乙酰化重编程MITF靶选择性和停留时间

转录因子区分与特定生物功能相关的不同类型结合位点的能力是发育和体内平衡中有效的基因调控的基础。这是如何实现的，人们知之甚少。小眼相关转录因子MITF是一种谱系存活癌基因，在黑素细胞发育和黑色素瘤中起着至关重要的作用。MITF抑制侵袭，重编程代谢，促进增殖和分化。MITF如何区分分化和增殖相关靶标尚不清楚。在这里，我们发现与许多转录因子相比，MITF表现出非常长的停留时间，这是由p300/CBP介导的MITF在K206处乙酰化所减少的。虽然K206乙酰化也会降低全基因组MITF DNA结合亲和力，但它会优先将DNA结合从分化相关的CATGTG基序转向CACGTG元件。结果揭示了乙酰化介导的开关抑制分化，并提供了人类K206Q MITF突变与Waardenburg综合征相关的机制解释。

支持发育和体内平衡的基因表达程序是由序列特异性转录因子的活性介导的，这些转录因子根据细胞内和细胞外的信号上调或下调其靶基因。由转录因子解释的信号的去调控可能导致与癌症等疾病相关的基因表达程序的改变。任何给定的转录因子在基因组环境中找到其目标元件的能力受到几个因素的影响，包括转录因子对DNA的亲和力，其丰富度，以及其同源识别元件是否可被核小体获取或阻断。重要的是，相同的转录因子可能调节具有根本不同生物学功能的不同靶基因，这意味着它们的靶向可能受到调节。转录因子如何区分不同的结合位点，以响应细胞外在或内在的线索是知之甚少。

小眼相关转录因子MITF在黑素细胞谱系的发育中起着关键作用，它控制着黑素母细胞的存活。因此，表达减少或突变可导致以色素沉着缺陷为特征的Waardenburg综合征。MITF在调节许多细胞功能中起着关键的协调作用，在黑色素瘤(一种起源于黑色素细胞的高度侵袭性皮肤癌)中，MITF被定义为一种谱系存活癌基因。除了上调一系列黑素细胞分化相关基因外，MITF还抑制侵袭和衰老，促进增殖、溶酶体生物发生和自噬，并重编程代谢。为了解释MITF在促进分化和增殖方面明显矛盾的作用，研究人员提出了一个MITF功能的变阻器模型，其中低水平的MITF活性与侵袭有关，中等水平的MITF活性与增殖有关，高水平的MITF活性驱动分化。然而，虽然这个模型是解释MITF在细胞生物学中的作用的一个有用的近似方法，但它并不能解释细胞增殖过程中如何阻止分化。MITF的靶序列特异性可能是线索之一。作为一种碱性螺旋环螺旋亮氨酸拉链(bHLH-LZ)转录因子，MITF识别6bp的E-box基序，其5’侧链T残基促进MITF识别并阻止MYC结合。MITF同时识别核心的CACGTG和CATGTG E-box元件，后者存在于分化相关基因如TYR和ABCB5中。MITF是否或如何区分这两类靶位点尚不清楚，但这一点很重要，因为阻止与CATGTG元件的结合原则上可能导致去分化。一个合理的模型是，含有CATGTG M-box基序的分化基因的稳定识别，而不是CACGTG E-box基序，被MITF对直接DNA结合残基的翻译后修饰所阻止，尽管迄今为止还没有发现这样的MITF修饰。

在黑色素瘤中，BRAF和NRAS的主要驱动突变导致MAPK通路的激活，ERK介导的MITF磷酸化已被各种报道控制其核输出、稳定性和乙酰转移酶CBP/p300的募集。此外，促增殖MAPK信号的增加通过促进p300/CBP活性而增加乙酰化。尽管目前尚不清楚MAPK信号失调是否或如何使MITF区分与增殖相关的靶标与驱动分化的靶标，但了解MITF活性如何被调节在黑色素瘤中尤为重要，因为不同的MITF活性与药物和免疫治疗耐药性有关。

在这里，我们发现与许多转录因子相比，MITF表现出非常长的停留时间，这是通过MITF K206的乙酰化而减少的。值得注意的是，乙酰基K206优先降低MITF与分化相关的CATGTG元件的dna结合亲和力，并将MITF与CACGTG元件的结合平衡转移。研究结果强调了MAPK信号激活阻止黑素细胞分化的机制，也可能解释了为什么人类K206Q突变会导致Waardenburg综合征。

与所有bHLH-LZ因子一样，MITF的DNA结合是由一个碱性区域介导的，该区域进行碱基特异性接触，从而决定靶序列的特异性，以及由碱性氨基酸与磷酸主链相互作用介导的非特异性接触。在考虑bHLH-LZ因子靶基因选择性调控的可能机制时，我们假设影响直接接触DNA的氨基酸的翻译后修饰可能在直接改变MITF靶特异性或通过影响MITF的DNA结合亲和力并间接调节其选择性结合不同元件的能力方面发挥重要作用。

与先前的观察结果一致，MITF可以被p300和CBP乙酰转移酶乙酰化，已建立的MAPK激活MITF的辅助因子，当MITF与CBP或p300共表达时，使用免疫沉淀GFP标记的MITF的泛抗乙酰赖氨酸抗体发现MITF乙酰化，而不是GFP乙酰化(图1a)。GCN5共表达时未检测到明显的乙酰化。免疫沉淀MITF的质谱分析显示K33, K91, K206和K243四个残基乙酰化(图1b)，但在本实验或其他实验中未检测到这些位点上的其他修饰(例如甲基化)。

在鉴定的乙酰化残基中，只有K206位于决定MITF序列特异性DNA结合活性的基本区域。该残基在物种之间和bHLH-LZ转录因子MITF亚家族的所有成员(包括TFEB和TFE3)中高度保守(图1c)，但在其他bHLH-LZ蛋白(如USF1、MYC或MAX)中不存在，这表明它可能在MITF亚家族中发挥独特的调节作用。此外，DNA-MITF DNA结合域(DBD)共晶结构表明K206在碱性区域内与磷酸主链接触(图1d)。值得注意的是，在Waardenburg综合征243型家族中发现了一种被广泛接受为乙酰化模拟物的杂合赖氨酸到谷氨酰胺取代(K206Q)，其特征是内耳黑色素细胞缺陷导致色素沉着异常和听力丧失。总的来说，这些观察结果表明K206的乙酰化可能在调节MITF功能中发挥关键作用。

图1:MITF在K206位点的乙酰化

A.  免疫沉淀GFP标记的MITF与CBP、p300或GCN5共表达，使用抗乙酰赖氨酸或抗GFP抗体在Phoenix-AMPHO细胞中进行Western blot。AcK;Acetyl-Lysine。该实验重复3次，结果相似。

B.   本研究中检测到的MITF乙酰化位点(红色)和AcK206(蓝色)的示意图。质谱分析得到的乙酰化肽如下所示，磷酸化位点和p300结合基序如上所示。

C.  bHLH-LZ家族相关成员碱基区氨基酸比对。黄色表示高度保守的残基，红色表示仅在MiT亚家族中保守的赖氨酸(对应于MITF中的K206)。

D.  MITF-DBDDNA共晶结构的描述突出了k206 -磷酸盐骨架相互作用。MITF单体用红色或绿色表示，DNA用蓝色表示

为了验证质谱分析结果，我们生成了一种抗乙酰基K206抗体，并测试了其对一系列MITF肽的活性。结果显示，该抗体具有高度选择性，对含有乙酰基K206的肽具有很强的识别能力，而对含有乙酰基K33的肽的识别能力至少低2.5倍(图2a)。没有检测到对非乙酰基K206的活性，也没有检测到对来自MITF或组蛋白H3的其他乙酰基或非乙酰基对照肽的活性。为了确认MITF在K206处的乙酰化，我们免疫沉淀了与CBP或p300共表达的HA-MITF，有或没有选择性p300/CBP抑制剂A485。结果显示，在输入对照中，p300或CBP增加了泛乙酰赖氨酸抗体检测到的全局乙酰化，而A485则降低了全局乙酰化(图2b，上面)。在使用抗HA抗体对MITF进行免疫沉淀后，用抗乙酰化MITF K206抗体探测发现，在A485存在的情况下，MITF在该位点的乙酰化程度降低(图2b，下面)。从IGR37人黑色素瘤细胞系中免疫沉淀MITF，以表达可诱导的p300和HA-MITF(图2c)，以部分维持其相对表达水平，结果显示，在使用多西环素诱导后，乙酰化K206 MITF增加(图2d)，证实了p300在MITF乙酰化中的作用。我们还能够使用抗MITF抗体和抗HA抗体作为同型对照，在免疫沉淀后检测内源性MITF的乙酰化(图2e)。虽然抗HA不能像预期的那样免疫沉淀内源性MITF，但抗MITF抗体将MITF拉下(左下图)，当与抗乙酰基K206抗体(右下图)进行探针时，发现MITF在该残基上被乙酰化。由于p300乙酰基转移酶活性由BRAF或NRAS下游的MAPK信号激活，我们还使用MEK抑制剂U0126处理或未处理的细胞的HA-MITF重复了免疫沉淀实验。结果表明，当MAPK通路被抑制时，MITF在K206位点的乙酰化减少(图2f)。这是不可能发生的，因为先前描述的MAPK信号在S73或S409位点磷酸化MITF，因为任何一个位点突变为丙氨酸单独或联合都不能阻止p300或CBP通过抗乙酰赖氨酸抗体检测到MITF乙酰化(图2g)。最后，我们使用内源性水平稳定表达HIS标记MITF的501mel细胞系重复实验。这使得使用6 M盐酸胍溶解细胞蛋白后，镍珠上的MITF可以直接纯化，并避免了先前观察到的内源性MITF从细胞核中提取能力差的问题。在本实验中，使用200 nM TPA增加MITF的表达，此前发现TPA可促进黑色素生成。结果(图2h)证实，在没有异位p300或CBP的情况下，MITF K206发生乙酰化。

图2 |确认MITF在K206位点乙酰化。

A. 由14个氨基酸组成的肽阵列，含有指示的乙酰化或非乙酰化残基，用抗乙酰基K206抗体检测，粉色方框中为AcK206。基于化学发光信号对信号进行量化。

B-H Western blots检测指示抗体。

B. HA-MITF在Phoenix-AMPHO细胞中单独表达或与CBP或p300+/−20nM A485共表达，抗乙酰赖氨酸或抗HA抗体在抗HA免疫沉淀之前(上图)或之后(下图)。实验进行了一次，但重复使用A485阻断TPA诱导的MITF乙酰化，结果相似。

C. IGR37细胞表达强力霉素诱导的FLAG标记的MITF和HA标记的p300，使用指定量的强力霉素诱导16小时或72小时。实验重复两次，结果相似。

D. 表达强力霉素诱导的p300和HA-MITF的IGR37细胞免疫沉淀HA标记MITF。实验执行一次。

E. 使用抗MITF抗体或抗HA抗体作为同型抗体对照，从501mel细胞中免疫沉淀内源性MITF，并用指示抗体进行探针检测。输入显示在左边。FT表示“流动”;IP表示免疫沉淀。实验执行一次。

F. 用10μM U0126处理或未处理的501mel细胞中HA标记的MITF的免疫沉淀输入物和免疫沉淀蛋白使用指定的抗体进行免疫印迹，抗ERK作为上样对照。实验重复了两次，结果相似。

G. 在PhoenixAMPHO细胞中表达与p300(左)或CBP(右)共表达的FLAG标记的WT或突变型MITF，并用抗乙酰赖氨酸或抗MITF抗体进行检测。实验只做了一次，但使用S73A和S73A、S69A突变体重复实验，结果相似。

H. 来自501mel细胞的HIS标记MITF经过工程改造，表达异位诱导的6xHIS标记MITF，用或不加200 nM TPA处理6小时，用尿素溶解细胞的镍珠纯化，并用抗乙酰K206或抗MITF抗体进行探针检测。显示了两个重复，纯化的非his标记的MITF (ΔHis)作为阴性对照。

MAPK依赖性MITF在K206位点的乙酰化可能具有功能性后果，部分原因是人类K206Q杂合子的色素沉着缺陷。由于K206在DNA共晶结构中形成磷酸主链接触，我们想知道K206R非乙酰化突变或K206Q模拟组成乙酰化的突变是否会影响MITF结合DNA的能力。为了做到这一点，我们最初使用单分子跟踪(SMT)分析来检查MITF WT和K206突变动态及其在活细胞中的染色质关联。通过用JF549(一种明亮的光稳定荧光配体)在亚饱和浓度下将MITF融合到HALO标签上，我们可以估计结合事件的持续时间，固定MITF与染色质结合的比例，以及蛋白质的扩散特性。因此，我们建立了一个501mel的人类黑色素瘤细胞系，稳定表达强力霉素诱导的halo标记MITF WT和K206突变体(图3a)。我们还包括未偶联的HALO标签作为额外的对照，并且在一些实验中还使用了非DNA结合的MITF突变体(Δbasic)，该突变体缺乏使DNA直接接触的基本区域，因此我们可以确定直接DNA结合与非DNA关联的相对贡献，例如，通过蛋白质-蛋白质相互作用介导。在所有构建中，我们还包括了SV40 T抗原核定位信号，因为对MITF基本区域的扰动会影响核的输入。然后，我们调整强力霉素浓度，以诱导具有HALO标记的MITF WT和K206突变体在相当水平上的表达(图3b)，并在两种不同的制度下对单个MITF分子进行成像。首先，为了评估K206乙酰化如何影响MITF的迁移，我们使用5毫秒激光曝光以100 fps的速度获取了电影。根据位移分布对单分子轨迹进行分析(图3c)，这与前面描述的三组分扩散模型相吻合，其中最慢的组分描述固定分子(在染色质或其他核结构上)，另外两个组分代表扩散的MITF，可能因瞬态相互作用而减慢(比获取帧速率更快)。WT MITF(图3c，左上)显示的固定化分子比未共轭的HALO-标签(图3c，右下;中位数分别为44%和13%)，扩散系数中位数为0.04 μm2/s，与先前对染色质紧密结合的蛋白质(如组蛋白)的测量结果相当。WT MITF中有34%的分子处于慢扩散状态，中位数Dslow = 0.46 μm2/s，其余分子处于快速扩散状态，中位数Dslow=3.4 μm2/s(图3c, d)。与WT MITF相比，K206R突变体(图3c，左下)的结合分数(图3d)和扩散系数(图3d)均无显著降低。相反，MITF K206Q突变体表现出明显降低的结合分数(图3d)。值得注意的是，在表达非常低内源性MITF (IGR39)的细胞系中，使用诱导表达的HALO-MITF WT和突变体重复相同的实验，再现了MITF High 501mel细胞中获得的结果。这包括与WT相比，观察到MITF K206Q突变体的结合分数下降，这一次还伴随着MITF扩散系数的增加。总之，这些结果强调了MITF K206Q突变体在活细胞细胞核中通常比MITF-WT更具移动性。

为了更好地表征MITF结合动力学，我们接下来以2 fps的速度收集单分子电影，使用200 ms的激光照射来模糊扩散的分子56，并量化固定分子的停留时间，包括非DNA结合Δbasic突变体(图3a)作为额外的对照。由于长时间的测量可能受到光漂白的影响，我们使用组蛋白H2B-Halo标签作为进一步的控制，因为大量的H2B稳定地结合到染色质中，然后使用观察到的H2B-Halo标签最慢的衰减率来校正MITF停留时间，如最近所述。在501mel细胞系中获得的结果如图3e所示，持续时间超过100s的结合事件定量如图3f(左图)所示，结合分子的平均存活时间如图3f(右图)所示。这些数据使我们能够得出几个结论。首先，根据光漂白校正的结果，超过40%的结合WT MITF表现出超过100秒的长停留时间，平均存活时间为46秒。其次，这种长寿命结合在K206R突变体中仅略有下降(平均存活时间为42秒，40%的分子停留时间超过100秒)，而在K206Q突变体中则进一步下降(平均存活时间为36秒，33%的分子停留时间超过100秒)。第三，Δbasic DNA结合MITF突变体比WT MITF和MITF- k206突变体表现出更多的瞬时固定化事件，尽管比例(约9%)的蛋白质仍然表现出超过100秒的停留时间。这表明大多数稳定结合的MITF可能通过基本区与DNA相互作用，但基本区外的残基可能参与蛋白质-蛋白质相互作用，从而贡献了长时间的停留时间。值得注意的是，另一个bHLH-LZ转录因子USF1以及一个不相关的转录因子p53与染色质的分离速度比WT MITF快得多，这表明MITF在体内与DNA的紧密结合可能是MITF的一个特殊特性。这与先前的观察结果一致，表明与USF1不同，MITF即使在非常恶劣的条件下也很难从细胞核中提取。

在MITF低的IGR39细胞系中重复停留时间测量，大致概括了这些观察结果。在这种情况下，WT MITF的平均存活时间较长，约为45秒，与K206R突变体的存活时间相似，也与在MITFHigh 501mel细胞系中使用WT MITF获得的存活时间相似。对于乙酰化模拟MITF K206Q突变体，平均存活时间再次显著缩短至33秒左右。因此，K206Q突变体在其结合位点停留的时间更短，而K206R突变体的核动力学更类似于WT MITF。

图3 | HALO标记MITF的活细胞单分子跟踪。

A. HALO标记的MITF表达载体。NLS;核定位序列。

B. 使用多西环素或不使用多西环素处理的501mel细胞中，对HALO标记的MITF WT和突变体进行Western blot，以确保类似的表达水平，并与图中所示的SMT分析并行进行。白细胞素是一种负荷控制。Dox在501mel细胞中诱导HALO-MITF的实验已经独立进行了至少3次，结果相似。

C. 使用斐济/ ImageJ插件TrackMate提取以100帧/秒的速度收集的单分子跟踪电影，并根据连续帧之间的单分子位移分布进行分析，然后使用三组件模型(一个不移动组件和两个扩散组件)进行拟合，以生成Halo标签, WT MITF和突变体的定量估计。

D. 使用WT和K206 HALO标记的MITF对SMT中处于束缚态和慢态的分子比例以及各自的扩散系数进行定量估计。每个点代表一个单元格，蓝线代表中位数，框限代表上下四分位数，晶须在Q1−1.5IQR和Q3+1.5IQR之间延伸，其中IQR是四分位数范围。对于Halo标签、WT MITF、K206R和K206Q突变体，Nreplicates=2;Ncells = 19,30;30;30;Njumps: 130387;245200;210929;172286. 统计检验:非参数Kruskal-Wallis(双侧)。

E. 获取较慢的胶片(帧率2 fps，激光曝光200 ms)，计算固定MITF分子的停留时间分布，然后使用H2B-Halo标签上收集的数据进行光漂白校正(见方法)。

F. 结合分子的停留时间超过100秒(左)和(限制的)平均存活时间(右)的比例。Nreplicates= 2;Ncells = 30,30,30,30,30,35和36,Nmolecules = 3836;3429;3219;1185;3809;1225分别用于WT MITF、K206R、K206Q、Δbasic、USF1和p53;采用刀法计算误差条(SEM)(见方法);在调整强力霉素浓度以确保相似的MITF表达水平后，每个SMT实验至少进行两次。

为了直接确定K206乙酰化对MITF DNA结合的影响，我们细菌表达了MITF DNA结合和二聚化结构域(DBD)，并将纯化后的蛋白用于体外DNA结合实验。一种改良的细菌表达系统，在K206位置引入琥珀色终止密码子，使K206的乙酰化能够被遗传编码，使我们能够表达和纯化在K206处特异性乙酰化的MITF DBD。我们还表达并纯化了野生型(WT) MITF DBD，一个不可乙酰化的K206R突变体，以及waardenburg相关的K206Q突变体，该突变体有望通过破坏磷酸盐主链接触来模拟乙酰化。然后将它们与三种荧光标记的寡核苷酸一起用于荧光各向异性测定。它们包含完整的回文8bpTCACGTGA结合基序，称为CLEAR-box，与除色素沉着相关的基因外的其他基因相关;与黑色素细胞特异性酪氨酸酶(TYR)增强子相关的TCATGTGA元件，保留了MITF结合重要的侧翼5'T和3'A碱基;以及在分化相关启动子中发现的TCATGTGT M-box序列。增加纯化的WT、K206R和K206Q突变体和AcK206蛋白的数量，使我们能够确定每种元素的相对亲和力。结合曲线示例如图4a、b所示，推导出的相对亲和度总结如图4c所示。细菌表达的未乙酰化WT MITF在CLEAR-box和TYR增强子之间的亲和力仅适度降低，但对启动子M-box基序列的亲和力降低了10倍以上。使用不可乙酰化的K206R突变体获得了类似的结果。相比之下，Ac-K206 MITF清楚地区分了两个序列元件:与未乙酰化的WT蛋白相比，与TCATGTGA CLEAR-box的结合减少了约3倍，但使用TYR TCATGTGA基序与M-box的结合减少了5倍，与CLEAR box的结合减少了20倍。乙酰化对MITF DNA结合的影响在K206Q突变体中得到了很大程度的再现。这些结果表明，虽然MITF K206Q的乙酰化适度地减少了与CLEAR box的结合，但与分化相关启动子中存在的M-box的结合受到了更严重的影响。因此，K206的修饰可以潜在地使MITF区分这两类调节元件。K206Q突变体的DNA结合亲和力降低，反映在SMT分析确定的停留时间缩短上，因此可能解释了与该突变体相关的瓦尔登堡病。

 图4:K206的乙酰化降低了与M-box的结合。

A.B.利用荧光各向异性测定细菌表达和纯化的MITF WT和突变体DNA结合域的DNA结合亲和力。每个荧光素标记的寡核苷酸与MITF WT和突变体的代表性滴定曲线。报告的各向异性值是三次测量的平均值，从中减去与自由荧光探针各向异性相对应的基线。(*)基于非配对双尾检验的p < 0.05，误差条表示每个测量点计算的SD。

A. 为了最优地比较每个MITF变体对本文研究的三种不同DNA基序的亲和力，给出了图表。

B. 该图所示的曲线对应于MITF WT和乙酰化MITF对两个DNA基序的滴定。

C. 定量测定MITF变异的DNA结合亲和力，以KD (nM)表示。KD值对应于三个独立测量的平均值，+/−误差数代表标准差。

由于Ac-K206 MITF表现出降低的DNA结合亲和力，我们预计Waardenburg相关的K206Q突变将在黑素细胞发育中表现出缺陷。为了验证这一点，我们使用了斑马鱼实验，其中使用MITF WT或突变体来补充MITF缺失的斑马鱼，该斑马鱼缺乏所有神经嵴源性黑色素细胞。为此，从斑马鱼mitfa启动子中瞬时表达WT或K206突变体(鱼中的K201) MITF(图5a)，并在受精后5天评估对幼鱼黑素细胞数量的影响。结果(图5b, c)显示，WT和K201R突变体MITF弥补了内源性MITF的缺失，并产生了正常的黑素细胞模式，而K201Q突变体未能有效地弥补MITF的缺失，这与它具有缺陷的基因表达调节能力相一致。

图5 | K206影响黑素细胞的发育。

A.   人类和斑马鱼MITF氨基酸序列比对显示K206(人类)和K201(鱼类)的保守性。将鱼mitfa编码序列置于鱼mitfa启动子的控制下。

B.    利用MITF WT和K201(人类MITF中的K206)突变体对神经嵴mitfa-null的斑马鱼进行互补。

C.   在斑马鱼补体实验中，使用抖动图定量黑素细胞的数量，图中的点代表每个至少有1个黑素细胞的获救胚胎中的黑素细胞数量，该线显示平均+/−SEM。统计检验:KruskalWallis检验和Dunn多重比较检验。从总共7项实验中获得数据，其中共分析了411条鱼:20项用于空病媒控制;WT-MITF为132;201用于MITF K201R;MITF K201Q为127。源数据在补充源数据文件中提供。

迄今为止的研究结果表明，MITF的乙酰化会导致DNA结合总体减少，但与分化相关基因的结合将受到更大的影响。由于K206Q突变体的结合在体外准确地模拟了乙酰化K206蛋白的结合，我们接下来建立了人类501mel黑色素瘤细胞，其中HA标记的WT MITF以及K206Q和K206R突变体通过强力霉素诱导的启动子稳定表达。通过使用诱导启动子，我们能够仔细地滴定MITF WT和突变体的表达水平(图6a)。由于异位HA表位标记的MITF在SDS PAGE分析时迁移较慢，我们确定20 ng多西环素诱导的异位WT和突变MITF水平与未诱导的501mel细胞中的内源性蛋白相似。使用这些可诱导的MITF细胞系，我们对WT和每个突变体在0、20和100 ng强力霉素下进行了重复的ChIP-seq实验，得到的重复结果显示出高度的一致性。

正如预期的那样，WT MITF ChIP的读取密度显示，增加多西环素水平导致MITF DNA结合增加，这反映在峰值得分增加(图6b，左图)，称为峰的总数增加，并且重复之间的一致性相应增加。这反映在已知是MITF靶点的单个基因的结合上(图6c，左面)。例如，在0ng强力霉素时，当HA标记的MITF无法通过western blotting检测到时(图6a)，在分别含有TCATGTGC或BCACGTGA MITF结合位点的BLOC1S和MLANA基因上观察到高度特异性的ChIP信号，但在含有TCATGTGC位点的DCT上不容易识别出峰值。随着使用20ng或100ng强力霉素增加MITF水平，在BLOC1S和MLANA处的峰值评分增加，并且在DCT特异性结合处变得明显。正如其他转录因子所示，最有可能的是核小体定位或协同辅助因子对MITF在任何位点的结合亲和力都有显著的基因特异性贡献。然而，结果表明，增加MITF水平，例如在黑素细胞分化过程中对黑素皮质素1受体信号传导下游cAMP信号的反应中观察到的，允许结合分化相关基因，如DCT，而在较低水平的MITF中未检测到。

接下来，我们比较了WT MITF与不可乙酰化的K206R突变体和Waardenburg相关的K206Q乙酰化模拟物的结合。虽然峰高低于WT MITF，但在最低浓度的MITF下检测到K206R突变体与BLOC1S或MLANA等基因的结合，而在DCT上则没有(图6c，中间)。在20ng强力霉素下，当异位MITF表达到与内源蛋白相似的水平时，许多基因的K206R结合比WT更好(图6c, d)，与WT MITF的乙酰化比例一致(图1和图2)。相比之下，K206Q突变体表现出整体DNA结合减少，这与在细胞中停留时间减少(图3e,f)和较低的体外DNA结合亲和力(图4)相一致。K206Q突变体在BLOC1S和MLANA上检测到结合，在20ng多西环素下，峰值高度约为WT的30%，与分化相关基因DCT(图6c，下图)或PMEL几乎没有检测到任何浓度的强力霉素高于背景。考虑到在20ng时，WT MITF与多西环素的结合介于不可乙酰化的K243R突变体和乙酰化模拟的K243Q突变体之间，我们的结果与使用抗乙酰化K206抗体观察到的501mel细胞中显著比例的MITF被乙酰化一致(图2e)。

DNA结合亲和力测量(图4)表明，K206Q突变体的乙酰基K206 MITF可以区分CACGTG基序和亲和力较低的CATGTG E-box。为了确定K206Q和K206R突变体在细胞中对这些基序的识别是否存在差异，我们在使用0、20或100 ng强力霉素诱导后鉴定了峰下的序列。WT蛋白的结果表明，随着MITF水平的增加，识别的低亲和力结合位点的比例增加，从典型的TCACGTGA基序向TCACGTGB或TCATGTGA元件转移(图6e)。正如预期的那样，K206R突变体的行为与WT蛋白相似，尽管在0ng强力霉素时，结合的TCACGTGA基序的比例更大。相比之下，尽管在K206Q突变体水平的增加上观察到很大程度上类似的变化，但绝大多数被识别的位点是TCACGTGA。这些观察结果在分析WT和突变体在20ng强力霉素处的MITF峰下的全局一致性时得到证实，表明WT和K206R突变体的一致性反映了CACGTG和CATGTG核心E-box基元的混合，而K206Q突变体的一致性仅限于高亲和力的CACGTG元件(图6f)。通过对峰值得分与基元发生率的分析得出了类似的结果，表明WT和K206R突变体的行为相似，尽管K206R突变体的结合程度比WT MITF更好(图6g)。同样，K206Q突变体结合的位点较少，而结合的位点主要是CACGTG基序。

图6:K206控制MITF全基因组分布。

A. Western blot检测501mel黑色素瘤细胞系，经指定浓度的强力霉素诱导后，稳定表达HA标记的强力霉素诱导的MITF WT和K206突变体。Dox诱导MITF具有高度可重复性，并已独立重复了至少5次。

B. MITF WT和K206突变体的热图可视化使用指示浓度的强力霉素读取HA-MITF ChIP-seq得出的密度。输入控件显示在右侧。

C. UCSC基因组浏览器截图的HA-MITF WT和突变体在不同浓度的强力霉素下的ChIP-seq图谱如图所示。R1和R2表示两个独立的重复。

D. 一组溶酶体或色素沉着基因的ChIP-seq峰值分数显示了使用20ng强力霉素诱导的MITF WT和突变体。

E. 在0、20和100 ng强力霉素下表达的MITF WT和突变体的ChIP峰与指示基序的相对比率。

F. 在MITF WT和突变体的ChIP峰下检测到一致的基元。

G. 比较MITF WT和突变体的ChIP-seq峰值得分与相对基序发生率移动平均值(100个峰窗)的散点图。为了便于直观比较，采用广义加性模型对数据点进行光滑线拟合。95%置信区间在拟合的平滑线周围以灰色阴影表示。

转录因子在建立和维持特定的细胞表型中起着关键作用。要做到这一点，他们必须识别出决定细胞身份的基因中特定的结合位点。在黑色素瘤中，MITF参与调节许多生物过程，包括代谢重编程，促进存活、增殖、分化和自噬，抑制侵袭和衰老。目前的MITF功能变阻器模型表明，不同水平的MITF表达或活性使细胞采用不同的表型。该模型得到了以下观察结果的支持:斑马鱼中使用温度敏感突变体的MITF功能减少导致分化的黑色素细胞重新进入细胞周期，并且MITF独立状态表征了残留疾病中的持续状态，类似于对BRAFi的反应所产生的状态。我们的研究结果表明，与分化基因启动子相关的CATGTG M-box基序是亲和力较低的结合位点，而CACGTG E-box基序具有较高的亲和力，因此可以在较低的蛋白质水平上被识别。然而，除了MITF水平外，MITF控制其靶基因的能力也会受到翻译后修饰的调节。

值得注意的是，我们发现CBP/p300介导的K206乙酰化抑制了MITF结合DNA的能力。该残基位于碱基区域内，介导碱基特异性接触以提供序列特异性结合，以及磷酸盐骨架相互作用，增加DNA结合亲和力而不直接影响碱基识别。然而，虽然K206的乙酰化使其与磷酸盐主链接触，适度降低了对CACGTG E-box或TCACGTGA增强元件的亲和力，但它大大降低了与CATGTG M-box基序的结合。通过K206Q突变体和SMT分析，无论内源性MITF是否存在，体外细胞中Ac-K206 DNA结合的减少都得到了证实。值得注意的是，使用ChIPseq在体内反映了体外结合结果，K206Q突变体对CATGTG基序的识别在很大程度上被阻断，而与含有CACGTG元件的基因的结合保留，尽管峰高降低。K206乙酰化区分CATGTG和CACGTG元件的能力表明，MITF乙酰化的调节可能有助于确定MITF的靶基因库。与ERK上游BRAF或NRAS的激活促进黑素细胞增殖和去分化一致，MITF与CBP/p300的相互作用是由ERK介导的MITF34磷酸化促进的，而CBP/p300乙酰转移酶活性是由MAPK信号传导刺激的。然而，CBP/p300的活性也被SIRT165介导的去乙酰化抑制，SIRT165是一个MITF激活的靶基因，这表明CBP/p300对MITF乙酰化的调节可能受到一个自调节反馈回路的影响。

我们的研究结果还表明，MITF可能代表了一类独特的转录因子，它通过DNA和非DNA相互作用在细胞核内紧密结合，超过40%的分子显示出超过100秒的停留时间。对于SMT确定的典型停留时间为几秒的转录因子来说，这是非常长的时间。已知的例外是成纤维细胞血清刺激后的血清反应因子SRF(τres1-4min)，多梳抑制复合体1(PRC1)(τres>100s)和CTCF (τres约60-120s)。MITF的长停留时间与MITF DNA结合和二聚化结构域的结构无关，也与识别的E-box基序无关，因为USF1也含有bHLH-LZ基序，可以与MITF72结合相同的位点，很容易从细胞核中提取出来，并且结合的停留时间分布与K206Q MITF突变体相似。因此，看起来很可能是蛋白质与蛋白质的相互作用对MITF的停留时间做出了重大贡献。考虑到CTCF通过结合边界元件在确定和稳定染色质拓扑结构中的作用，以及PRC1在三维染色质组织和细胞身份控制中的作用，MITF与核结构的紧密关联和长停留时间在确定黑素细胞谱系的染色质构象中反映出类似的作用是合理的。这与使用体内竞争试验对神经元谱系决定因子Ascl1停留时间的观察结果是一致的。这些作者认为，Ascl1在非分裂细胞中的长时间停留(约为数小时)可能对确保细胞的分化状态很重要，而在增殖细胞中，Ascl1的停留时间会减少，从而在转录反应中产生灵活性。在这方面，我们注意到p300/CBP的乙酰化是由促增殖的MAPK信号控制的。因此，在MAPK信号减少的非分裂分化细胞中，MITF的长停留时间可能会进一步增加。此外，如果内源性MITF的停留时间过长，则其被异位MITF表达取代的能力会降低。如果是这样的话，这也许可以解释当MITF的耗尽导致其靶基因的表达减少时，异位MITF不能调节相同的基因的观察结果。

最后，除了解读K206乙酰化如何影响MITF靶标特异性外，我们的结果也可能与理解Waardenburg病的遗传学有关。在这方面，很明显，Waardenburg相关的K206Q突变通过模仿K206乙酰化导致MITF DNA停留时间减少，从而降低促进与MITF相关的生物学功能的能力，从而导致与该疾病相关的发育缺陷。

总之，我们的研究结果强调了MITF的翻译后修饰调节其结合靶标的能力，从而控制其协调支持黑素细胞和黑色素瘤增殖和分化的基因表达程序的能力的机制。