泛素系统对线粒体输入的动态调控

线粒体通过外膜(TOM)复合体的转位酶转运前体蛋白，从细胞质中输入几乎整个蛋白质组。在这里，我们展示了泛素系统对线粒体输入的动态调节。线粒体去泛素酶(DUB) USP30的急性药物抑制或基因消融触发通常定位于线粒体内的ub底物的积累。在USP30基因敲除(KO)细胞中，线粒体对USP30底物的输入受损，表明去泛素化促进了有效的输入。在USP30的上游，E3连接酶March5泛素化线粒体蛋白，其最终输入依赖于USP30。在USP30 KOs中，外源的March5表达诱导非输入易位中间体的积累，这些中间体被蛋白酶体降解。在USP30 KO小鼠中，TOM亚基在多个组织中的丰度降低。综上所述，这些数据强调了蛋白质进入亚细胞区室是如何通过E3连接酶和DUB机制的泛素化和去泛素化来调节的。

线粒体是ATP生成、钙缓冲和代谢稳态的重要细胞器。大多数线粒体蛋白由核基因编码，并在线粒体输入之前作为细胞质核糖体的前体翻译。前体蛋白通过嵌入线粒体表面的外膜(TOM)复合体的转座酶进入线粒体。前体蛋白内的线粒体靶向序列被TOM20和TOM70受体识别，引导底物进入TOM40通道。TOM20识别n端序列，而TOM70识别来自较大的疏水线粒体蛋白的内部靶向序列。在通过TOM40通道易位后，相互连接的分选机器进一步将蛋白质引导到线粒体亚室中。

线粒体输入受细胞器功能与细胞代谢耦合的多种机制调控。例如，输入效率可以通过代谢物、蛋白质相互作用和前置序列磷酸化双向调节，从而促进或损害TOM受体对底物的识别。类似地，TOM受体可以磷酸化，以响应养分供应和能量需求，在全范围内调整输入。除了磷酸化，其他翻译后修饰在线粒体输入中的作用尚不清楚。

除了其重要的输入作用外，TOM复合体还作为线粒体应激传感器，向细胞质和细胞核传递信号以维持体内平衡。当输入受损时，某些线粒体蛋白被重定向到细胞核以诱导保护性转录程序。非输入线粒体前体的积累也会引起胞质应激反应，从而下调整体蛋白质合成并上调26S蛋白酶体。在酵母中，未导入蛋白在TOM复合体上的积累会招募ATP酶Msp1和Cdc48来促进它们的去除。此外，TOM复合体既可以作为线粒体损伤的传感器，也可以作为将生化信号传递给线粒体自噬机制以降解受损线粒体的平台。

在这里，我们展示了连接在线粒体表面的两个泛素(Ub)系统酶，E3 Ub连接酶March5和去泛素酶USP30，相互修饰TOM复合物的输入底物。我们的研究结果揭示了线粒体输入的动态调节，通过协调修饰底物之前和过程中的输入。

1、USP30去泛素化通常定位于线粒体内的蛋白质

USP30是一种去泛素酶，可抵抗帕金森病相关E3连接酶Parkin对受损线粒体上底物的泛素化。我们发现，即使在基础条件下(没有线粒体损伤)，USP30也显示出活性，其活性不受线粒体去极化的调节(图1A和1B)。为了检测USP30的功能，我们用USP30抑制剂(USP30i;图1C)。我们首先通过测量已知USP30底物TOM20 (Ub-Tom20;参见STAR方法)。USP30i增加了Ub-TOM20, EC50为2.45 mM(图1D和1E)。在类似的实验中，USP30基因敲除(KOs)在线粒体去极化时积累UbTOM20(图S1A)。在随后的研究中，我们使用最低浓度的USP30i诱导最大的Ub-TOM20(图1E;5毫米)。

为了检测被USP30去泛素化的底物，我们利用质谱(MS)分析了USP30i处理的野生型(WT)或USP30 KO HEK293细胞的泛素组。在WT细胞中，USP30i处理分别在处理后30 min和2 h改变了9和489蛋白的泛素化(p < 0.1;图S1B、S1C;表S1和表S2)。在USP30 KO细胞中，这些蛋白中的8/9在30分钟和409/489蛋白在2小时也表现出USP30i的差异泛素化，突出表明这些是脱靶(USP30无关)事件(图S1B和S1C)。在脱靶点中，许多属于DUB家族(DESI2、ATXN3、UBP4、UBP45和UBP47)，突出了UPS30i可能参与的额外DUB(图S1B和S1C)。

接下来，我们专注于仅在WT细胞中显示USP30i泛素化变化的蛋白(80个蛋白;图1F和1G)。我们通过亚细胞定位对80种蛋白进行分类。其中31个标记为线粒体，30/31显示USP30i泛素化增加(图1F和1G)。与USP30的定位一致，6/31线粒体底物位于线粒体外膜上(例如TOM20、MIRO和CISD1)(图1F和1G，绿色符号)。有趣的是，据报道，很大一部分线粒体蛋白(22/31)位于线粒体内(红色符号)，其余3/31没有标记的线粒体亚定位(橙色符号)。在USP30i处理2小时后，这些线粒体内蛋白的差异泛素化是显著的(图1G)，但许多在30分钟后显示泛素化增加(图1F，红色符号)。此外，两种过氧化物酶体蛋白(PM34和TM135)在USP30i处理后泛素化增加，这与USP30在该细胞器上的额外定位一致(图1F和1G，蓝色符号)。

因此，USP30的急性抑制特异性地促进了一系列底物上的泛素化，令人惊讶的是，这些底物包括线粒体内的蛋白质。当比较无USP30i的WT和USP30 KO细胞的泛素化时，大多数线粒体泛素化差异蛋白都在线粒体内:36/61个蛋白在KOs中泛素化增加，其中34个在线粒体内(图1H，星号;表S1和表S2)。重要的是，在USP30i处理的WT细胞中，这34种蛋白中的20种显示出增加的泛素化(星号符号，图1F和1G)。显示USP30依赖性增加的线粒体内蛋白属于多个功能类别，包括代谢酶(CISY、THIOM、PRDX3和AFG32)、伴侣(TRAP1、CH60和GRP75)、mRNA加工因子(PTCD3)、tRNA合成酶(SYIM和SYWM)、核糖体亚基(RM12和ERAL1)和电子传递链(ATPB、AT5F1、NDUA6、QCR1、TIDC1和COX41)。因此，USP30 KO和USP30被抑制的细胞都积累了各种泛素化的线粒体内蛋白。

这些数据是出乎意料的，因为在完整的线粒体内未观察到泛素化，并且USP30的催化结构域面向细胞质(图S1D)。为了解释这些发现，我们假设USP30在易位过程中使线粒体内蛋白去泛素化。为了支持这一假设，对差异泛素化赖氨酸的检查显示，修饰残基聚集在底物的C端，通常超出了前序列和随后的～50个氨基酸(即预测跨越线粒体膜的残基延伸)(图S1E)。这种泛素化模式与线粒体蛋白的拓扑结构是相容的，线粒体蛋白将它们的n端序列插入到TOM复合物中，使它们的c端赖氨酸从线粒体表面延伸到USP30。与这一观点一致，我们在USP30抑制细胞的线粒体部分中检测到线粒体内蛋白的泛素化肽CISY和NDUA9的丰度增加(图S1F和S1G)。因此，抑制USP30似乎会触发线粒体上泛素化蛋白的积累。

泛素化底物与亚室门口DUB的结合在26S蛋白酶体上得到了最好的研究。在那里，蛋白酶PSMD14和半胱氨酸蛋白酶USP14和UCHL5通过去泛素化控制泛素化底物进入蛋白酶体核心。线粒体输入机制和26S蛋白酶体都需要通过各自的～20A˚孔展开底物进行易位，这反映了功能上的相似性。因此，我们假设USP30去泛素化进入线粒体的UB -底物，以允许它们的输入。与USP14或UCHL5类似，USP30也可能作为局部蛋白质量控制途径的一部分对抗一个或多个Ub连接酶。

图1所示。USP30去泛素化线粒体蛋白，通常定位于线粒体内

(A) SH-SY5Y裂解物与HA - UB -乙烯砜探针(HA-Ub-VS)反应，并免疫印迹USP30。在细胞裂解之前，用USP30 siRNA和CCCP (20 mM, 2 h) (NS，非沉默siRNA)对培养物进行额外处理。

(B)定量% USP30与HA-Ub-VS反应，来自(A)。n = 3次实验。

(C) USP30i的化学结构。

(D)用USP30i和BAM15处理表达GFP-Parkin的HEK293细胞的抗ha - ub IPs中TOM20的免疫印迹。

(E)将复制的TOM20归一化到输入的量化，来自(D)。与“DMSO”相比，单因素方差分析(Dunn) *p < 0.05。N = 3个实验。

(F - h) 30分钟(F)和2小时(G)处理后“USP30i处理与DMSO”以及基线时“WT与USP30 KO”之间的差异蛋白泛素化火山图(h)。每个符号代表ms鉴定的Ub蛋白In (F)和(G)， USP30i在WT和USP30 KOs中改变的Ub蛋白(即非特异性Ub事件)被排除在外。颜色代表蛋白质的亚细胞和亚线粒体定位，如(F)图例中突出显示的那样。星形代表基线时USP30 KOs中改变的ub蛋白，从(H)开始。符号的大小与p值成反比。

数据用平均值±SEM表示。另见图S1。

2、USP30与TOM复合物具有生物化学关联

为了检验USP30是否与TOM复合物存在生化关联，我们从细胞提取物中免疫沉淀USP30(见STAR方法)。抗USP30抗体(Ab)以80±8%的效率检测USP30(图2A)。重要的是，anti-USP30 Ab复制TOM20、TOM40和TOM70(图2B-2F)，证明了与TOM复合物的生化关联。作为这种关联特异性的证据，抗USP30 Ab没有复制丰富的线粒体表面蛋白VDAC(图2C)，并且没有从USP30 KO提取物中复制TOM复合物亚基(图2B-2F)。这些数据表明USP30与TOM复合物的多个亚基特异性相关。 

图2。USP30与TOM复合物具有生物化学关联

(A-C) USP30免疫印迹（A) TOM20, TOM40 (B) TOM70和VDAC (C)在抗USP30的IPs和WT和USP30 KOs的对照IgGs中。

(D-F)复制TOM20的定量(D) TOM40 (E)和TOM70 (F)归一化到各自的输入，从(B)和(C)。***p < 0.001，单样本t检验。N = 6-7个培养物。数据用平均值±SEM表示。

3、在USP30 KOs中，线粒体输入USP30底物减少

为了了解USP30 KO对USP30底物线粒体输入的影响，我们基于split-GFP系统开发了一种输入试验，包括:(1)组成性表达的GFP1-10融合到带有n端线粒体靶向序列的MTS-mScarlett-GFP1-10)和(2)多西环素(Dox)诱导的GFP11融合到输入底物。用MTS-mScarlett-GFP1-10和单个导入substrateGFP11融合构建体转染HEK293细胞后，MTS-mScarlett-GFP1-10在类似线粒体的结构中积累(图3A)。通过dox诱导底物gfp11的表达和24小时内GFP荧光产生的延时成像来观察Import。正如预期的那样，仅转染MTS-mScarlettGFP1-10的细胞在时间过程中没有产生任何GFP荧光(图3B和3C)。相反，同时转染MTS-mScarlett-GFP1-10和导入substrateGFP11的细胞显示出与MTSmScarlett-GFP1-10共定位的GFP荧光(图3A，插图)。

利用该报告系统，我们量化了一系列线粒体内USP30底物，包括CISY、atp50、GRP75、NDUA4和TRAP1在WT或USP30 KO细胞中的输入量。有趣的是，我们观察到USP30 KOs中USP30底物的输入效率降低(图3B和3C)。据推测，每种底物的泛素化池都依赖于usp30输入，这导致了两种基因型之间观察到的输入效率差异。在不同的实验中，WT和KOs之间MTS-mScarlett的积累率没有显著差异(图S2A)。这些成像数据表明，USP30的去泛素化有助于有效地进入线粒体。

为了检验输入生物化学，我们使用Su9-DHFR-FLAG作为模型底物。Su9-DHFR-FLAG含有线粒体基质蛋白酶的两个切割位点，通过免疫印迹可以可视化未导入的前体[p]、易位中间体[i]和完全导入的成熟底物[m](图3D)。我们将DOX-诱导的Su9-DHFR-FLAG表达构建体与GFP对照一起转染到WT或USP30 KO细胞中，诱导表达3或6小时，然后对FLAG和GFP进行免疫印迹(图3D)。与WT细胞相比，USP30 KOs在诱导6小时后积累的Su9-DHFR-FLAG减少50%，表明USP30 KOs模型底物的不稳定性(图3D和3E)。经归一化表达后，成熟底物在USP30 KOs中的累积量减少40%(图3D和3F)。重要的是，USP30 KOs积累的易位中间体比WT细胞多50%(图3D和3G)。与输入减少一致，Su9-DHFR-GFP11在USP30 KO细胞的分裂-GFP输入实验中显示GFP荧光减少(图S2B)。这些数据支持USP30 KO细胞积累输入底物的观点，这些底物可能在TOM复合体中被阻止。

图3。在USP30 KOs中，USP30底物的线粒体输入减少

(A)使用分裂- gfp报告系统对细胞中线粒体输入的延时成像。以CISY-GFP11 i为例。插图以灰度突出显示放大区域。比例尺，20毫米。

(B) MTS-Scarlett-GFP1-10和csis - gfp11在WT或USP30 KO细胞中的延时成像。比例尺，10毫米。

(C)对每一种输入底物进行线粒体面积(mScarlett信号)归一化后随时间产生的GFP荧光强度定量。TwoWay方差分析。N = 3-6个培养，每个培养4个孔。

(D)转染Su9-DHFR-FLAG和GFP的WT和USP30 KO细胞裂解物的免疫印迹。Dox诱导Su9-DHFR-FLAG表达3、6 h。

(E - G)归一化为GFP的总Su9-DHFR-FLAG (E)、归一化为总Su9-DHFR-FLAG (F)和中间Su9-DHFR-FLAG (G)的定量(D)。单样本t检验。N = 7-8次实验。

*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001。数据用平均值±SEM表示。另请参见图S2。

4、在基础条件下与USP30协同作用的Ub连接酶的鉴定

接下来，我们试图确定哪些E3连接酶在基础条件下与USP30对立。由于USP30定位于线粒体，我们假设它可能与线粒体相关的E3连接酶协同作用。为了鉴定这些连接酶，我们在WT和USP30 KO HEK293细胞中分别表达了flag标记的线粒体定位E3连接酶MUL1、March5和RNF185，以及线粒体相关E3连接酶Parkin 、SMURF1和底物适配器FBXO7 10小时(图4A)。FLAG的免疫印迹证实了每个连接酶的表达(图4A)。在WT细胞中，大多数E3连接酶不能诱导Ub-TOM20信号(图4A)。然而，在USP30 KO细胞中，March5- flag或MUL1- flag的表达刺激了Ub-TOM20，表明内源性USP30抵消了内源性和外源性表达的March5和MUL1的泛素化(图4A和4B)。灭活突变的March5-FLAG(H43W)或MUL1-FLAG(H319A,C339A)损伤了USP30 KO细胞中的Ub-TOM20，表明它们各自的催化活性是TOM20泛素化所必需的(图S3A-S3D)。TOM20的泛素化与其蛋白量的减少无关(图S3A、S3C、S3E和S3F)。虽然Parkin、SMURF1或FBXO7在WT或USP30 KO细胞中不诱导Ub-TOM20，但RNF185在WT和USP30细胞中均诱导了Ub-TOM20(图4A)。将连接酶的表达时间延长至24 h，得到了类似的结果(图S3G)。因此，March5和MUL1被确定为USP30 KOs中能够诱导TOM20差异泛素化的候选连接酶。

在证明了USP30对外膜和线粒体内蛋白的去泛素化作用后，我们想知道MUL1或March5是否调节更广泛的线粒体蛋白质组的泛素化作用。为了鉴定USP30依赖性和非依赖性底物，我们利用质谱分析了稳定表达dox诱导的March5-FLAG或MUL1-FLAG的WT和USP30 HEK293细胞中的泛素化蛋白(图4C)。为了确定USP30和每个连接酶之间的共享底物，我们比较了“组合”(“连接酶过表达+ USP30 KO”)与“单一处理”条件(“连接酶过表达”或“USP30 KO”)之间的泛素化。与任何单一处理条件相比，在组合中显示累积泛素化增加的蛋白质代表共同连接酶/USP30底物(图4D和4E，右上象限)。

使用这些标准，与“单独使用March5”或“单独使用USP30 KO”相比，“March5 + USP30 KO”组合中57个蛋白的泛素化程度增加(图4D和表S3)。这些蛋白中有20/57定位于线粒体，重要的是，其中15/20位于线粒体内(图4D，红色圆圈)。在这个线粒体内队列中，许多USP30i泛素化增加，包括CISY、TRAP1和NDUA4(图1)。USP30 KOs中的March5表达揭示了其他线粒体内蛋白的泛素化(例如ADT2/3、GLYM和MTLN)，表明低水平的基础泛素化被USP30的内源性DUB活性迅速清除(图4D)。重要的是，在“March5 + USP30 KO”组合中，许多显示泛素化增加的线粒体蛋白在WT细胞中表达March5时没有显著变化(图S3H和表S3)。这些结果强调了USP30在对抗3 - ch5催化的泛素化中的有效性。免疫印迹证实，在USP30 KOs中，CISY泛素化是通过表达March5诱导的，而不是通过其失活的March5(H43W)突变体诱导的(图4F和4G)。这些数据表明，3 - ch5连接酶活性可以促进线粒体内蛋白的泛素化，但只有当USP30的反去泛素化被削弱时。

与March5-FLAG相比，USP30和MUL1-FLAG之间共享的线粒体底物主要是TOM复合物亚基(图4E和表S4)。值得注意的是，在WT或USP30 KO细胞中，线粒体内USP30/March5底物(如CISY、NDUA4或NDUA9)在MUL1表达时，泛素化都没有增加(图4E)。这些结果表明TOM复合物的泛素化与线粒体内蛋白的泛素化是不同的，并假设March5和USP30的相反活性专门针对后者群体。

接下来，我们测试了March5是否与TOM复合物类似于USP30。March5确实复制了TOM亚基(图3i)，最突出的是TOM70。与此一致的是，March5和USP30的共享底物包括已知参与TOM70输入的蛋白质，包括CISY和ADT2/3，我们没有发现USP30和March5之间的关联(数据未显示)。综上所述，这些数据表明March5定位于与TOM70受体相关的线粒体内蛋白泛素化。

为了直接证明March5对输入底物的泛素化作用，我们利用兔网状细胞裂解液(RRL)合成了重组CISY-V5，并将其稳定表达March5- flag。此外，在细胞中添加E1、E2 (UbcH5b)、HA-Ub和ATP:Mg来催化泛素化(见STAR方法)。从细胞微球中获得casy - v5 IP后，仅在表达March5-FLAG的USP30 KO细胞中观察到特异性HA-Ub coIP信号，而在其他条件下没有观察到(图4H)。从反应中省略E1和E2消除了HA-Ub信号(图S3J)。我们还在另一种March5底物NDUA9-V5的沉淀中发现了依赖于March5和usp30拮抗的HA-Ub信号(图4D和S3K)。特定的HA-Ub复制带对应于单、二和三泛素化底物(图4H， 50 - 75 kDa;图S3K， 45 kDa)，表明在March5之前构建了多个单ub或短链。我们没有在上清的抗v5沉淀中发现特异性HA-Ub信号(在上述细胞成球后获得)，这表明ub蛋白仍然与线粒体结合(图S3L)。这些结果表明，March5可以直接刺激输入底物的泛素化，而USP30在线粒体上抑制这种泛素化。

为了检查泛素化底物是否被导入线粒体，我们将表达March5 - flag的USP30 KO细胞与重组底物一起孵育，然后用蛋白酶K (PK)处理细胞颗粒，以消化线粒体表面的蛋白质。正如预期的那样，线粒体内蛋白HSP60和成熟形式的CISY-V5和NDUA9-V5对PK具有抗性(图4I和S3M)。相比之下，PK处理切断了TOM20，消化了CISY-V5或NDUA9-V5前体，更重要的是，消化了它们的泛素化形式(图4I和S3M)。在这些实验中，我们没有看到基因型或March5日对整体输入效率的影响(图4H和S3K, m波段)，可能是由于过量的未修饰的输入底物。总的来说，这些数据表明，被March5泛素化的底物仍然附着在线粒体表面，而不是输入。

图4 March5诱导USP30 KOs中输入底物的泛素化

 (A) TOM20中输入底物的泛素化。

(B)经输入归一化的复制TOM20信号的量化，来自(A)单向方差分析(Dunn)。N = 6-7次实验。

(C)诱导表达March5-FLAG或MUL1-FLAG的HEK293 WT或USP30 KO细胞中的FLAG免疫印迹。

(D和E)表达March5-FLAG (D)或Mul1-FLAG (E)后USP30 KOs泛素化改变的蛋白。大圆图:p < 0.05。

(F)用CISY-V5标记的WT或失活的March5(H43W)转染细胞的抗ha - ub IPs中CISY的免疫印迹。HW，H43W。

(G)由(F)归一化到输入的复制CISY的量化。单向方差分析(Dunn)。N = 4次实验。

(H和I)细胞微球抗CISY-V5沉淀中HA-Ub和重组casy - v5的免疫印迹。在(I)中，细胞在裂解前再用PK处理。5, March5-FLAG;p,前体;米,成熟。(H)或(I)中n = 3个实验。

*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001。数据用平均值±SEM表示。另请参见图S3。

5、March5是USP30底物子集泛素化所必需的

由于March5过表达足以诱导USP30 KOs中泛素化线粒体内底物的积累，我们想知道内源性March5是否具有类似的功能。为了回答这个问题，我们尝试生成March5 KO细胞，然而，我们没有获得纯合的KOs，这与March5对细胞适应度的要求一致。因此，我们选择了两个独立的小干扰rna (sirna)，显示80%的March5敲低进行泛素分析(图5A)。正如预期的那样，与WT细胞相比，用非沉默siRNA处理的USP30 KOs增加了线粒体内蛋白的泛素化(表S5;图5B，红色圆圈)。重要的是，用任意一种siRNA敲低March5可减少USP30 KOs中线粒体内蛋白的泛素化(图5B，左下象限)。在USP30 KOs中显示泛素化增加的基因中，包括CISY、TMM65、SYIM、ABCB7和C560在内的一个子集在March5基因敲除后泛素化大幅降低，而其他基因要么趋向于泛素化降低(如TOM20和TRAP1)，要么没有变化(如THIOM)(图5B和5C)。这些数据表明，在基础条件下，March5泛素化了线粒体内USP30底物的一个子集。

图5。在USP30 KOs中，敲低March5可减少线粒体内蛋白亚群的泛素化

(A)用sirna处理的细胞制备的裂解物中March5的免疫印迹。NS, non-silencing;5, March5。

(B) March5敲除后USP30 KOs的Ub变化。大圆:USP30 KO与WT中泛素化改变的蛋白质(即，NS siRNA中的USP30 KO或WT, p < 0.1)。

(C)与WT-NS样品的平均值相比，每个sirna处理的样品中ub -底物的Log2倍变化，来自(B)。

6、March5指导USP30 KOs中蛋白酶体的输入中间体降解

为了详细研究泛素化底物的命运，我们重点研究了线粒体内膜蛋白TMM65 ，其泛素化受March5和USP30的调控(图5B)。此外，C末端标记的TMM65-V5在免疫印迹上以三个条带迁移(前体[p]，输入中间体[i]和成熟形式[m];图6A，输入)，可以在输入过程中逐步查询其丰度和泛素化状态。为了研究USP30和March5对TMM65导入的影响，我们通过一个组成型启动子在USP30 KOs中表达了March5- flag，并诱导了TMM65- v5的表达6小时。与WT细胞相比，在USP30 KOs中，March5的表达减少了成熟的TMM65- v5(图6A，输入通道5与6)。这种减少与中间和前体形式的积累有关，尤其是蛋白酶体抑制(图6A, MG132，输入通道6与8)。

接下来，我们更仔细地研究了TMM65的泛素化。正如预期的那样，在USP30 KOs中，March5-FLAG诱导的Ub-TMM65高于WT细胞(图S4A和S4B)。为了研究不同TMM65物种的泛素化，用USP2的重组催化结构域处理HA-Ub IPs，使Ub底物坍塌到未修饰的分子量。该分析显示，在WT和USP30 KOs中，March5-FLAG可诱导TMM65-V5前体和中间体泛素化。成熟形式的泛素化在很大程度上不受影响(图6A-6C，通道1 vs . 5，通道2 vs . 6)。重要的是，March5- flag诱导了Ub-TMM65-V5中间体在USP30 KO细胞中更多的积累，而牺牲了Ub前体(图6A-6C，通道5 vs . 6)。这些数据表明，在USP30 KO细胞中参与输入机制的TMM65-V5 ub前体可能被加工成中间形式，但在输入过程中停滞并积累为Ub中间体

蛋白酶体抑制导致USP30 KOs中TMM65-V5 ub前体和Ub -中间体进一步积累(图6A-6C, 6通道与8通道)。与WT细胞相比，蛋白酶体抑制的USP30 KOs中TMM65-V5 Ub -中间体的丰富度高出2倍(图6C, 7通道与8通道)。这些数据使我们假设Ub -中间体是USP30 KOs中的蛋白酶体底物。或者，在蛋白酶体抑制下积累的Ub前体可能参与输入机制，进行蛋白水解处理，并以中间形式积累。

与USP30 KOs的降解一致，表达March5-FLAG的USP30 KOs积累的TMM65-V5比WT细胞少(图6A和6D，输入通道5与6)。这种影响取决于蛋白酶体活性(图6A和6D，输入通道6与8)。表达无活性的March5(H43W)-FLAG不会改变TMM65-V5的总水平(图S4C)。此外，TMM65-V5沉淀物的Ub连锁分析显示，March5-FLAG通过K11、K48和K63促进泛素化，这些连锁在USP30 KOs中比在WT细胞中积累更多(图6E和S4D)。此外，对跨越TMM65-V5的多肽的检测显示，在表达March5 - flag的USP30 KOs中，TMM65-V5具有完整的线粒体靶向序列(即未成熟)(图S4E和表S6)。

接下来，我们检查了TMM65物种在细胞质和线粒体组分之间的亚细胞分布。在基础条件下，成熟的TMM65-V5是主要形式，主要定位于线粒体，中间和前体形式较少，分别优先分离到线粒体和细胞质部分(图6F，通道1m和1c)。重要的是，通过在USP30 KOs中表达March5-FLAG，成熟的TMM65-V5几乎完全从线粒体片段中消失(图6F和6G，通道5m与通道6m)。这表明TMM65的一部分在完全输入之前被March5泛素化，并被USP30去泛素化。没有USP30，输入受到损害，这与USP30去泛素化ub底物以允许其输入的机制一致。在表达March5-FLAG的USP30 KOs中也观察到线粒体CISY-V5的类似减少(图S4F和S4G)。此外，蛋白酶体抑制并没有进一步改变线粒体部分中成熟TMM65-V5的水平(图6F和6G，通道6m与通道8m)。总之，这些数据表明，March5催化的泛素化足以阻止输入。

检查TMM65-V5的行为，我们注意到March5-FLAG的表达将TMM65-V5中间体重新分配到细胞质部分，最明显的是在USP30 KOs中(图6F和6H，通道5c与通道6c)。还观察到线粒体部分中中间体的同时耗损(图6F和6I，通道5m与通道6m)。重要的是，蛋白酶体抑制进一步增强了USP30 KOs中中间物种的细胞质积累(图6F和6H，通道6c和通道8c)。综上所述，这些数据表明，3 - ch5诱导的泛素化刺激了被阻滞的TMM65-V5中间体的积累，这些中间体随后被细胞质中的蛋白酶体降解。蛋白酶体抑制阻止了线粒体部分中间体的消耗(图6F和6I，通道6m和8m)，这表明要么蛋白酶体降解线粒体表面的中间体，要么积聚在细胞质中的中间体可以分裂回线粒体。有趣的是，在中间体在线粒体上积累的条件下(图6F, 通道 8m)，我们还观察到TOM20蛋白水平降低～40%(图6F, 6J, S4H和S4I)，这表明中间体的积累可能引发USP30 KOs中TOM复合物的丢失。

作为进一步的对照，另一种蛋白酶体抑制剂(lactacystin)在表达march5的USP30 KO细胞的亚细胞部分复制了中间体的积累(图S4J)。此外，USP30 KOs中USP30-myc的重新表达挽救了March5诱导的成熟TMM65-V5的线粒体耗损，并阻止了中间TMM65-V5的细胞质积累(图S4K和S4L)，证实了USP30的特异性作用。

图6。March5诱导非输入易位中间体的积累，这些中间体被蛋白酶体降解

(A)input和USP2催化结构域(CD)处理的HA-Ub IPs中TMM65-V5的免疫印迹。用Dox (6 h)诱导TMM65-V5表达。在HA-Ub IP前，再用MG132 (10 mM, 1 h)处理细胞。5, March5;p,前体;i,中间体;m,成熟体。箭头突出了特定的USP30波段。

(B和C)前体(B)和中间体(C) TMM65-V5的定量，HA-Ub复制，USP2洗脱，来自(A)。单向方差分析(Holm-Sidak)。N = 5个实验。

(D)经HSP60归一化的TMM65-V5总信号量化，来自(A)单向方差分析(Dunn)。N = 10-12次实验。

(E) TMM65-V5 ip中Ub连锁丰度的热图。每个连锁的丰度归一化为每个样本中TMM65-V5的丰度。色阶:在“WT+DMSO”上的折叠变化。(F)细胞细胞质(c)和线粒体(m)中TMM65-V5的免疫印迹。箭头突出了特定的USP30波段。

*突出一个Ub-TMM65-V5波段。

(G - J)线粒体组分中成熟TMM65-V5 (G)和TOM20 (J)以及细胞质(H)和线粒体(I)组分中中间TMM65-V5的定量，来自(F)。单因素方差分析(Dunn) (G和I)或(Holm-Sidak) (H和J)。n = 8-9个实验。

(K)从转染了March5-FLAG和HA-Ub的USP30 KO细胞中提取USP2 - CD处理的HA-Ub IPs的免疫印迹。

(L和M)USP2 - CD处理的半透性USP30 KO细胞(L)或其细胞质部分(M)中TMM65-V5的免疫印迹。细胞经MG132转染处理，如(A)所示。

*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001。数据用平均值±SEM表示。另请参见图S4。 

7、USP30 KOs在线粒体表面积累泛素化的输入中间体

通过用USP2破坏细胞组分中的Ub蛋白，我们证实TMM65-V5前体和中间体是表达March5的USP30 KOs细胞质中的主要Ub物种(图6K)。相比之下，TMM65-V5中间体是线粒体组分中最丰富的Ub物种(图6K)。有趣的是，我们注意到线粒体片段中有一个条带对应于单个TMM65-V5中间体的分子量(图6F中的*)。这种新特征在March5- flag表达和蛋白酶体抑制的USP30 KOs中逐渐积累。该条带也是线粒体片段中最突出的特征，不对应于未修饰的TMM65-V5物种。我们想知道这个条带是否与线粒体表面积累的未输入Ub中间体相对应。为了验证这一点，我们用MG132处理表达March5 - flag的USP30 KO细胞，使其积累重要中间体，使其质膜半透性，然后将其暴露于USP2或PK中。用USP2或PK处理导致该条带消失，表明Ub-TMM65-V5位于线粒体表面(图6L, S4M和S4N)。USP2同样在细胞质组分中消除了该条带(图6M)。对CISY-V5 的类似实验也在USP30 KOs的线粒体表面发现了一个泛素化的CISY-V5物种(图s40 - s4s)。与细胞质中分离的高分子量Ub-TMM65-V5相反，线粒体组分中的Ub-TMM65-V5显示出单Ub和其他低分子量修饰(图6F)。因此，我们推测March5可能修饰了单Ub或短链的底物，这些底物在细胞质中被拉长以降解。

8、March5和USP30相互调节磷酸化Ub的丰度

在线粒体自噬过程中，线粒体激酶PINK1磷酸化Ub的丝氨酸65 (p-Ub)，促进Parkin向线粒体募集。最近的一项研究表明，March5过表达会促进Parkin的招募。因此，我们想知道由March5组装的Ub链是否可能为PINK1磷酸化提供底物。在HEK293细胞中，敲低March5并没有改变线粒体去极化后p-Ub的积累(图S5A)。由于Parkin在这些细胞中表达，并且可能为PINK1磷酸化提供Ub链，因此我们在缺乏Parkin的HeLa细胞中敲除了March5 。在那里，敲低March5使p-Ub积累减少～50%(图7A和7B)。USP30基因敲除具有相反的作用，增加p-Ub(图S5B和S5C)。正如预期的那样，PINK1敲除完全消除了pUb信号(图S5D)。因此，March5介导的线粒体内蛋白泛素化为稳定状态下的PINK1磷酸化提供了一系列底物。

9、USP30 KO小鼠的TOM复合物丰度降低

为了研究USP30对体内线粒体蛋白质组的影响，我们通过删除小鼠USP30基因的外显子2建立了一个组成型KO模型。USP30 KO小鼠出生时具有预期的孟德尔比率(图S5E)，没有大体组织学表型(数据未显示)。解剖的WT和KO组织的免疫印迹显示USP30信号在所有脑区(图S5F)，并证实USP30蛋白在KOs中缺失(图S5G)。

接下来，我们用质谱法比较了6月龄WT和USP30 KO小鼠皮层线粒体富集部分WT和USP30 KO小鼠的线粒体蛋白质组(图S5H)。有趣的是，与WT相比，USP30 KO线粒体中的TOM复合物亚基TOM20、TOM40、TOM22、TOM6和TOM7减少(图7C和表S7)。同样，在USP30 KO线粒体中，March5也减少了(图7C)。相反，在细胞培养研究中鉴定的TOM70和线粒体内USP30底物(例如，CISY, ATPO和TRAP1)在两种基因型之间显示出相似的蛋白质丰度。我们通过对皮层(图7D和7E)和肺(图S5I和S5J)的免疫印迹分析证实了这些观察结果。此外，在MG132处理而非巴菲霉素处理的USP30 KO胚胎成纤维细胞培养中，TOM20是稳定的，这表明蛋白酶体发生了周转(图S5K和S5L)。因此，USP30的消耗增加了TOM复合物的周转，这与USP30在体内对该亚室泛素化的依赖调节一致。

接下来，我们检测了USP30 KO小鼠海马神经元的线粒体功能。与之前的报告一致，通过荧光mt-Keima报告基因检测，USP30的缺失使有丝分裂加速了50%(图S5M和S5N)。USP30 KO神经元的基础呼吸增加～70%(图7F和7G)。在基因型之间，用于ATP相关呼吸的基础呼吸的比例相似(图7F和7G)。USP30 ko的基础呼吸增加是以储备能力降低30%为代价的(图7F和7G)。因此，USP30缺失与神经元中线粒体自噬增加和线粒体代谢改变有关。

图7。March5基因敲低后p-Ub积累减少;USP30 KO小鼠中TOM复合物丰度降低

(A)        用March5 siRNA和BAM15处理的HeLa细胞中p-Ub的免疫印迹。

(B) p-Ub的量化，来自(A)。单向方差分析(Holm-Sidak)。N = 2个实验，每个实验3个孔。

(C) MS测定的USP30 KOs线粒体蛋白丰度与WT相比变化了Log2倍，每个基因型n = 3只动物。符号颜色，亚线粒体定位;符号大小，减去p值;闭号，p < 0.05。

(D) WT和USP30 KO小鼠皮层免疫印迹。

(E)定量免疫印迹信号从(D)归一化为肌动蛋白。每个圆圈代表一种动物。单向方差分析(Dunn)

线粒体蛋白输入是一个高度协调的过程，参与细胞信号网络来维持线粒体和细胞的健康。在这里，我们确定了去泛素酶USP30在调节线粒体输入中的作用。USP30调节的多种蛋白质表明Ub系统对线粒体输入具有广泛的调节作用。然而，有趣的是，USP30仅与TOM复合物的一小部分相关(基于COIP实验～1%)，考虑到USP30相对于TOM复合物亚基的表达水平，这可能是预期的。这表明单个输入机器的USP30参与可能取决于输入底物泛素化的程度。另一种可能性是USP30与某些功能特殊的TOM复合物相关联。即使在线粒体去极化过程中，PINK1也只在一小部分TOM复合体上阻滞，这表明有一种独特的TOM复合体可以感知输入压力。未来的研究将集中在TOM配合物与Ub系统结合的分子异质性上。

在这项研究中，我们确定了March5是一种E3连接酶，它使线粒体内底物泛素化。考虑到March5-TOM70的关联以及TOM70在导入聚集倾向蛋白中的作用，我们提出在线粒体导入过程中，March5在质量控制途径中起作用。与此一致的是，据报道，March5可以使多种线粒体底物泛素化，包括低聚蛋白和蛋白质聚集体。在酵母中，TOM复合物阻断招募Cdc48/VCP作为线粒体降解途径的一部分，可以参与携带Ub的停滞输入底物。与March5标记TOM复合体上聚集和错误折叠的蛋白质一致，March5指导TMM65(一种具有疏水结构域的蛋白质)的泛素化和降解。重要的是，March5敲低并不能完全消除线粒体内蛋白泛素化，这表明USP30上游有额外的连接酶起作用。这种质量控制机制已被描述为对线粒体输入底物进行分类，并可能涉及与参与输入底物的细胞质伴侣蛋白相关的连接酶。

在线粒体输入受损后，PINK1稳定在TOM复合体上，磷酸化预先存在的Ub链，启动Parkin募集。在这种情况下，我们认为March5和USP30之间的平衡维持了以Ub -线粒体内蛋白形式存在的基础PINK1底物池。这一机制与USP30和March5对p-Ub的相互调节是一致的，USP30的缺失刺激Parkin向线粒体募集，而March5的缺失损害了这一过程。该模型将USP30置于PINK1的上游，这与USP30抑制诱导的基础线粒体自噬依赖于PINK1而不依赖于Parkin的观察结果一致。USP30在基础条件下对线粒体内蛋白去泛素化的作用表明，它在损伤条件下不具有新功能。相反，它的主要作用是充当TOM复合体上的去泛素酶，并作用于上游连接酶呈现的任何u -底物，如March5(基础)或Parkin(损伤)。USP30 KO小鼠中TOM复合物组分的减少进一步支持了USP30在维持体内TOM复合物稳定性中的作用。

USP30在TOM复合物中去泛素化线粒体输入底物的作用类似于蛋白酶体中的PSMD14亚基。PSMD14的去泛素化被认为可以回收Ub，并避免了对稳定Ub结构展开的能量昂贵的需要。一个新出现的主题是DUBs在亚细胞区室门口回收Ub，在那里通过去泛素化促进进入区室。