点击蓝字 关注我们
简介
蛋白质水解靶向嵌合体（PROTACs）是一种降解疾病相关蛋白的新兴技术。作者团队报道了基于碳点（CD）的PROTACs（CDTACs），它通过泛素-蛋白酶体系统降解膜蛋白，与细胞程序性死亡配体1（PD-L1）结合，募集CRBN，诱导PD-L1泛素化，并通过蛋白酶体对其进行降解。与传统的基于小分子的PROTACs相比，CDTACs具有多种优势，如有效的膜蛋白降解、靶向肿瘤积聚、免疫系统激活和体内检测。
知识背景
PD-L1/PD-1：PD1位于T细胞，能够与基质细胞中的PDL1结合，两者结合后使T细胞失去攻击肿瘤细胞的能力。PDL1与PD1的结合作为介导T细胞活化的共抑制信号，抑制T细胞的杀伤功能，对人体免疫应答起到负调节作用。在正常细胞中，PD1的激活使T细胞失去攻击能力，它在减轻由于慢性感染引起的组织损伤方面起着重要作用，这种机制是为保护机体在炎症状态时免受不必要的组织损伤。
PD-1/PD-L1抗体药物自2014年上市以来，迅速开创了肿瘤免疫的辉煌时代。美国免疫学家James P. Allison与日本免疫学家本庶佑也因此荣获2018年诺贝尔奖；商业方面，PD-1/PD-L1抗体药物在2018年实现163亿美元销售额，成为仅次于TNFα的第二大抗体药物靶点。
FMD饮食（fasting-mimicking diet，空腹模拟饮食）：该饮食方式由Valter D. Longo在2012年提出。是以植物饲料为基础，限制热量的低糖、低蛋白质和高脂肪的饮食结构，并呈周期性交替进行，以防止或尽量减少瘦肉质量损失。这种饮食方式可以减缓肿瘤进展和不同类型的肿瘤对化疗的敏感性，同时保护正常细胞免受化疗毒性副作用。
摘要
禁食模拟饮食（FMD）能够增强细胞的摄取能力和蛋白酶体的活性。CDTACs可分别降解CT26、B16-F10肿瘤细胞中99%或90%以上的PD-L1。此外，CDTACs可以激活干扰素刺激因子（STING）通路，从而引发免疫反应。因此，CDTACs与FMD联合治疗可有效抑制CT26和B16-F10肿瘤的生长。
介绍
免疫检查点阻断（ICB）是一种利用免疫系统识别和消除肿瘤细胞的创新疗法。细胞程序性死亡蛋白1（PD-1）/细胞程序性死亡配体1（PD-L1）抑制剂目前已显示出显著的临床疗效。但只有少数患者能够长期受益于PD-1/PD-L1的ICB治疗。肿瘤免疫微环境在ICB的治疗中发挥着至关重要的作用。免疫抑制性微环境耗尽或限制了细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的浸润和杀伤作用，导致ICB治疗的临床反应不佳。因此，迫切需要重塑免疫抑制性肿瘤微环境（TME）策略来进行ICB治疗。
目前，已经开发出多种药物来抑制PD-1/PD-L1通路，例如抗体或小分子。通常，这些抑制剂只阻断PD-L1和PD-1之间的相互作用，而不会降解它们。蛋白质水解靶向嵌合体（PROTACs）是靶蛋白降解的有用工具，由两个连接到接头的配体组成。一个配体识别并结合靶蛋白，而另一个配体募集并结合E3连接酶，以诱导靶蛋白的泛素化，从而被泛素-蛋白酶体系统降解。然而，由于泛素-蛋白酶体系统分布在细胞质中，膜蛋白不被认为是PROTAC的理想靶点。目前，有研究人员开发了一种抗体偶联的糖肽配体，通过受体介导的内化将膜蛋白拖入溶酶体，从而降解细胞外和膜蛋白，即LYTACs。在另一项研究中，基于抗体的PROTAC通过溶酶体降解细胞表面蛋白。
为了利用泛素-蛋白酶体系统有效降解膜蛋白，我们报道了基于碳点（CD）的PROTACs（CDTACs）降解肿瘤细胞中的PD-L1蛋白。CDs由于其独特的特性，如生物相容性、光稳定性和方便修饰，在生物医学应用中得到了广泛的研究和应用。将PD-L1、E3连接酶靶向探针与CDs偶联，分别靶向PD-L1和CRBN。与小分子不同，这种纳米级CDTAC可以有效地在肿瘤部位积累，这可能是由于强渗透和滞留效应（EPR）以及PD-L1的主动靶向作用（图1a）。CDTACs首先与分布在肿瘤细胞上的PD-L1结合，并通过内吞作用转运到溶酶体（图1b）。PD-L1随后在溶酶体中降解，CDTAC从溶酶体中释放出来。细胞质中的CDTAC识别新合成的PD-L1并诱导其泛素化。此外，本研究中采用的禁食模拟饮食（FMD）不仅增强了CDTACs的细胞摄取和胞内积聚，还增加了泛素化和蛋白酶体的活性。
作者还发现CDTACs可以激活干扰素刺激因子（STING）途径，促进树突状细胞（DCs）成熟并重塑免疫抑制性TME（图1a）。总之，CDTACs在体内外都能够有效降解CT26和B16-F10肿瘤细胞中的PD-L1，并激活免疫系统以增强肿瘤免疫治疗。
图1
结果和讨论
1. CDTACs的设计和验证
将谷胱甘肽（GSH）与甲酰胺混合，并在160°C下进行溶剂热处理4小时，合成CDs（图2a）。然后使用硅胶柱色谱进行纯化。使用高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）研究CDs的形态：其平均尺寸约为3.0 nm，呈圆形结构（图2b–c）。X射线光电子能谱（XPS）证实了CD中存在碳、氮和氧元素。茚三酮反应证实了CDs上形成的α-氨基酸基团，在570nm处显示出吸附峰。
然后将PD-L1和CRBN靶向探针（分别为BMS-1166和沙利度胺）连接到CDs上的氨基上。如图2-e所示，CDTACs具有与CDs相似的结构，但尺寸略有增加。CDTACs的HRTEM图像显示0.21 nm的晶格间距，这与石墨烯的晶格间距一致（图2f）。BMS-1166与沙利度胺部分的成功结合被FTIR证实。靶向探针的偶联也没有显著改变CDs的荧光特性。CDs和CDTACs的紫外可见吸收峰在近红外区域表现出相似的吸收峰（NIR，图2G）。CDs和CDTACs分别在700 nm和690 nm处显示出一个荧光发射峰（图2h）。这些数据证实了CDTACs是通过将PD-L1和CRBN靶向探针偶联到CDTACs上成功开发的。
利用独特的荧光特性，可以精确地跟踪CDTACs的细胞摄取和细胞内分布。与CT26肿瘤细胞孵育12 h后，大部分CDs或CDTACs（红色荧光）与内溶酶体/溶酶体（绿色荧光）融合，表明CT26肿瘤细胞通过溶酶体介导的内吞作用摄取CDs或CDTACs。此外，本研究采用FMD处理来增强CDTACs的细胞摄取。与正常组相比，FMD培养基中培养的CT26肿瘤细胞中CDs或CDTACs的荧光强度更强（NOR）。流式细胞术进一步验证了这些结果，证实FMD显著增加了CDs或CDTACs的细胞摄取。当与B16-F10肿瘤细胞一起培养时，大多数CDs或CDTACs分布在内溶酶体/溶酶体中，FMD处理显著增加了CDTACs的细胞摄取。
图2
2、CDTACs靶向降解膜蛋白PD-L1
Western blotting结果显示，CDTACs对CT-26细胞中的PD-L1降解呈浓度依赖性（图3A）。靶向探针的密度对PD-L1的降解效率有很大的影响，当质量比为2:1:5时，PD-L1的降解曲线最佳（图3a）。同样，与质量比为2:1:5的CDTACs孵育后，B16-F10肿瘤细胞中的PD-L1也被显著降解（图3b）。CDTACs能够在CT26细胞中诱导PD-L1的有效降解，半数降解浓度（DC50）为0.35 ~ 0.03 μM，最大降解百分比（Dmax）为97.5 ~ 0.5%（图3c，基于图3a)。CDTACs作用24 h后，B16-F10肿瘤细胞的DC50为0.39 μM ~ 0.06 μM，Dmax为75.7 μM ~ 3.8%（图3c）。PD-L1的免疫荧光染色也证实了CDTACs处理的CT26或B16-F10肿瘤细胞中PD-L1的有效降解（图3d）。人肺腺癌细胞系（A549）证实了CDTAC的PD-L1降解能力。
图3
3、FMD处理增强了CDTACs对PD-L1的降解效果
基于CDs的PROTACs可以有效地诱导肿瘤细胞中PD-L1蛋白的降解。FMD处理增强了PD-L1的降解效果。如图3a-d所示，CDTACs在CT26和B16-F10肿瘤细胞中对PD-L1的降解增强，DC50分别降至0.29 μM ~ 0.06 μM和0.33 μM ~ 0.03 μM。在FMD条件下，PD-L1对CT26和B16-F10的Dmax分别增加到99.4±0.4和90.4±3.0%（图3c）。除了增强细胞摄取外，其他机制也有助于有效降解。FMD处理的CT26和B16-F10肿瘤细胞中泛素化总蛋白明显增加，提示FMD处理的肿瘤细胞中泛素化可能增强。虽然FMD或CDTACs治疗不影响肿瘤细胞中蛋白酶体的表达，但FMD治疗显著增强了蛋白酶体的蛋白水解活性，这可能导致更好的PD-L1降解。CDTACs或FMD治疗不影响PD-L1 mRNA表达水平。总之，FMD治疗可以增强细胞对CDTACs的摄取，并激活泛素蛋白酶体系统，以有效降解靶蛋白。
4、CDTACs降解PD-L1的机制
为了确定溶酶体或泛素蛋白酶体系统对蛋白质降解的贡献，合成靶向PD-L1或CRBN探针修饰的CDs（CDs-PD-L1或CDs-CRBN），并与CT26和B16-F10肿瘤细胞孵育。在用CDs-PD-L1、CDs-CRBN或混合物处理的肿瘤细胞中，PD-L1降解最小。此外，CDTACs与蛋白酶体抑制剂或CRBN复合物抑制剂一起孵育以检测降解效率。与这些抑制剂孵育后，PD-L1的降解被完全阻断。用A549肿瘤细胞验证了这一点。应用小干扰RNA（siRNA）敲低CRBN的表达，能够抑制CDTACs对PD-L1的降解。这些结果表明，仅将PD-L1拖入溶酶体不能有效地降解PD-L1，泛素蛋白酶体系统的募集至关重要。最后，我们评估了CDTACs暴露不同时间后CT26和B16-F10肿瘤细胞中PD-L1的表达，以考察其降解效率。如图3e所示，CDTACs在CT26和B16-F10肿瘤细胞培养1小时后就明显下调PD-L1的表达，显示了CDTACs的强降解能力。另外，BMS-1166或CDTACs对CT26肿瘤细胞或人脐静脉内皮细胞（HUVECs）没有细胞毒性。
5、CDs通过激活STING通路促进DCs成熟
免疫抑制性TME限制了CTLs的浸润和杀伤作用，阻碍了基于PD-L1的ICB治疗的疗效。作者发现合成的CDs可以促进DCs的成熟，而DCs在CTLs启动中起关键作用。流式细胞术分析显示（图4a-b），CD86或CD80阳性的DCs与CDs孵育后显著增加（这是成熟DCs的重要标志）。与对照组相比，CDTACs处理的DCs中CD86或CD80阳性DCs的百分比增加（图4a-b）。FMD治疗进一步促进了DCs的成熟，特别是在CDTACs组（图4a-b）。定量分析证实，CDs或CDTACs治疗显著增加CD86或CD80阳性DCs的百分比，并在FMD治疗时进一步增强（图4c-d）。为了研究潜在的机制，我们研究了与CDs或CDTACs孵育后DCs中的STING途径。如图4e所示，Western Blotting结果显示，CDTACs或CDs处理DCs后，细胞内的磷酸化STING（P-STING）表达上调，尤其是FMD条件下。STING通路的激活也可以通过其泛素化而增强。FMD处理会增强DCs中蛋白的泛素化。P-STING的上调导致磷酸化TBK1（PTBK1）表达增加，进而促进IRF3（PIRF3）的磷酸化，图4e。在FMD培养基中培养的CDs或CDTACs处理的DCs中，干扰素β（IFN-β）分泌也显著增加（图4f）。I型干扰素是成熟DCs分泌的T细胞启动的关键细胞因子。这些实验结果是目前第一个证明CDs可以激活STING通路促进DCs成熟的研究（图4g）。
图4
6、体内实验证实CDTACs的抗肿瘤作用
利用近红外荧光发射技术和动物全身成像系统研究了CDTACs在CT26荷瘤小鼠体内的分布。如图5a所示，静脉注射后2小时，CDTACs在肿瘤部位有效积累。肿瘤部位的荧光强度在6或12 h时逐渐增加，但在24 h时下降。有趣的是，在FMD治疗的第1天给小鼠50%低热量的饮食，第2天给小鼠90%低热量的饮食，CDTACs的肿瘤积累进一步增加（图5a）。这些观察结果通过离体成像得到验证，在CDTACs和FMD治疗的肿瘤中显示出很强的荧光强度。定量分析显示，FMD治疗显著增加了CDTACs在肿瘤中的积累（图5b）。
图5
接下来，作者利用CT26肿瘤模型研究CDTACs的抗肿瘤能力。在第9天、第13天、第17天和第21天静脉注射CDTACs，同时在药物治疗前一天给小鼠喂食50%低热量的饮食，在接下来的两天里给小鼠喂食90%低热量的饮食，记录小鼠的体重。结果显示CDTACs和盐处理的小鼠体重之间没有显著差异。值得注意的是，小鼠的体重在FMD治疗期间显著下降，但在正常饮食喂养后立即恢复。在FMD治疗期间，小鼠血糖也有所下降，但可以通过正常饮食恢复。肿瘤生长曲线显示，CDs或BMS-1166抑制CT26肿瘤的生长，可能是由于激活STING通路或抑制PD-L1（图5c）。重要的是，CDTACs比其他组更能抑制CT26的肿瘤生长（图5c）。FMD治疗显著增强了CDs或CDTACs的抗肿瘤能力，这应该是由于更好的肿瘤积累（图5c）。如图5d所示，在FMD条件下，CDTACs治疗小鼠的治疗效果最好。肿瘤组织H&E染色显示，FMD治疗的CDTACs组肿瘤呈广泛性坏死（图5e）。
7、体内实验验证CDTACs能够降解PD-L
作者使用免疫组化染色和Western Blotting检测PD-L1在CT26肿瘤模型中的表达。如图5f所示，生理盐水、CDs或BMS-1166均未影响肿瘤细胞中PD-L1的表达。CDTACs显著下调PD-L1的表达，特别是与FMD联合治疗时（图5f），这表明CDTACs可以在体内降解膜蛋白。同样，Western Blotting分析证实CDTACs在CT26肿瘤中有效降解PD-L1，而其他治疗无效。如图5g所示，CDs或CDTACs上调了P-STING和PIRF3的表达。
利用流式细胞术研究肿瘤中的CD8+ T细胞。如图5h-i所示，CDTACs和FMD治疗后，肿瘤中CD8+ T细胞的百分比明显增加。CDTACs引起分泌IFN-γ和TNF-α的细胞毒性T细胞百分比也显著增加（图5i）。这表明CDTACs诱导细胞强烈的适应性免疫反应。接下来，作者通过流式细胞术评估了脾脏中T淋巴细胞的丰度，与其他组相比，CDTACs处理小鼠中分泌IFN-γ或TNF-α的T细胞的百分比增加。相比之下，CDTACs处理的小鼠肿瘤或脾脏中免疫调节性IL-4或IL-10分泌显著减少，表明CDTACs可用于重塑免疫抑制性TME。
为了证实PD-L1降解的重要性，作者进一步用CDs-PD-L1治疗小鼠。肿瘤生长曲线证实，在正常或FMD条件下，CDs-PD-L1均能有效抑制肿瘤生长。与BMS-1166组相比，CDs-PD-L1显著降低肿瘤重量，但效果不如CDTACs。流式细胞术结果还显示，CDs-PD-L1增加了肿瘤中CD8+ T细胞的浸润，但低于CDTACs。将CDTACs组分离的CD8+ T细胞与CT26肿瘤细胞进行体外培养。BMS-1166处理增加了T细胞与CT26肿瘤细胞的结合，与CDs结合后也显示出类似的效果。重要的是，更多的T细胞附着在CDTACs。因此，BMS-1166或CDs- PD-L1治疗增加了T细胞对CT26肿瘤细胞的细胞毒性，但不如CDTACs治疗有效，证实了PD-L1降解的重要性。检测炎性细胞因子也证实CDTACs能够触发T细胞分泌IFN-γ或TNF-α，且水平高于其他组。沙利度胺是一种影响IFN-γ分泌的免疫调节药物。接下来作者检测了游离沙利度胺的抗肿瘤能力。与生理盐水治疗相比，沙利度胺对肿瘤生长的影响最小（图5c-d）。肿瘤中CD8+ T细胞的变化也不明显，尤其是IFN-γ+ CD8+ T细胞。血清中IFN-γ的检测证实，与其他组相比，CDTACs表现出最高水平的IFN-γ。最后采集主要器官，H&E图像未见明显损伤。综上所述，这些结果表明CDTACs具有显著的抗肿瘤能力，且无明显的副作用。
8、利用B16-F10荷瘤小鼠模型双重验证CDTACs的抗肿瘤作用
有相关研究表明B16-F10肿瘤模型对PD-L1/PD-1治疗不敏感。为了研究CDTACs的抗黑色素瘤能力，B16-F10荷瘤小鼠分别用生理盐水、CDs、BMS-1166或CDTACs（FMD和非FMD饮食）一起治疗。BMS-1166或CDs治疗均未显著影响B16-F10肿瘤的生长，证实B16-F10肿瘤对PDL1抑制剂无反应。无论是否接受FMD治疗，CDTACs都能强烈抑制B16-F10肿瘤的生长。CDTACs治疗的B16-F10肿瘤中观察到广泛的坏死。这些数据表明，CDTACs可以使B16-F10肿瘤对基于PD-L1的ICB治疗敏感。
免疫组化染色显示，CDTACs组FMD治疗后B16-F10肿瘤中PD-L1明显死亡。Western blotting进一步证实了这一点，显示CDTACs治疗的肿瘤中PD-L1发生了降解。CDs组P-STING和P-IRF3的表达略有增加，而CDTACs明显上调了它们的表达，这可能是B16-F10肿瘤对PD-L1为基础的ICB治疗增敏的机制。CDTACs治疗在B16-F10肿瘤中诱导CD8+ T细胞浸润最强。通过检测促炎细胞因子的分泌，进一步研究CDTACs刺激的免疫应答。与CDs或BMS-1166组相比，CDTACs显著增加了TNF-α、IFN-γ和IL-6的分泌，提示CDTACs触发了小鼠的免疫反应。与CT26肿瘤模型类似，CDTACs治疗没有显著改变小鼠的体重。虽然FMD治疗减轻了体重，但它们在正常饮食喂养后立即恢复)。H&E染色显示，FMD、CDTACs或联合治疗均未对主要器官造成明显损伤，证实了CDTACs与FMD治疗的生物安全性。综上，CDTACs有效地触发了B16-F10肿瘤细胞的免疫应答并降解了PD-L1，从而产生了显著的抗肿瘤效率。
结论
在这项研究中，作者开发了一种独特的CDTACs，其通过泛素蛋白酶体系统降解膜蛋白（PD-L1）。由于肿瘤细胞倾向于通过内吞作用吸收纳米材料，CDTACs可以结合膜PD-L1并将其拖入内溶酶体。然而，PD-L1在溶酶体中的降解并不明显，CDTACs招募CRBN与蛋白酶体有效降解PD-L1。此外，FMD治疗不仅增强了肿瘤细胞对CDTACs的细胞摄取，而且还增加了蛋白酶体的活性。CT26或B16-F10肿瘤细胞中超过99%或90%的PD-L1分别被CDTACs降解。CDs或CDTACs激活细胞中的STING通路，从而促进DCs成熟和T细胞启动。值得注意的是，FMD治疗显著增强了肿瘤积累，促进了CDTACs诱导的免疫反应。因此，CDTACs与FMD治疗有效抑制CT26和B16-F10肿瘤的生长，无明显的全身毒性。与基于小分子的PROTACs相比，CDTACs具有膜蛋白降解、肿瘤积累、免疫系统激活和荧光体内跟踪等多重优势，这可能为推进PROTAC技术在肿瘤治疗中的应用提供新的策略。
责编：吕鉴可
