异型泛素链在细胞周期和蛋白质量控制中的组装和功能

泛素链的翻译后修饰控制着所有真核生物的细胞命运。根据亚基之间的连通性，不同的泛素链类型功能不同，如K48-和k63 -连接的偶联物分别驱动蛋白质降解或复合物组装。最近的生化分析也表明了混合或支化泛素链的作用，但由于没有监测内源性偶联物的方法，异型聚合物的生理意义仍然知之甚少。在这里，我们设计了一种双特异性抗体来检测K11/K48链，并鉴定了有丝分裂调节因子、错误折叠的新生多肽和亨廷顿病理变异体作为其内源性底物。我们发现K11/K48链是由必要的泛素连接酶和在神经退行性疾病中发生突变的效应物合成和加工的; 因此，这些偶联物促进易于聚集的蛋白质的快速蛋白酶体清除。通过揭示K11/K48链在细胞周期和质量控制中的关键作用，我们建立了异型泛素偶联物作为重要的生物信息载体。

从K11-和k48单特异性抗体开始，我们使用旋钮入孔异二聚化技术制造了一种双特异性抗体，其中一只手臂识别k11 -泛素连锁，另一只手臂结合K48连锁(图1A)。作为对照，我们设计了K11/gD和K48/gD抗体，将泛素定向抗体臂与检测不相关病毒蛋白的抗体臂配对(图1A)。我们将这些抗体纯化至均匀性，并通过SDS-PAGE、分析尺寸排除层析、多角度光散射和质谱对其进行了表征(图1B)。这证实了我们已经设计和纯化了表现良好的抗体物种。

我们使用表面等离子体共振(SPR)来评估这些抗体对K11/K48支化泛素三聚体的特异性。在高密度的固定三聚体(700个反应单位[RUs])下，K11/K48双特异性抗体对K11/K48支化泛素的亲和力比K11/gD和K48/gD抗体高500- 1000倍。相比之下，K11/K11-或K48/K48-单特异性抗体结合K11/K48支链三聚体的亲和力与双特异性抗体相似，表明它们独立于分支识别它们的连锁。在较低的固定密度(150 RUs)下，双特异性抗体对K11/K48支链三聚体的亲和力略有降低，而对照抗体的亲和力不变。这表明，K11/K48双特异性抗体作为一个巧合检测器，从同时检测K11和K48键中获得了快速性。与这一观点一致，K11/K48双特异性抗体能够检测到固定的K11-和k48-连接的二聚体的1:1混合物，这模仿了分支泛素分子中这些连接的接近性，同时它对同型的K11-或k48连接的二聚体或四聚体表现出与对照双特异性抗体相似的低亲和力。

接下来，我们在western blot分析中测试了K11/K48双特异性抗体检测支化泛素偶联物的能力。值得注意的是，虽然K11/K48双特异性抗体有效识别K11/K48支链三聚体，但它无法检测单体或二聚体泛素，包括K11或k48连接的双泛素(图1C)。这种行为不同于K11/ K11-和K48/K48-单特异性抗体，它们结合含有同源连锁的泛素二聚体和三聚体，也不同于K11/gD和K48/gD对照抗体，它们在这些条件下不产生任何信号。K11/K48双特异性抗体对支链泛素变体表现出类似的选择性:虽然它很容易识别K11/K48支链三聚体，但它不能检测到K11/K63-、K48/K63-或M1/K63支链三聚体(图1D和1E)。使用工程连接系统，我们发现K11/K48双特异性抗体识别高分子量(MW) K11/K48连接的聚合物，比同型的K11-或k48-连接的聚合物更优先(图1F)。此外，我们使用高分子量K11/K48支链修饰的放射性标记底物来量化免疫沉淀条件下的抗体特异性。与SPR和western blot分析类似，K11/K48双特异性抗体对K11/K48支链的亲和力远高于K11/gD或K48/gD对照抗体(图1G)。

图1

我们首先使用K11/K48双特异性抗体来分析后期促进复合物(APC/C)的产物，APC/C是控制所有真核生物细胞分裂的E3。先前对泛素突变体的研究表明，APC/C用K11/K48支链标记底物，但APC/C是否在生理条件下产生这种偶联物尚不清楚。体外，依赖APC/ C的支链合成是由具有更广泛连锁特异性的E2启动的，如UBE2C，而分支是由K11和APC/ C特异性E2 UBE2S催化的。与这些研究一致的是，K11/K48双特异性抗体显示APC/C、UBE2C和UBE2S用K11/K48链标记其有丝分裂底物周期蛋白A(图2A)。APC/C依赖性异型链的产生需要相同浓度的UBE2C和UBE2S，这种情况在有丝分裂期间特别遇到。使用不同的底物securin或不同的起始E2 UBE2D3进行了类似的观察。

为了评估APC/C组装的泛素链拓扑结构，我们用泛素K11R 和K48R变体的混合物进行了体外反应。在这些条件下，APC/C可以产生近端同型链或混合聚合物，但不能产生支链共轭物，因为没有泛素分子同时含有K11和K48。独立于底物或启动E2, K11/K48双特异性抗体仅在APC/C与野生型泛素孵育时检测到泛素链，而在同时存在泛素K11R和泛素K48R的情况下检测不到泛素链。这些结果为APC/C合成K11/K48支链泛素提供了直接证据。

支持这些体外结果，我们在同步和显微镜实验中发现，当APC/C泛素化其大多数靶标时，有丝分裂期间K11/K48链的丰度增加(图2B)。我们没有在APC/C特异性E2 UBE2S缺失的有丝分裂细胞中检测到K11/K48连接链(图2B)，这表明在细胞分裂过程中，大多数K11/K48连接的聚合物附着在APC/C底物上。来自有丝分裂细胞的蛋白质组学分析重申了APC/C在K11/K48连接偶联物合成中的作用，因为与对照K11/gD和K48/gD免疫沉淀相比，APC/C的几种底物或调节剂在K11/K48双特异性亲和纯化中富集。候选底物包括在Lys490位点泛素化的APC/C共激活剂CDC20(图2C)。CDC20在该位点的修饰与纺锤体检查点沉默有关，这是一种体外由APC/C、UBE2S和支链泛素链引起的反应。

我们通过从有丝分裂细胞中变性纯化K11/K48支链，证实了内源性CDC20和细胞周期蛋白A的修饰(图2C)。通过天然亲和纯化，我们还发现内源性NEK2A被这些共轭物修饰(图2D)。我们检测到，如果蛋白酶体被抑制，APC/C底物的K11/K48特异性修饰增加(图2C和2D)，这与K11/K48支链在蛋白质降解中的作用一致。总之，这些结果在体内验证了K11/K48双特异性抗体，并首次表明，内源性蛋白被异型泛素链修饰。在有丝分裂过程中，K11/K48连接的偶联物包含多个K11连接链片段，由APC/C组装，并可能作为蛋白酶体靶向信号。

图2

K11/K48支链的发现依赖于对APC/C的生化分析，这种方法不能用于揭示由未知E3连接酶组装或在未表征的信号通路中起作用的异型聚合物的作用。作为一种替代策略，我们使用我们的双特异性抗体来筛选显示高水平K11/K48连接偶联物的条件，因此可能取决于它们的信号功能。我们发现，K11/K48连锁链在经历蛋白酶体、HSP70或HSP90的抑制导致的蛋白质毒性应激的细胞中积累(图3A)。其他几种引发强烈泛素化反应的情况，如DNA损伤、线粒体功能障碍、内质网过载或氧化应激，并没有引起K11/K48连锁链丰富度的全局增加。K11/K48连接聚合物的亲和纯化显示K11和高分子量K48键明显富集，但没有M1或K63键。总之，这些结果表明，蛋白毒性应激促进高分子量异型K11/K48连锁链的形成，这对细胞泛素库有重要贡献。

为了解剖在蛋白毒性胁迫下形成的泛素链的拓扑结构，我们从表达烟草蚀刻病毒(TEV)可切割泛素的细胞中纯化了K11/K48连接的偶联物。如前所述，用TEV蛋白酶处理含有泛素-TEV的偶联物会导致附着在野生型泛素分子上的每个亚基产生2-kDa的“印记”。支链的特点是泛素亚基被修饰在两个或多个赖氨酸残基上，因此显示两个或多个印记，而混合链或独立的同型聚合物只产生一个印记。我们发现细胞在蛋白毒性胁迫下可以高效地合成K11/K48支链(图3B)。正如其巧合检测机制所预期的那样，K11/K48双特异性抗体比用于比较的泛泛素抗体更有效地富集了支链泛素链。

为了表征细胞中K11/K48支链的形成，我们观察到抑制HSP70或HSP90会导致错误折叠和易聚集蛋白的积累。由于聚集体仍然被泛素化所识别，但不被降解机制所识别，因此可以在体内研究附着在错误折叠蛋白上的泛素标记。与我们在裂解物中的实验一致，抑制HSP70和HSP90触发了细胞质聚集体的形成，这些聚集体被K11/K48链广泛装饰(图3C)。我们在293T细胞、未转化的人胚胎干细胞(hESCs)、神经元前体和分化神经元中检测到类似的K11/K48阳性聚集物。这些发现表明，多种细胞类型通过产生K11/K48支链来响应聚集倾向蛋白的积累。

很大一部分HSP70和HSP90客户端是新合成的蛋白，从核糖体释放后不能折叠。即使多次尝试伴侣辅助折叠，仍未达到其天然构象的蛋白质也会被泛素-蛋白酶体系统迅速降解。表明K11/K48特异性质量控制主要针对这些新生多肽，环己亚胺、艾美汀或三尖杉碱抑制mRNA翻译阻止了K11/K48连接的偶联物的积累(图3D)，在这些条件下没有检测到K11/K48阳性聚集物(图3C)。相比之下，a-amanitine对转录的抑制没有效果(图3C和3D)，环己亚胺处理并没有在有丝分裂过程中消除K11/K48链的形成，当这些偶联物标记APC/C靶向的细胞周期调节因子时。为了直接检测新生蛋白的修饰，我们用嘌呤霉素处理细胞，嘌呤霉素被整合到新生链中，并从核糖体中释放错误折叠的蛋白质。特异性链类型的变性和天然亲和纯化表明，嘌呤化的蛋白被K11/K48连接的偶联物强烈标记(图3E)，并且嘌呤化的多肽被募集到K11/K48连接链阳性的聚集体中(图3F)。从这些集体结果中，我们推断细胞用K11/K48连接的泛素链修饰新合成的和错误折叠的蛋白质。

图3

先前的研究表明，质量控制网络将多达15%的新合成蛋白质导向泛素和蛋白酶体依赖性降解，但尚未确定该途径的E3连接酶或泛素结合蛋白。我们发现新生蛋白被K11/K48支链修饰，这为发现这种质量控制网络的成分提供了一个机会:我们假设效应物，如伴侣或蛋白酶体穿梭体，结合泛素化的靶标，而E3连接酶可能用它们转移到底物上的相同的K11/K48连接的偶联物修饰自己。

因此，我们使用无标记定量质谱法分离出与K11/gD和K48/gD对照免疫沉淀相比，K11/K48中富集的蛋白。为了关注质量控制而不是细胞分裂，我们在puromycin处理的APC/C活性很少或没有APC/C活性的异步细胞中进行了这些实验。我们发现HSP90以及核糖体相关伴侣BAG6在K11/K48特异性亲和纯化中富集(图4A)。HSP70在这些沉淀中也很丰富，然而，由于高背景结合，与对照反应相比，它没有被富集。此外，我们注意到E3s UBR4、UBR5和HUWE1的富集(图4A)，而APC/C(主要在有丝分裂期间活跃)、Listerin或ZNF598(修饰停滞核糖体上的蛋白质)、CHIP（它可以泛素化HSP70或HSP90客户端）没有结合。作为K11/K48连锁链的效应体，我们鉴定了p97/VCP分离酶及其受体，包括NSFL1/p47;蛋白酶体穿梭体，如UBQLN家族;少量的p62/SQSTM1（与蛋白酶体和自噬体传递有关）;26S蛋白酶体(图4A)。相比之下，我们没有恢复任何E3连接酶、去泛素化酶或具有M1-或k63 -连锁特异性的效应物，这强调了我们的抗体和方法的特异性。

我们通过亲和纯化和western blotting验证了这些结果，证实了K11/K48连锁链与内源性p97、BAG6、UBQLN2、p62、UBR5和HUWE1的强相互作用(图4B)。BAG6、p62和UQBLN2仅在新蛋白合成时结合K11/K48链，而E3s的UBR5和HUWE1在环己亚胺存在时富集。如果E3连接酶的纯化是由于K11/K48链的自修饰，则后一种行为是预期的。蛋白酶体和p97/VCP受体或内源性BAG6、p62或p97/VCP的互亲和纯化证实，这些蛋白有效地沉淀了K11/K48链(图4C)，并且，从泛素-TEV的表达中可以看出，蛋白酶体和p97/VCP接头与泛素链分支有效地相互作用(图S5C)。BAG6、UBR5、p97/VCP、p62和HSP90也以K11/K48阳性聚集体积累(图4D)，而与应激颗粒形成标志物未发现共定位。

图4

在这个质量控制网络的候选组分中，我们对少量在K11/K48特异性亲和纯化中富集的E3连接酶很感兴趣(图4A)。这一观察结果提高了我们鉴定蛋白质毒性应激过程中产生K11/K48支链的主要酶的可能性。事实上，通过耗尽候选E3的组合，我们发现UBR4和UBR5的缺失，使用多个小干扰RNA (siRNA)序列来确保靶特异性，足以抑制蛋白质毒性应激细胞中大多数K11/K48连锁链的形成(图5A)。同样的处理强烈稳定了嘌呤化的蛋白(图5B)。相比之下，在我们的蛋白质组学研究中未富集的Listerin或APC/C-E2 UBE2S的缺失并不影响K11/K48支链的产生，也不会延长嘌呤环化蛋白的半衰期。由于有丝分裂过程中K11/K48连锁链的形成需要UBE2S(图2B)，这些结果强调了不同的酶在有丝分裂和蛋白毒性应激时分别产生K11/K48连锁链。

为了确定UBR4和UBR5是否合成K11/K48连锁链，根据这些遗传分析，我们使用CRISPR/Cas9基因组编辑将FLAG表位整合到UBR4和UBR5位点中。重要的是，UBR4和UBR5复合物都在体外合成了K11/K48链，其中HECT-E3 UBR5是更有效的酶(图5C)。用泛素K11R和泛素K48R的混合物孵育表明，UBR5产生了支化的泛素链(图3B)，而UBR4似乎合成了包含多个键的混合链(图5C)。我们通过泛素-TEV实验证实了UBR5非常有效地形成了支链泛素偶联物(图5D)，并直接表明UBR5与K11特异性酶合作产生了K11/K48支链三聚体(图5E)。通过使用单赖氨酸泛素突变体，我们注意到内源性UBR5对泛素的赖氨酸48表现出惊人的偏好(图5F)，这表明它产生包含多个k48链块的支链偶联物。

重组K11/K48支链结构使我们能够分析泛素效应剂对这些共轭物的检测。因此，我们使用UBR5生成K11/K48支链或同型k48连接聚合物，并将这些偶联物与固定化蛋白酶体或p97/VCP底物接头孵育。与有丝分裂的K11/K48支链类似，我们发现蛋白酶体底物接头HHR23A和p97/VCP接头NSFL1/p47，两者在我们的蛋白质组学分析中都被确定为效应物，与K11/K48支链结合的亲和力远高于同型的k48链(图5G)。与这些结果一致，蛋白酶体抑制强烈稳定了细胞中嘌呤化蛋白和K11/K48连锁链(图5H)。因此，UBR4和UBR5是关键的质量控制E3连接酶，它们用K11/K48支链修饰靶标，从而允许分离酶p97/VCP和26S蛋白酶体有效识别底物。

图5

最近的CRISPR/Cas9筛选已经鉴定出K11/K48特异性质量控制的成分，包括E3s UBR4和UBR5，是人类细胞中必需的蛋白质，小鼠中UBR4或UBR5的缺失会导致早期死亡。此外，这种质量控制网络的酶或效应物的突变与神经退行性疾病有关，如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏病(HD)或共济失调。这表明K11/K48特异性质量控制可能是防止神经毒性蛋白积累的重要途径。为了验证这一观点，我们将重点放在HD上，HD是由HTT中的CAG-repeat扩增引起的，该扩增产生的亨廷顿蛋白(HTT)在其N端结构域具有超过35个谷氨酰胺残基。UBR5最近被确定为HD发病年龄的候选遗传修饰因子。重复相关的非ATG翻译HTT产生类似BAG6底物的肽，HTT聚集增加了附着在未知底物上的K11和K48键的水平。最重要的是，对K11/K48泛素化蛋白的研究发现，在四个独立的实验中，内源性HTT在Lys337位点被修饰。与这些观察结果一致，在癌细胞、胚胎干细胞或分化的神经元中，病理性73Q-HTT聚集体被K11/K48连锁链强烈修饰(图6A-6C)。73Q-HTT的表达，而不是良性的23Q-HTT，也诱导了这些细胞中K11/K48连锁链的整体增加。在HD小鼠模型的大脑中也进行了类似的观察，但没有过度表达，其中175Q-HTT聚集体用K11/K48连接的偶联物标记(图6D)。

因此，K11/K48双特异性抗体不仅在生化实验或细胞培养中检测其表位，而且在组织中也检测其表位。HTT的变性纯化以及泛素链的天然沉淀强烈表明，73Q-HTT被K11/K48链修饰，而23Q-HTT则不那么明显(图6E)， UBR4和UBR5的共消耗减少了这一修饰。将HTT的变性纯化与泛素- TEV的表达结合，我们发现73Q-HTT被支链修饰，而23Q-HTT没有被支链修饰(图6F)。与这些结果一致，73Q-HTT绑定BAG6，以及BAG6、UBQLN2、p62和p97被有效地招募到73Q-HTT的K11/K48阳性聚集体中(图6G)。与73Q-HTT相比，在这些条件下，引起ALS的FUS变异未标记K11/K48连锁链。我们得出结论，病理性HTT变异，但并非所有易于聚集的蛋白，都是由K11/K48特异性质量控制处理的。

图6

这些结果提出了一个有趣的可能性，即容易聚集的蛋白如何加速神经退行性疾病的进展:如果K11/K48特异性质量控制的负载能力有限，病理性HTT的表达可能会对新合成蛋白的加工产生负面影响，反之亦然。为了验证这种可能性，我们在hESCs或神经元中表达73Q-HTT以形成K11/K48阳性聚集体。然后，我们抑制蛋白酶体或HSP70来稳定错误折叠的新生多肽，并询问后者的质量控制底物的积累是否影响73Q-HTT的泛素化或加工。引人注目的是，蛋白酶体或HSP70抑制导致K11/K48链从73Q-HTT重新分布到不同的聚集体，这依赖于正在进行的蛋白质合成(图7A, 7B)。K11/K48特异性质量控制的其他组分遵循泛素信号:虽然BAG6和UBQLN2在对照细胞中标记73Q-HTT聚集，但在HSP70或蛋白酶体抑制下，共定位丢失，并且需要产生新的蛋白才能达到这种效果(图7C)。K11/K48连接链向新生蛋白的重定向降低了细胞抵抗聚集的能力:BAG6的缺失不仅延迟了嘌呤环化蛋白的清除，而且增加了73Q-HTT灶的数量(图7D)。因此，73Q-HTT和新合成的蛋白质竞争有限的酶或K11/K48特异性质量控制机制的效应器。

图7