（图2G）。
作者使用RNA原位杂交技术，通过观察主要MITF high （PRO）或MITF low （INV）黑色素瘤表型中APOE的空间表达发现，MITF high PRO黑色素瘤细胞的主要群体具有高APOE表达，而MITF low INV细胞群体具有明显较低的APOE水平（图2、H和I）。因此得出结论，APOE表达的变化是黑色素瘤细胞状态转变的一个特征。
图2 APOE表达可用来区分黑色素瘤细胞的状态
3、分泌的APOE保护黑色素瘤细胞免受铁死亡信号的传导
为了测试黑色素瘤细胞APOE表达与FINs反应之间的相关性，作者从药物基因组学数据库Cancer Therapeutics response Portal （CTRP）中挖掘了药物敏感性谱。与PRO细胞相比，INV细胞对FINs的敏感性增加。APOE表达与对2类FIN、RSL3、ML210和ML162的抗性相关，对1类FIN、Erastin的抗性也表现出类似的趋势（图3A）。
接下来，作者在蛋白质/信号水平上探索这些数据。因为要发挥其功能，APOE必须被分泌并脂化；因此测试了分泌的APOE是否在易受铁中毒的INV黑色素瘤细胞中发挥保护作用。暴露于来自嗜铁不敏感的PRO细胞的条件培养基中的INV细胞对FINs的致死效应产生抗性。这种保护依赖于APOE，因为在条件培养基中添加APOE中和抗体（ID7）逆转了这种作用（图3B）。
由于PRO细胞具有较高的增殖能力，将PRO M299-mCherry和INV M229R-EBFP细胞以40:60%的比例共培养24小时，添加或不添加APOE中和抗体1D7，然后用IKE处理（图3C）。与单独培养时观察到的INV M229R-EBFP细胞的铁死亡诱导（80%）相比，与PRO M229-mCherry细胞共培养时，铁死亡程度显著下降（30 - 40%）（图3D）。在APOE中和抗体（1D7）存在的情况下，IKE介导的铁死亡显著恢复到与铁死亡敏感的M229R细胞相当的水平（70%）（图3D）。
作者在M229R-EBFP和M229-mCherry细胞以40:60的比例混合形成的异型球体中评估了IKE介导的细胞死亡。这些球体组织在一个中心区域，主要由PRO M229-mCherry细胞组成，周围是对铁死亡敏感的M229R-EBFP细胞，共孵育3天后，每种细胞类型占球体的50%（图3，E至G）。将这些3D培养物暴露于IKE中，并使用lips -1验证对铁死亡的诱导（图3H）。与2D共培养结果一致（图3D），与未处理的情况相比，M229R-EBFP细胞对IKE诱导的细胞死亡的贡献更大（图3H）。分析细胞死亡动力学观察到，与高度敏感的M229R-EBFP同型球体相比，异型球体显示出较低的基底细胞和诱导的细胞死亡（图3I）。这种保护作用是与接触无关的，因为来自M229-mCherry同型球体的条件培养基抑制了M229R-EBFP细胞中的铁死亡（图3J）。因此，PRO细胞分泌APOE可以减弱INV细胞的铁死亡，从而将APOE描述为黑色素瘤中脂质-ROS保护的自分泌信号。
图3 分泌的ApoE保护黑色素瘤细胞免受铁死亡信号的传播
4、侵袭性黑色素瘤细胞铁死亡的阻断需要APOE受体和脂质结合域
在结构上，APOE有两个主要结构域，由一个铰链区（165至215aa）；N端结构域（1 ~ 191aa）形成受体结合区，C端结构域（225 ~ 299aa）包含主要的脂质结合区（244 ~ 272aa）（图4A和C）。脂质结合区是APOE获得生物活性构象所必需的，这是识别和结合低密度脂蛋白受体（LDLR）家族成员及其内化所必需的。
为了更深入地了解APOE变体的结构/脂质结合功能及其在减轻高敏感性黑色素瘤细胞铁死亡中的相关性，在诱导FIN介导的细胞死亡之前，将INV M229R细胞暴露于相似浓度的重组人（rh） ApoE2、ApoE3或ApoE4中。所有三种rhAPOE变体都能够恢复IKE或RSL3诱导的铁死亡（图4B）。在相同的实验设置下，rhAPOE未能保护INV细胞免受H2O2诱导的细胞死亡（图C和D），进一步表明其缓解作用明显针对脂质过氧化物，而不是一般的促氧化应激。
接下来，在受体结合（N端）或脂质结合（C端）区域截短ApoE3，与全长rhApoE3相比，去除ApoE3的N端受体结合域或C端结构域都会产生APOE突变体（图4C），在易感的INV细胞中失去了减弱铁死亡的能力（图4D）。此外，当这些细胞在缺乏脂蛋白的培养基中培养时，全长rhApoE3不能保护它们免受铁死亡的诱导（图4E）。
敲低PRO细胞中的APOE表达不会使其对FINs敏感（图4G），这表明细胞内APOE的丢失本身不足以重塑PRO黑色素瘤细胞中支持对FINs抵抗的脂质代谢。也有可能APOE的损失可以通过其他载脂蛋白的上调来补偿。根据这一假设，在PRO细胞中敲低APOE表达导致APOA2上调，APOA2是高密度脂蛋白的一种常见蛋白质成分，与APOE一样，在脂质代谢和胆固醇途径/运输中具有相同的功能。总之，这些结果表明APOE的受体结合结构域和脂质结合结构域在功能上都是其在INV黑色素瘤细胞中凋亡保护作用所必需的（图4F）。
图4 侵袭性黑色素瘤细胞中铁死亡的阻断需要APOE受体结合和脂质结构域
5、APOE通过诱导早期脂质重塑，随后GPX4升高，从而减弱铁死亡
APOE是一种多功能蛋白，具有等位基因特异性抗氧化特性和调节脂质代谢的能力。首先评估了APOE抗铁死亡作用是否涉及INV黑色素瘤细胞脂质组的变化，特别是其PUFA含量的变化。比较未经处理和rhAPOE3调控的INV细胞的脂质谱，没有发现PLs饱和状态的变化（图5A）。然而，在用rhApoE3处理后，我们观察到含有PUFAs的Lyso-PLs的总含量减少（图5A），这是黑色素瘤细胞向U细胞状态过渡时发现的主要脂质种类之一（图1G）。
接下来研究是否通过向培养基中添加PUFA Lyso-PL（花生四烯酰甘油酰磷脂酰胆碱/Lyso-AA）来恢复cPLA2酶产物在细胞内的可用性，可以重新使ApoE抑制的INV黑色素瘤细胞对FINs敏感。向PRO细胞的培养基中或直接向经rhApoE处理的黑色素瘤细胞中添加PUFA Lyso-PL（Lyso-AA），可恢复它们对FINs的敏感性（图5B和D）。相比之下，MUFA Lyso-PL（1-油酰甘油酰磷脂酰胆碱/Lyso-OA）无法使ApoE处理的INV细胞对细胞坏死敏感（图5C和E）。
APOE是一种已知的能够进口硒蛋白P（SELENOP）的蛋白质，它是血浆中一种主要的含硒蛋白质，对于GPX4等硒酶的合成是必需的，作者想知道INV黑色素瘤细胞中的sApoE是否能影响主要抗氧化酶GPX4的蛋白质表达。将INV黑色素瘤细胞暴露于rhApoE 6天后，GPX4蛋白质表达升高。GPX4蛋白质水平受到三种ApoE同型体的显著激活（图5F和G）。GPX4表达的增加还伴随着INV标记AXL水平的降低，而关键的黑色素细胞标记MITF的变化则没有观察到（图5F至H）。为了验证这一观察结果，将INV M238R细胞暴露于M229 PRO细胞的ApoE富集培养基中，并评估这些标记物的蛋白质水平的变化。同样地，在INV M238R细胞中也观察到了类似的趋势，在用M229细胞的ApoE富集培养基处理后，AXL的蛋白质水平降低，而GPX4的表达增加。这表明sApoE有能力减轻黑色素瘤细胞的侵袭表型，同时逆转其对铁死亡敏感的状态。总之，这些数据表明，sApoE通过激活多种效应机制来减轻INV黑色素瘤的铁死亡，包括最初的AA代谢重塑，以及随后的GPX4逐步增加和更广泛的NRF2抗氧化程序。
图5 APOE通过诱导早期脂质重塑，随后GPX4以不依赖于异构体的方式升高，从而减弱铁死亡
6、黑色素瘤相关的sAPOE在体内增加对铁死亡的抵抗力
为了研究APOE是否能减少黑色素瘤体内的治疗诱导的铁死亡，使用皮下植入人M229和M229R细胞的可移植小鼠黑色素瘤模型。使用IKE作为体内铁死亡诱导剂。首先测试了一系列小鼠黑色素瘤细胞系对FINs的体外敏感性。所有小鼠黑色素瘤细胞系都表达Sox10，并且表达极低水平的APOE和MITF（图S6A）。这些小鼠黑色素瘤细胞系对IKE和RSL3的致死浓度敏感（图6A），并通过选择性抑制Fer-1和DFO介导的铁死亡。接下来，用重组ApoE3处理这些小鼠细胞系，并测试它们对IKE的敏感性。与未处理的细胞相比，重组ApoE3减弱了所有小鼠细胞系中的IKE介导的细胞死亡（图6B）。
通过皮下注射未经治疗或rhApoE3治疗的Yumm 3.3细胞来排除由间质衍生的APOE的参与。一旦肿瘤体积达到100 mm3，就开始给性别匹配（雌性）的APOE−/− C57BL/6小鼠每天进行腹腔内注射溶剂、IKE或IKE加上Lip-1，共10天（图6C）。未经治疗或rhApoE3治疗的Yumm 3.3细胞的黑色素瘤生长情况相似（图6D），这表明rhApoE3暴露并不能在体内赋予这些小鼠黑色素瘤细胞生长优势。与未治疗小鼠相比，IKE减少了但并未消除肿瘤负担（图6D）。值得注意的是，IKE的抗黑色素瘤效果在rhApoE3治疗的Yumm 3.3黑色素瘤中同样被削弱，这进一步证实了APOE能够抑制这些肿瘤中的铁死亡（图6D）。
对sAPOE在体外长期对GPX4水平的影响感到好奇，随后对这些肿瘤中的Gpx4进行了染色。尽管样本之间存在一定程度的变异性，但观察到一个明显的趋势，即rhApoE3-黑色素瘤中的Gpx4蛋白水平在未处理和IKE处理后均增加（图6E），而在未经处理的ApoE3-Yumm 3.3黑色素瘤中则未出现这种情况（图6E）。这表明sApoE在体内诱导的升高的Gpx4水平有助于这些黑色素瘤抵抗铁死亡。总之，这些数据支持sAPOE作为调节GPX4表达和黑色素瘤铁死亡抵抗的调节因子的作用。
图6 黑色素瘤相关的sAPOE在体内增加对铁死亡的抵抗力
7、APOE基因的任何变异体均可作为是黑色素瘤中铁死亡抵抗的生物标志物
携带APOE4遗传变异的黑色素瘤患者的生存期较携带APOE2和APOE3有所改善。然而，尚不清楚APOE遗传型是否能预测黑色素瘤患者的铁死亡易感性。从TCGA数据库中挖掘了469例黑色素瘤患者样本的全基因组测序数据（图7A），并从FerrDB数据库中挖掘了与铁死亡相关的基因，以构建铁死亡敏感性评分（FPS）模型，从而可以根据黑色素瘤样本的分化状态区分其铁死亡敏感性。与黑色素瘤细胞数据一致，被标记为PRO的患者的黑色素瘤样本具有较低的FPS，而被标记为INV的患者的黑色素瘤样本具有较高的FPS（图7B）。与前面的体外分析结果一致（图2D），携带PRO黑色素瘤亚型的患者也表现出较高的APOE水平（APOE high），而INV表型的黑色素瘤则表现出较低的APOE水平（APOE low）（图7C）。尽管没有检测到GPX4表达的显著差异，但PRO黑色素瘤亚型的患者中存在高GPX4表达的趋势（图7D）。
研究APOE基因变异体与各自的FPS之间的关联并未发现显著差异（图7E）。然而，无论APOE基因变异体状态如何，其表达水平都与FPS呈负相关，样本中APOE水平越高，FPS越低，而相反，APOE高的黑色素瘤FPS较低（图7F至H）。此外，还发现APOE与黑色素瘤中GPX4表达之间存在趋势性正相关（图7I）。同样，FPS与GPX4表达之间的关联也显示出负趋势，从而验证了该评分的预测价值（图7J）。这项分析表明，无论APOE基因变异体如何，其高表达都可作为黑色素瘤中铁死亡抵抗的生物标志物。
图7 APOE基因的任何变异体均可作为是黑色素瘤中铁死亡抵抗的生物标志物
讨论
作者发现脂蛋白结合蛋白APOE是介导黑色素瘤表型间铁死亡抵抗的介质。通过整合体外、机制和体内数据，构建了一个模型，解释了APOE是如何抑制侵袭性黑色素瘤细胞中铁死亡的诱导和传播。
作者发现，APOE是胆固醇代谢途径的成员之一，是脂质代谢水平上区分黑色素瘤细胞状态的最主要基因之一，其表达会随着治疗压力下黑色素瘤状态的动态演变而变化。APOE-脂蛋白复合物已被证明会改变癌细胞和非癌细胞的脂质谱。然而，之前的研究并未涉及分泌的APOE在脂质过氧化驱动的铁死亡中的作用。本文的药理学分析揭示了APOE表达与黑色素瘤细胞的铁死亡易感性之间的强相关性。发现，高MITF/高APOE的PRO细胞与低MITF/低APOE的INV黑色素瘤细胞共存与对铁死亡的抵抗有关，这种抵抗可以通过添加APOE中和抗体逆转，从而揭示了不同黑色素瘤状态之间铁死亡抵抗的机制。
