点击蓝字 关注我们
摘要
为了响应激素和生长因子I 类磷酸肌醇 3 激酶 (PI3K) 信号网络作为代谢和生长的主要调节因子发挥作用，控制细胞营养吸收、能量产生、减少辅因子产生和大分子生物合成。复发率最高的癌症中的许多驱动突变，包括受体酪氨酸激酶、Ras、PTEN 和 PI3K 的突变，都会在病理上激活 PI3K 信号传导。然而，我们对 PI3K 控制的核心代谢程序的理解是不完整的。在这里，我们使用基于质谱的代谢组学和同位素示踪，表明 PI3K 信号传导刺激最关键的代谢辅因子之一辅酶 A (CoA) 的从头合成。CoA 是细胞中活化酰基的主要载体，由半胱氨酸、ATP 和必需营养素维生素 B5（也称为泛酸）合成。我们确定泛酸激酶 2 (PANK2) 和 PANK4 是 PI3K 效应激酶 AKT 的底物。尽管已知 PANK2 可以催化 CoA 合成的限速第一步，但我们发现特征最少但高度保守的 PANK4 通过其代谢物磷酸酶活性是 CoA 合成的限速抑制剂。AKT 对 PANK4 的磷酸化可缓解这种抑制。最终，PI3K-PANK4 轴调节乙酰辅酶 A 和其他酰基辅酶 A 的丰度以及辅酶 A 依赖性过程，例如脂质代谢和增殖。我们认为这些调节机制协调细胞 CoA 的供应与激素/生长因子驱动或癌基因驱动的代谢和生长的需求。
正文
在寻找 I 类 PI3K 驱动的代谢程序的核心成分时，我们使用未转化的人乳腺上皮细胞系 MCF10A 进行了基于未标记的靶向液相色谱-串联质谱 （LC-MS/MS） 代谢组学筛选。PI3K在乳腺生长中起着重要作用，是乳腺癌的主要驱动因素。MCF10A细胞同样依赖于生长因子刺激的PI3K信号传导进行生长和增殖。在存在或不存在 PI3K 抑制剂的情况下，用胰岛素处理细胞以急性刺激 PI3K 信号传导（扩展数据图 1a）。除了诱导已知的 PI3K 调节的代谢途径发生变化外，我们还观察到 PI3K 抑制增加了泛酸的浓度，泛酸是一种必需营养素，也称为维生素 B5 （VB5）。VB5 独特地与半胱氨酸和 ATP 结合使用，用于辅因子辅酶 A 的从头生物合成（图 1a）。作为细胞内活化酰基的主要载体，辅酶A在各种核心代谢过程中起着关键作用，包括营养分解代谢和脂质合成。
图1
PI3K 和 AKT 刺激 CoA 合成
哺乳动物 CoA 合成的早期研究报告了激素对 CoA 丰度的影响，但这些反应背后的分子调节机制仍不清楚。为了研究 PI3K、VB5 和 CoA 之间的联系，我们使用靶向 LC-MS/MS 监测重同位素 (13C315N1) 标记的 VB5 结合游离的未酰化 CoA、乙酰辅酶 A 和其他酰基辅酶 A情况（扩展数据图 1b）。在稳态标记条件下，VB5、CoA 和乙酰辅酶 A 池接近 100% 标记，无论培养基包含马血清还是不含未标记 VB5 的血清替代品（扩展数据图 1c）。与该结果及其作为必需营养素的作用一致，VB5 是细胞增殖所必需的（扩展数据图 1d）。因此，在用于培养 MCF10A 细胞的条件下，几乎所有 CoA 最终都源自培养基中提供的 VB5。在缺乏血清和生长因子（以最小化 PI3K 信号传导）并与 13C315N1-VB5 一起孵育的细胞中，AKT 磷酸化表明胰岛素激活 PI3K，并在 3-5 小时后大幅增加新合成的标记的CoA 和乙酰辅酶 A 的丰度（扩展数据图 1e）。标记的 VB5 比例在一小时内接近 100%，胰岛素对 VB5 的初始摄取率几乎没有影响，尽管 VB5 在随后的时间点通过胰岛素处理略有积累（扩展数据图 1e，g）。PI3K的药理抑制完全阻断了胰岛素诱导的标记CoA和乙酰辅酶A丰度的增加，同时增加了标记VB5的丰度（图1b）。使用重同位素标记的13C315N1-半胱氨酸的补充示踪策略产生了类似的结果（扩展数据图 2a-c）。生长因子 IGF-1 和 EGF 也刺激标记 CoA 和乙酰 CoA 丰度的增加，并且在 EGF 刺激的细胞中，PI3K 抑制阻止了这种增加，而不影响 MEK-ERK 激活（扩展数据图 2d，e）。在缺乏生长因子的情况下，源自癌症的 PI3Kα 组成型活性点突变体 (H1047R) 的表达足以增加标记 CoA 和乙酰辅酶 A 丰度（图 1c）。因此，PI3K 信号传导刺激从 VB5 从头合成的 CoA 和乙酰CoA 丰度增加。
接下来，我们评估了从头合成增加以外的过程（例如，酰基辅酶A的脱酰基化增加，或辅酶A使用或降解减少）是否有助于新合成辅酶A的PI3K依赖性积累。为了测试PI3K信号通路对细胞内CoA和乙酰辅酶A池的影响，我们用13C315N1-VB5脉冲标记细胞，并在缺乏VB5的培养基中追逐，然后用胰岛素刺激。预先标记的辅酶A和乙酰辅酶A池不会因胰岛素而扩增，而PI3K信号转导反应正常（扩展数据图3a）。此外，以PI3K依赖性方式合成的辅酶A用于形成多个短链酰基辅酶A（图1d;LC-MS/MS方法的验证见扩展数据图3b）。作为监测辅酶A合成的正交方法，我们用放射性标记的14C-VB5脉冲标记细胞，然后在缺乏VB5的培养基中追逐以耗尽游离的、未掺入的14C-VB5。稳定的放射性标记掺入具有胰岛素反应性和PI3K依赖性，支持我们的MS测定（图1e和扩展数据图3c）。总之，这些数据表明，PI3K刺激造成的新合成的CoA的积累依赖于增加从头合成，并不是由于对CoA脱酰基化、使用或降解的影响。
PI3K 抑制还降低了用胎牛血清 （FBS） 生长的 SUM159、MDA-MB-468 和 T47D 人乳腺癌细胞系以及用 IGF-1 刺激的小鼠成纤维细胞中新合成的辅酶 A 和酰基辅酶 A 的丰度（扩展数据 Fig. 3d，e）。因此，PI3K调节多种哺乳动物细胞类型和物种中的辅酶A合成。
PI3K调节代谢的主要效应物之一是蛋白激酶AKT。AKT的药理学抑制显著降低了胰岛素刺激的辅酶A合成并增加了VB5的积累，尽管程度低于PI3K抑制，这表明PI3K下游辅酶A合成的调节是多方面的（扩展数据图4a）。在无生长因子的条件下，诱导表达癌症衍生的AKT组成型激活点突变体（E17K）的细胞相对于表达野生型（WT）AKT的细胞表现出更多的AKT依赖性辅酶A合成（图1f）。AKT的这种长期组成型激活也增加了辅酶A和乙酰辅酶A的总池大小（扩展数据图4b）。在AKT的下游，机制靶标雷帕霉素复合物1（mTORC1）及其底物核糖体蛋白S6激酶（S6K）的是重要的代谢调节因子。然而，mTORC1 的药理学抑制并没有消除 AKT 刺激的辅酶 A 合成（图 1f）。这些结果表明，AKT激活足以刺激辅酶A合成并扩大PI3K下游的总辅酶A池。
AKT 磷酸化并刺激 ATP 柠檬酸裂解酶 （ACLY） 的活性，ACLY 是从柠檬酸盐和 CoA 产生乙酰辅酶 A 的酶。为了测试这种机制是否介导 AKT 对 CoA 合成的影响，在重 VB5 标记之前用特异性 ACLY 抑制剂处理表达 AKT（E17K） 的细胞。ACLY抑制如预期的那样减少了总乙酰辅酶A池，但大大增加了总辅酶A池和新合成的辅酶A池，而不影响ACLY的AKT依赖性磷酸化（图1g和扩展数据图4c）。游离辅酶A的这种积累可能是由于乙酰辅酶A的转化减少和乙酰辅酶A有效抑制泛酸激酶使辅酶A合成的反馈抑制降低。尽管总乙酰辅酶A丰度随着ACLY抑制而降低，但乙酰辅酶A的标记比例增加，这可能是由于其他产生乙酰辅酶A的酶的活性。即使有ACLY抑制，辅酶A合成对AKT抑制仍然敏感（图1g）。这些结果表明，AKT在其既定的ACLY调控的上游调控CoA合成。
PANK2 和 PANK4 是 AKT 底物
接下来，我们确定了CoA合成途径的任何酶（图2a）是否符合AKT底物的标准。全AKT底物共有基序（RXRXXS/T，其中R为精氨酸;X是任何氨基酸;S/T 是磷酸化的丝氨酸或苏氨酸）仅在泛酸激酶家族成员 PANK1、PANK2 和 PANK4 上鉴定（图 2b）。在四种脊椎动物 PANK 旁系物中，PANK1（α 和 β 亚型）、PANK2 和 PANK3 是具有催化活性的泛酸激酶，在 CoA 合成的第一步和速率决定步骤中产生 4′-磷酸泛酸。在哺乳动物中，这些 PANK 定位于多个区室，包括细胞质（PANK1/3）、细胞核（PANK1/2）和线粒体的膜间空间（PANK2）。PANK2 最受关注，因为 PANK2 基因的突变会导致一种称为泛酸激酶相关神经变性（PKAN）的先天性疾病。研究较少的旁系同源物 PANK4 预计是胞溶性的，缺乏泛酸激酶活性，并且不可以调节CoA从头合成。
图2
使用特异性识别磷酸化 AKT 底物基序的抗体，我们检测到免疫纯化的内源性 PANK2 和 PANK4 的胰岛素刺激的 PI3K 依赖性磷酸化，但未检测到 PANK1（图 2c;抗体在扩展数据图 5a 中得到验证）。与 PANK2 抗体相比，可用的 PANK4 抗体产生了更稳健的免疫纯化，因此我们在其他环境中评估了 PANK4 磷酸化。在IGF-1 和 SUM159 刺激的小鼠成纤维细胞中也检测到 PANK4 的 PI3K 依赖性磷酸化（扩展数据图 5b，c），反应这些细胞中 CoA 合成的效应（扩展数据 Fig. 3d，e），并表明该机制的保守性。重要的是，我们在体内检测到内源性 PANK4 的 PI3K 依赖性磷酸化。对小鼠进行为期 10 天的 PI3K 抑制剂处理可减少表达 Pik3cap.H1047R 的乳腺同种异体移植肿瘤中的 PANK4 磷酸化，这些肿瘤表现出 PI3K 依赖性生长。对非荷瘤小鼠进行一小时的 PI3K 抑制剂处理还降低了骨骼肌中 PANK4 的磷酸化，骨骼肌是 PANK4 表达最高的组织（图 2d，e 和扩展数据图 5d）。
在没有生长因子的情况下，胰岛素、IGF-1 或 AKT（E17K）刺激的 PANK2 和 PANK4 磷酸化表达在 AKT 抑制后被阻断，但在 mTORC1 抑制后则不被阻断（图 2f 和扩展数据图 5b、e）。纯化的AKT在体外直接磷酸化免疫纯化的野生型PANK2和PANK4，通过将PANK2 Ser169和Ser189以及PANK4 Thr406突变为丙氨酸来消除这种磷酸化（图2g-i）。PANK2 上的 AKT 底物基序在哺乳动物中大多是保守的，而 PANK4 上的基序在脊椎动物中是保守的（扩展数据图 6a，b）。因此，AKT 在对辅酶 A 合成的影响的同时，在保守的 AKT 底物基序中磷酸化 PANK2 和 PANK4。
PANK4 抑制辅酶 A 合成
接下来，我们确定 PANK2 和 PANK4 是否介导 AKT 依赖的 CoA 合成调节。首先，使用特定的抑制剂，我们确定阻断 PANK 激酶活性会消除 AKT 刺激的 CoA 合成。PANK 激酶抑制也足以导致 VB5 大量积累（图 3a 和扩展数据图 7a）。接下来，我们使用短干扰 RNA (siRNA) 介导的敲低（在扩展数据图 5a 中验证）分别消耗 AKTp.E17K/+敲入的 MCF10A 细胞中的 PANK1、PANK2 和 PANK4。PANK1 或 PANK2 消耗趋向于减少 CoA 合成，但 PANK4 消耗意外地增加了 CoA 合成（图 3b 和扩展数据图 7b）。在 FBS 中培养的 SUM159 和 MDA-MB-468 细胞中也获得了类似的结果（扩展数据图 7c、d）。SUM159 细胞的稳态标记表明，即使在存在 FBS 的情况下，VB5 引发的从头合成也是 CoA 的主要来源（扩展数据图 7e）。为了进一步研究这些影响，我们生成了具有 CRISPR 介导的 PANK2 和 PANK4 敲除 (KO) 的 AKTp.E17K/+MCF10A 细胞。在 PANK2-KO 细胞和用 PANK2 稳定重建的衍生系中，我们在各种条件下都没有检测CoA 合成和丰度的一致差异，从而终止了在此背景下进一步研究 PANK2（扩展数据图 8a、b）。这些结果可能是由于 PANK1/3 的补偿，并且与之前的研究一致，这些研究同样没有检测到人类 PANK2 敲低细胞或成年 PANK2-KO 小鼠组织中 CoA 丰度的变化。然而，与我们的 PANK4 敲低细胞一样，PANK4-KO 细胞表现出 CoA 合成增加 (图 3c 和扩展数据图 9a)。鉴于 PANK4 的细胞功能尚不明确，且 PANK4 上的 AKT 底物基序保存良好 (扩展数据图 6b)，我们专注于确定 PANK4 在 CoA 合成中的调控和功能。
图3
我们用野生型 PANK4、磷酸化缺陷型 PANK4 （T406A） 或拟磷酸化 PANK4 （T406E） 稳定地重组了 PANK4-KO 细胞。野生型 PANK4 重新表达后辅酶 A 合成减少，再表达PANK4 （T406A）后进一步减少，表明这种未磷酸化的突变体具有增强的抑制辅酶 A 合成的能力（Fig. 3d和扩展数据图 9b）。为了将 PANK4 介导的辅酶 A 合成调节与 ACLY 的下游辅酶 A 使用以及乙酰辅酶A对 PANK1-3 的反馈抑制分离，我们在表达PANK4（T406A）或 PANK4（T406E）的PANK4-KO细胞中抑制ACLY。PANK4（T406A）降低了ACLY抑制下观察到的总辅酶A的积累，而PANK4（T406E）的抑制作用显著减弱（图3e）。与这些对辅酶A合成的影响一致，表达PANK4的AKT+/+和AKTp.E17K/+细胞的增殖均减少，PANK4（T406A）相对于PANK4（T406E）进一步减少增殖。表达野生型 PANK4 的细胞的增殖速率相对于 Thr406 突变体不同（图 3f 和扩展数据图 9c）。总之，这些数据表明 PANK4 抑制辅酶 A 合成，AKT 介导的 Thr406 磷酸化减弱了 PANK4 的这一功能，并具有促进辅酶 A 合成和细胞增殖的净效应。
PANK4 作为磷酸酶发挥作用
最后，我们试图确定PANK4抑制CoA合成的分子机制。进化突变使 PANK4 激酶结构域在脊椎动物中失活。然而，PANK4 具有第二个最小表征的结构域，属于金属依赖性代谢物磷酸酶 DUF89 家族（图 4a）。在体外，人 PANK4 分离的 DUF89 结构域可以去磷酸化第三个辅酶 A 合成中间体 4′-磷脂茶碱及其氧化衍生物。然而，在少数报道与 PANK4 相关表型的研究中，酶活性尚未被牵涉，PANK4 的特定细胞功能仍有待确定。尽管如此，PANK4 与存在于动物、植物和真菌中的预测假激酶和磷酸酶结构域的直系同源物高度保守。使用免疫纯化的人全长 PANK4 和标准小分子底物，我们证实 PANK4 在体外表现出二价金属阳离子依赖性磷酸酶活性（扩展数据图 10a）。两个保守的天冬氨酸残基对于先前表征的 DUF89 结构域的磷酸酶活性至关重要。氨基酸比对预测 Asp623 和 Asp659 对 PANK4 磷酸酶活性至关重要（图 4a），事实上，在这些残基中的任何一个突变后，磷酸酶活性都被消除了（图 4b）。在存在过量底物的情况下，PANK4对4′-磷酸酯（第三种辅酶A合成中间体）的活性明显高于对4′-磷酸泛酸酯（第一种辅酶A合成中间体）的活性（图4c）。在存在过量底物的情况下，我们无法检测到PANK4（T406）突变体磷酸酶活性的差异（扩展数据图10b）
图4
PANK4 的野生型和磷酸酶死亡突变体（D623A 和 D659A）在MCF10A和SUM159 PANK4-KO细胞系中的稳定重新表达表明，PANK4 抑制 CoA 合成的能力完全依赖于其磷酸酶活性（图 1）。4d 和扩展数据图 10c、d)。在测量的 226 种极性代谢物中，CoA 表现出最一致的 PANK4 磷酸酶依赖性丰度下降（图 4e 和扩展数据图 10e）。响应 PI3K 抑制而积累 VB5 不需要 PANK4，这与 PANK 激酶活性的抑制足以产生的效果一致（扩展数据图 7a 和 10f）。为了评估 PANK4 依赖性 CoA 丰度减少的额外代谢结果，我们测量了对几种 CoA 依赖性细胞过程的影响。基于MS的脂质组学分析表明，PANK4以依赖于其磷酸酶活性和磷酸化状态的方式显着改变细胞脂质谱（图4f和扩展数据图10g、h）。PANK4 减少了脂质子集的 13C6-葡萄糖标记，但不减少甘油主链和头基前体丰度（扩展数据图 10i，j），表明 CoA 依赖性脂肪酸合成和（或）脂质组装受损。此外，表达PANK4的细胞表现出磷酸酶活性依赖性的耗氧量减少，表明线粒体呼吸受损（图4g），以及依赖于核乙酰辅酶A的组蛋白乙酰化减少（扩展数据图10k） 。最后，我们发现PANK4在二维测定中抑制细胞增殖、在三维软琼脂测定中抑制集落形成以及在原位乳腺异种移植小鼠模型中抑制肿瘤发生的能力（图4h-j）完全取决于它的磷酸酶活性。
讨论
我们的研究表明，PI3K-AKT信号通路结合代谢物介导的反馈通过辅酶A从头合成途径调节通量（图 4k）。我们的研究结果还揭示了高度保守的 PANK4 的特定细胞功能，我们提出它通过其针对 4′-磷酸替碱和可能的其他相关底物的代谢物磷酸酶活性直接限制 CoA 的合成速率。PANK4 具有独特的定位，可以调节 CoA 合成，不仅来自 VB5，还来自 4′-磷酸二苯乙二醇，后者可以从细胞外来源输入。如前所述，PANK4 还可以处理受损的 4′-磷酸二苯甲酸衍生物。除了调节辅酶A的合成速率外，PANK4还可能将其产物分流到不同的区室或用途中，这些区室或用途尚不清楚。这里描述的调节机制授予激素和生长因子对辅酶A和乙酰辅酶A依赖性代谢和增殖的基本控制信号。未来的研究可以评估抑制PANK4磷酸酶活性以增加泛酸激酶相关神经变性患者的辅酶 A 合成或选择性抑制 PI3K 依赖性癌症的辅酶 A 合成的治疗潜力。
