MITF的O-GlcNAc糖基化修饰调节其自身活性和CDK4/6抑制剂在乳腺癌中的耐药性

靶向CDK4/6治疗乳腺癌已被证明最初是有效的，但之后往往会产生耐药性。在本文中，作者确定了小眼相关转录因子-A (MITF-A)是乳腺癌中CDK4/6抑制剂耐药的驱动因素，并表明MITF-A的活性是通过丝氨酸49位的O-GlcNAc糖基化介导的，促进其核输入。

细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK) 4/6是与D型细胞周期蛋白(如Cyclin D1)相关的丝氨酸/苏氨酸激酶，通过磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(RB)促进G1-S期转变，从而激活E2F转录因子，促进细胞周期进展。CDK4/6蛋白在多种癌症中经常上调和激活，使其成为治疗干预的有吸引力的靶点。因此，抑制CDK4/6已成为治疗癌症的一种有希望的策略。目前，三种CDK4/6抑制剂(CDK4/6i)， 帕博西尼、瑞博西利和阿贝西利已获得FDA批准，用于联合激素治疗转移性ER阳性、HER2阴性乳腺癌。尽管大多数患者最初对基于cdk4 /6i的治疗反应良好并延缓了病情进展，但耐药性的发展对有效的临床管理和长期生存构成了重大挑战。尽管最近的研究暗示了几种耐药机制，包括RB1或FAT1的突变，以及CDK4/6、CDK2、PI3K/AKT、RAS/ERK或STAT313-19的激活，但克服CDK4/6i耐药的治疗策略仍未满足临床需求。

MITF属于碱性-螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(bHLH-ZIP)家族，与TFEB、TFEC、TFE3共同构成MiT/TFE转录因子家族。这些MiT/TFE成员通过结合E-box基序来调节下游基因的表达，主要结合CACGTG的序列。MITF包含几种具有不同氨基末端的异构体，包括MITF-A、MITF-C、MITF-E /D、MITF-B、MITF-C、MITF-H和MITF-M。与其他MITF异构体不同，MITF- M是黑色素细胞和黑色素瘤细胞中表达的主要异构体，使其成为黑色素瘤的潜在生物标志物。值得注意的是，外源表达MITF-A主要导致细胞质定位，而外显子1B1b内保守残基Q62和L63的突变阻止了MITF-A27的细胞质保留。与细胞中的MITF-M相比，MITF-A的独特细胞定位意味着潜在的不同功能。到目前为止，与MITF-M相比，我们对癌细胞中MITF-A的调控机制的理解仍然有限。对于MITF-A和其他同种异构体在药物治疗和耐药性反应中的生理作用，我们所知的就更少了。

O-GlcNAc糖基化是一种独特的翻译后修饰，涉及通过O-GlcNAc转移酶(OGT)在靶蛋白的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基上添加单个O-链N-乙酰氨基葡萄糖(O-GlcNAc)糖片段，并由O-GlcNAase (OGA) 去除。O-GlcNAc糖基化失调与多种疾病有关，如糖尿病、神经退行性疾病和癌症。新出现的证据表明，异常的O-GlcNAc糖基化可能有助于肿瘤发生，促进耐药性，并通过改变蛋白质稳定性、定位或相互作用影响免疫反应。然而，O-GlcNAc信号在CDK4/6i耐药调控中的作用尚不清楚。

在本文中，作者进行了高通量筛选(qHTCS)，以鉴定能够克服乳腺癌细胞对CDK4/6i耐药的化合物。通过筛选，鉴定出一种MITF抑制剂ML329，它在体外和体内都能有效地恢复CDK4/6i耐药细胞对帕博西尼的敏感性。深入的机制分析表明，帕博西尼耐药乳腺癌细胞表现出MITF-A及其O-GlcNAc糖基化水平升高。值得注意的是，O-GlcNAc转移酶(OGT)对MITF-A第49丝氨酸(S49)的O-GlcNAc糖基化促进了MITF-A与输入蛋白α/β的相互作用，从而促进了核易位。在细胞核内，MITF-A减少帕博西尼诱导的衰老，最终驱动抵抗。在体外和体内，抑制MITF或其O-GlcNAc糖基化可使耐药细胞对帕博西尼增敏。总的来说，这些发现不仅揭示了MITF活性的创新调控机制及其在帕博西尼耐药中的作用，而且为有效管理帕博西尼耐药乳腺癌患者提供了潜在的治疗策略。

为了确定克服乳腺癌细胞帕博西尼耐药的有效治疗策略，使用帕博西尼连续治疗细胞，产生了两个帕博西尼耐药(PR)的乳腺癌细胞(MCF-7 PR和T-47D PR)。使用MCF-7和MCF-7 PR细胞我们使用MIPE和NPC小分子化合物文库进行了两轮qHTCS。从第一轮筛选中，确定了总共120种有效抑制MCF-7和MCF-7 PR细胞增殖的化合物。为了鉴定在MCF-7 PR细胞中与帕博西尼协同作用的化合物，选择了20种对MCF-7 PR细胞最有效的化合物与帕博西尼一起进行第二轮筛选(图1a)。在第二次筛选中，一种名为ML329的MITF抑制剂被发现是能够使MCF-7 PR细胞对帕博西尼重新敏感的首选药物之一(图1a)。为了验证ML329与帕博西尼的协同作用，将MCF-7 PR和T-47D PR细胞用ML329和帕博西尼联合处理72小时，并测量和计算细胞活力，结果，ML329与帕博西尼联合治疗抑制了两种耐药细胞的生长(图1b)。

为了测试联合治疗是否影响细胞周期进程，检测了耐药细胞的增殖。帕博西尼或ML329单独对MCF-7 PR细胞S期群体的影响很小，然而，ML329和帕博西尼联合治疗显著减少了MCF-7 PR细胞S期群体，这表明联合的药物治疗导致细胞周期在S期之前停滞(图1c)。与这些协同效应一致，联合治疗导致耐药细胞的集落形成能力大幅降低(图1d, e)，并使耐药MCF-7 PR肿瘤在体内对帕博西尼重新致敏(图1f, g)。总之，这些结果表明，MITF抑制剂ML329能够克服乳腺癌细胞对帕博西尼的耐药。

接下来，研究了MITF如何调节帕博西尼耐药性。鉴于MITF基因转录多种同种异构体，首先确定哪种MITF同种异构体在耐药细胞中富集。使用RT-PCR发现MITF-A是MCF-7 PR和T-47D PR细胞中普遍存在的同工异构体 (在下文将MITF- a称为MITF)。RNA-seq和Western blot分析都表明，与敏感细胞相比，耐药细胞中的MITF mRNA和蛋白表达显著增加(图2a, b)。细胞存活和集落形成实验表明，shRNA抑制MITF使耐药细胞对帕博西尼重新敏感(图2c)。与此一致的是，MITF缺失和帕博西尼治疗导致磷酸化Rb显著降低，同时与单独使用帕博西尼治疗相比，导致p21水平升高(图2d)，表明缺失MITF和帕博西尼一起导致耐药细胞的细胞周期停滞。在两种耐药细胞中，当ML329处理抑制MITF时，观察到类似的结果。与这些体外结果一致，shRNA抑制MITF使MCF-7 PR肿瘤在体内对帕博西尼重新敏感(图2e, f)。因此，MITF似乎在调节CDK4/6i耐药乳腺癌细胞对帕博西尼的耐药性中发挥重要作用。

由于MITF抑制和帕博西尼一起增加了p21的表达(图2)，p21是衰老的标志，假设MITF的消耗通过诱导衰老使PR细胞对帕博西尼重新敏感。事实上，抑制MITF导致MCF-7 PR细胞中衰老相关分泌表型(SASP)基因集显著富集(图2)。同时，RNA-seq分析显示，多个SASP基因(CXCL8、IL-6、CDKN1A、IGFBP7、CXCL12、SERPINE1、CCL-2、IGFBP2和MMP-10)的表达在MITF缺失的细胞中被高度诱导(图2h)。这些MITF缺失后的上调基因通过qPCR分析得到进一步证实(图2i)。同样，单独抑制MITF增加了衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)阳性染色的细胞数量;siRNA或ML329联合帕博西尼对MITF的抑制进一步增加了MCF-7 PR细胞中经历衰老的细胞群(图2j, k)。因此，MITF抑制通过激活耐药乳腺癌细胞的衰老来克服帕博西尼耐药性。

为了确定MITF如何调节帕博西尼耐药性，首先检查了MITF在敏感和耐药细胞中的亚细胞定位。与MITF主要驻留在细胞质中的敏感细胞不同，在两种耐药细胞中，MITF主要定位在细胞核中(图3a)。先前的研究报道MITF被mTORC1磷酸化，这种磷酸化导致MITF与14-3-3蛋白相互作用和细胞质保留。此外，在Torin1(一种mTORC1抑制剂)处理后，MITF与14-3-3的关联减弱。因此，与敏感细胞相比，MITF主要定位于耐药细胞的细胞核内。

为了探索耐药细胞中取代MITF细胞质保留的机制，进行了质谱分析，以鉴定MCF-7 PR细胞中MITF相关蛋白。发现OGT (O-linked N-acetylglucosamine, GlcNAc)转移酶显著富集(图3b)。Co-IP实验证实了内源性MITF和OGT之间的结合(图3c)。与此一致的是，OGT在体外直接O–GlcNAc糖基化MITF(图3d)。事实上，OGT的过表达或敲低分别显著增加或减少MITF的O–GlcNAc糖基化(图3e, f)，抑制OGT不影响MITF蛋白水平，但显著减少其在MCF-7 PR细胞中的核积累(图3g)。与这些数据一致，OGT消耗或OGT抑制剂OSMI-1治疗显著增加MITF与14-3-3之间的相互作用(图3h, i)。而在PUGNAc(一种OGA抑制剂)处理后，这种相互作用减少(图3j)。此外，用合成的一个含有MITF结合基序(E-box)的寡核苷酸，并用生物素标记，然后将其与细胞的核裂解物混合。结果表明，OGT缺失显著降低了核MITF与E-box DNA寡核苷酸的相互作用(图3k)。因此，OGT的消耗也使两种耐药细胞对帕博西尼敏感(图3i,m)。综上所述，，OGT直接与MITF相互作用并使其O-GlcNAc糖基化，从而阻止其与14-3-3相互作用，促进其核易位。

通过质谱分析发现，S49是最有可能的O-糖基化位点(图4a)。为了排除其他Ser/Thr位点的可能性，将S49以及其他潜在的O-GlcNAc酰化位点从丝氨酸突变为丙氨酸。发现只有在体外和体内的S49A突变体中，MITF的O-GlcNAc水平显著降低(图4b, c)，表明S49是MITF的主要O-GlcNAc位点。

接下来，研究S49 O-GlcNAc糖基化如何调节MITF活性。IP实验表明，与MITF WT相比，突变体MITF (S49A)表现出O-GlcNAc水平降低，与14-3-3的相互作用增加(图4d)。此外，核质分离和IF实验都表明，当OGT过表达增强O-GlcNAc糖基化时，WT MITF显示出比突变体核定位的增加(图4e, f)。与S49A突变体相比，WT MITF主要定位在细胞核内，因此导致核MITF与E-box DNA的相互作用增加(图4g)。MCF-7 PR细胞中MITF的缺失降低了MITF靶向基因CCND1、BIRC1和CCNB1的表达，通过表达WT MITF恢复了MITF靶向基因CCND1、BIRC1和CCNB1的表达(图4h)。上述结果表明，MITF S49位点的O-GlcNAc糖基化在其核定位和转录活性调控中起着关键作用。

接下来，探讨O-GlcNAc糖基化如何调节耐药细胞中MITF的核易位。之前的研究表明，输入蛋白α作为装载蛋白上的o-glcn酰化NLSs的读取器，从而促进这些装载蛋白的核易位。鉴于MITF-A定位于细胞质中，并且具有MITF-M中不存在的n端1B1b结构域，因此预计1B1b结构域可能在调节其细胞定位中发挥关键作用。使用NLS预测程序发现MITF在其n端包含两个假定的核定位信号(NLS)区域(图5a)。第一个NLS的缺失，阻碍了MCF-7 PR细胞中MITF的核积累(图5b)。

由于O-GlcN酰化位点S49位于第一个NLS内，假设MITF的O-GlcNAc糖基化通过影响其与输入蛋白α/β的相互作用来调节其核易位，为了确定哪些输入蛋白参与了MITF核易位的调节，使用siRNA在各种输入蛋白敲低的细胞中检测了IF对MITF的定位。输入蛋白α4、α7和α8的缺失似乎会损害MITF的核定位，这三种输入蛋白的敲低共同导致MITF核易位的显著减少(图5c)，这表明输入蛋白α4、α7和α8对MITF核易位至关重要。发现MCF-7 PR细胞中OGT的抑制显著降低了MITF与进口蛋白α4、α7、α8以及进口蛋白β的相互作用(图5d, e)。因此O-GlcN酰化通过影响MITF与输入蛋白α/β的关联来调节MITF的核易位。

为了进一步研究O–GlcNAc糖基化如何调节MITF与这些进口蛋白的相互作用，通过体外GST pull down实验，与未修饰的MITF相比，O-GlcNAc糖基化的MITF与这些进口蛋白的相互作用增强，这表明O-GlcNAc糖基化促进了这些进口蛋白对MITF NLS的识别。此外，与S49A突变体相比，WT MITF与importins α4、α7和α8的相互作用更强，PUGNAc处理增加O-GlcN酰化进一步增强了WT MITF与importins α4、α7和α8的关联(图5g- i)。上述结果强烈提示输入蛋白α/β作为传感器识别MITF的O-GlcNAc糖基化NLS并促进其核易位。

为了研究MITF如何调节乳腺癌细胞对帕博西尼的耐药性，在MCF-7和MCF-7 PR细胞中进行了MITF ChIP-seq。ChIP-seq在MCF-7 PR细胞的整个基因组中发现了3000多个MITF占据的位点，这些位点位于基因间和基因内区域(图6a)。相比之下，与敏感细胞相比，MITF在MCF-7 PR细胞中的结合强度相对较高(图6b)。通过ChIP-seq分析发现与MCF-7细胞相比，耐药细胞中MITF对四种SASP因子SERPINE1、IL-6、CSF1和PTGER2的启动子区域具有更强的亲和力(图6c)。这四种基因均有单独正调控衰老的报道。事实上，ChIP-qPCR表明，MITF特异性结合到这四个基因的启动子区域(以TYR基因作为阳性对照)(图6d)，并且MITF的缺失增加了这些基因的表达(图6e, f)。这些结果表明，MITF直接抑制这些SASP基因的表达，从而通过抑制抗性细胞的衰老而导致抗性。

为了确定MITF的O-GlcNAc糖基化是否调节这些SASP基因的表达，用WT MITF和S49A突变体回补MITF-缺失细胞，然后进行qPCR分析。在耐药细胞中，这些SASP基因的转录抑制仅在WT MITF重表达后恢复，而S49A突变体则没有恢复(图6g, h)。一致地，只有异位表达的WT MITF能够克服MITF敲低诱导的衰老，p21表达降低和SA-β-Gal标记证明了这一点，而在表达S49A突变体的细胞中没有观察到这种作用(图6i，图6i)。j).这些数据共同表明，在帕博西尼耐药细胞中，MITF S49位点的O-GlcNAc糖基化对于其调节衰老相关分泌组的活性至关重要。

接下来进行了临床研究，以调查是否在接受CDK4/6i治疗或对CDK4/6i产生耐药性的患者中观察到OGT-MITF轴升高。鉴于MITF水平升高导致帕博西尼耐药，帕博西尼治疗可能导致MITF表达升高。事实上，在帕博西尼治疗的MCF7细胞中，MITF mRNA和蛋白的表达水平都增加了(图7a)。接下来，采用ER阳性乳腺癌患者来源的异种移植(PDX)模型来评估延长帕博西尼治疗的效果。与未给药组相比，给帕博西尼治疗的PDX荷瘤小鼠也导致MITF表达水平大幅增加。因此，体外和体内研究均表明，帕博西尼治疗可刺激MITF表达。

接下来测试接受帕博西尼治疗的患者是否也激活MITF。为此分析了临床试验中获得的患者肿瘤的基因表达数据，包括雌激素受体阳性的乳腺癌患者在帕博西尼治疗前后接受肿瘤活检。与上述临床前研究结果一致，帕博西尼治疗显著提高了给药后16-20周(手术期)MITF mRNA的表达(图7b)。同时，与敏感患者相比，帕博西尼耐药患者的C1D15期MITF表达也显著升高(图7c)。为了进一步探索MITF在乳腺癌帕博西尼耐药调控中的作用，通过重叠与MITF相互作用的蛋白质(质谱分析)和已知与MITF功能相关的基因(PahtwayNet分析)创建了MITF特征基因集。值得注意的是，与治疗前相比，帕博西尼治疗后患者的MITF特征基因集显著丰富(图7d)

为了进一步验证MITF水平升高是否是调节乳腺癌帕博西尼耐药的关键因素，检测了一组PDX细胞系中MITF的表达，其中包括7个敏感样本和7个耐药样本。与敏感系相比，大多耐药PDX系中MITF、OGT和O-GlcNAc糖基化的表达水平升高(图7e)。值得注意的是，在同一PDX肿瘤中，由于长期在体内使用帕博西尼治疗，在对帕博西尼产生耐药性之前(ID# WHIM20，敏感)和之后(ID# WHIM20AR，耐药)，MITF表达水平和O-GlcNAc表达水平均有所增加，并且MITF主要位于耐药肿瘤的细胞核中。从帕博西尼耐药PDX WHIM37AR中开发了一种帕博西尼耐药类器官。利用该模型，检测了ML329与帕博西尼联合使用的疗效。如图7f所示，ML329在耐药模型中帕博西尼表现出了很强的协同作用。综上所述，这些来自临床样本的数据有力地证明了MITF在耐药肿瘤中上调，ML329可以在临床模型中克耐药。

接下来研究了MITF mRNA在耐药细胞中是如何调节的。在分析了临床试验的患者数据后，发现接受帕博西尼治疗的患者的CREB通路显著增加(图7g)。由于CREB直接调控MITF的转录，假设CREB途径可能调控耐药细胞中MITF mRNA的表达。事实上，CREB通路在帕博西尼耐药细胞系中富集(图7h, i)。此外，帕博西尼治疗导致p-CREB表达呈剂量依赖性增加，使用其特异性抑制剂666-15抑制CREB通路可显著降低MITF表达，并使耐药细胞对帕博西尼重新敏感(图7j -i)。因此，基于细胞的研究和临床证据表明，CREB依赖性通路在调节MITF介导的乳腺癌细胞帕博西尼耐药中起重要作用。

细胞周期蛋白依赖性激酶4和6 (CDK4/6)在细胞周期和癌症发展中起着关键作用。靶向CDK4/6已经证明了治疗乳腺癌的良好效果。然而，对CDK4/6抑制剂(CDK4/6i)的耐药性，如帕博西尼，在临床环境中仍然是一个重大挑战。通过高通量组合药物筛选和基因组测序，作者发现在帕博西尼耐药的乳腺癌细胞和肿瘤中，小眼相关转录因子(MITF)通过O-GlcNAc转移酶(OGT)的O-GlcNAc糖基化激活。从机制上说，MITF第49丝氨酸的O-GlcNAc糖基化增强了其与输入蛋白α/β的相互作用，从而促进其向细胞核的易位，从而抑制帕博西尼诱导的衰老。抑制MITF或其O-GlcNAc糖基化使耐药细胞对帕博西尼重新敏感。此外，临床研究证实，在帕博西尼耐药或接受帕博西尼治疗的患者的肿瘤中，MITF被激活。总的来说，这篇文章的研究阐明了调节帕博西尼耐药的机制，并为开发治疗cdk4 /6i耐药乳腺癌患者的治疗方法提供了临床证据。