缺氧诱导的肿瘤炎症细胞死亡的机制研究

本篇文章报道PTP1B和ABL1/2相互控制RNF213酪氨酸磷酸化，并因此控制其寡聚化和RZ结构域激活。确定了一种独特的、潜在靶向的PTP1B–RNF213–CYLD–SPATA2通路，该通路对于控制缺氧性肿瘤中的炎症细胞死亡至关重要，对烟雾病、炎症性疾病和自身免疫性疾病的发病机理具有潜在的影响。

肿瘤具有低氧或缺氧区，且能够通过激活几种信号通路来适应肿瘤微环境中的低氧状态。

蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B (PTPN1)定位于胞质内网，在此调节进入的受体酪氨酸激酶和细胞因子受体。PTP1B的缺乏/抑制使HER2+乳腺变得敏感。没有HIF、内质网应激或AMPK途径的干扰下，当O₂浓度小于等于1%时，PTP1B的的缺失或抑制能够敏感HER2+乳腺癌细胞致其死亡。而低氧超敏反应也需要RNF213，RNF213以依赖AAA-ATPase和ISG15的方式六聚化、定位于脂滴并介导溶血磷脂酸诱导的细胞死亡。此外，前人研究表明RNF213也会参与NF-κB信号传导。

本篇文章发现了一种独特的机制，PTP1B和RNF213通过这种机制指导缺氧条件下的细胞焦亡，这对于癌症、烟雾病(MMD)和炎症/自身免疫性疾病的发病机理具有潜在的意义。

1.  RNF213受PTP1B/ABL调控

PTP1B缺陷或抑制的HER2+乳腺癌细胞对缺氧高度敏感。而PTP1B抑制剂克拉明不影响正常氧细胞存活率。克拉明能够选择性地增强了几种雌激素受体阳性、三阴性乳腺癌细胞系以及代表其他癌组织类型的试验细胞系在缺氧状态下的死亡。因此，PTP1B是一种更普遍的低氧反应调节剂。

RNF213在HER2+细胞中能够被酪氨酸磷酸化，在与‘底物捕获’相互作用下PTP1B的突变体的比与野生型相互作用更强。这种相互作用能够被原钒酸盐竞争，表明RNF213是PTP1B底物。然而，在PTP1B抑制/缺陷细胞中，整体RNF213酪氨酸磷酸化水平并没有明显增加，这表明只有选择的位点是PTP1B靶点。

通过实验验证进一步发现了RNF213的第1275位氨基酸(Tyr-1275)是PTP1B催化的去磷酸化位点。PTP1B的缺乏/抑制增加依赖于RNF213的整体泛素化。Tyr-1275不受RING和RZ-domain的监管。为了确定磷酸化RNF213-Y1275的激酶，测试了选择的酪氨酸激酶抑制剂的作用。ABL抑制剂(达沙替尼和阿西米尼)消除了敲除PTPN1的BT474和SKBR3细胞中的低氧超敏反应。BCR-ABL是PTP1B底物，提示PTP1B和ABL1/2的双向调节。达沙替尼也降低了PTP1B-诱捕突变IPs中RNF213的回收。

因此，PTP1B和ABL1/2控制RNF213 Tyr-1275，且其磷酸化促进RNF213寡聚化和低氧超敏反应。

图1 Tyr-1275磷酸化促进RNF213寡聚化

2.  RNF213泛素化CYLD和SPATA2

为了鉴定RNF213互作因子，将RNF213分别连接在Turbo的N端或C端，重组到RNF213-KO的重组酶HeLa细胞中，通过质谱分析比较发现，C-Turbo标记了已知与RNF213相互作用的PTP1B(PTPN1)和USP15还有几种新的蛋白质，包括主要的K63-去泛素化酶和NF-κB调节子CYLD及其相互作用蛋白SPATA2。

鉴于它们在NF-κB应答、炎症和先天免疫中的作用，研究人员重点研究了CYLD/SPATA2与RNF213的相互作用。实验证实了C-Turbo对CYLD、SPATA2和PTP1B的标记，CYLD和SPATA2也与在敲除RNF213并敲低PTPN1的BT474细胞中共免疫沉淀。值得注意的是，缺氧并不影响RNF213和CYLD/SPATA2之间的相互作用，且CYLD和SPATA2转录不受PTP1B缺陷的干扰。敲除CYLD或SPATA2使BT474和SKBR3细胞对于缺氧的敏感性甚至高于单独敲除PTPN1(图2c，d)。因此，RNF213能够与CYLD和SPATA2相互作用防止乳腺癌细胞中的缺氧超敏反应。

通过在敲除了RNF213的BT474和AU5565细胞中共表达了SPATA2或CYLD和HA-泛素,并用克拉明(10µM)或赋形剂处理后，结果正如所料，克拉明增加了整体泛素化(图2e，左)。CYLD和SPATA2显示RNF213依赖性泛素化， PTP1B抑制反而增强(图2e)。接下来通过评估RNF213及其突变体体外泛素化CYLD和SPATA2的能力，发现SPATA2和CYLD被RNF213泛素化。

RNF213具有RING和RZ泛素连接酶结构域(图2g)。只突变RZ (RNF213^H4014A)后CYLD或SPATA2并没有明显泛素化。但是，当只突变RING(RNF213^H4014A)后，CYLD和SPATA2泛素化增加(图2i)。为了弄清RING是否负调控RZ结构域，我们比较了RNF213^WT和RNF213^{H4014A/H4509A}(RING/RZ-dead)的泛素化。事实上，缺失RING/RZ的RNF213不能泛素化CYLD/SPATA2(图2j)。结果证实了RZ催化的CYLD泛素化。当K63R-UB用作底物时，CYLD和SPATA2泛素化减少。因此，RNF213催化CYLD和SPATA2泛素化，RZ倾向于通过K63泛素链泛素化，且RING能够限制RZ活性。因此，RING dead(或RING受损)突变是RNF213 RZ的功能获得突变体。

以前报道过，RING死的RNF213或高渗透性MMD单核苷酸多态性(SNPs)降低了HeLa或293 T细胞的整体泛素化，并作为显性负等位基因。与之前报道相反的是，RING死RNF213具有RZ功能增加，这可能有望增加整体泛素化。为了解决这一差异，在敲除RNF213的HeLa细胞中共表达了RNF213或RNF213突变体与UB,并将其暴露于常氧或低氧环境中。正如预期的那样，整体泛素化在RNF213^H4014A不仅降低了，还在表达RNF213^H4014A或RNF213^{H4014A/H4509A}的细胞中也降低了。下一步还测试了Tyr-1275对RNF213介导的CYLD和SPATA2泛素化的影响，正如所料，RNF213^Y1275F导致的SPATA2和CYLD的泛素化受损。

图2 RNF213泛素化CYLD和SPATA2

3.  RNF213结构域是细胞死亡所必需的

我们用野生型RNF213及其突变体重组RNF213-KO BT474和AU565细胞。同时还生成了每个细胞系敲除PTPN1的库。将细胞暴露于低氧环境下，发现RNF213-WT在BT474和AU565细胞中促进CYLD降解，并在轻微程度上促进SPATA2降解(图3a)。氯喹，而不是MG132，在环己酰亚胺存在下阻断CYLD/SPATA2降解，表明溶酶体降解。RING缺失的RNF213促进其降解(图3b)，特别是在PTPN1-KO细胞中。RNF213 ATP酶活性是RZ介导的连接酶活性所必需的， 在PTP1B存在或不存在的情况下RN F213^{K2775A/H4014A}突变体都不能降解CYLD或SPATA2(图3c)。RNF213单核苷酸多态性易患MMD病，大多数高度显性单核苷酸多态性影响RING。事实上，高度渗透的IRNG突变SNP对SPATA2和CYLD的影响与RING-dead的RNF213相似。

最后，我们测试了在PTP1B敲除的情况下，每个突变体对缺氧敏感性的影响。相比之下，RING-dead RNF213增加了缺氧细胞死亡，甚至在PTP1B充满的细胞中，导致几乎没有PTPN1缺失细胞存活。由此发现，RNF213 Tyr磷酸化促进ATP酶介导的RZ结构域的寡聚化和激活，这导致CYLD/SPATA2泛素化、溶酶体降解和细胞死亡。而RING抑制RZ，而RING-dead RNF213增加CYLD/SPATA2降解和缺氧超敏反应。

RZ泛素化沙门氏菌脂质A，线性泛素链复合物(LUBAC)催化额外的泛素化，促进细菌被溶酶体清除。LUBAC成分RBCK1的敲除也抑制了WT-RNF213催化的CYLD和SPATA2的降解，甚至在PTP1B缺失的BT474或AU565细胞中(图4a)。值得注意的是，RBCK1对于RING-dead RNF213 (RNF213^H4104A)降解CYLD/SPATA2是不可或缺的，并且RBCK1敲除不能阻止RNF213^H4104A细胞中的缺氧超敏反应(图4A、b)。敲除编码HOIP的另一种LUBAC成分的RNF31，也能阻止WT-RNF213，但不能阻止RING-dead RNF213的CYLD和SPATA2的降解，并且不能抑制低氧超敏反应。以上结果表明MMD携带者可能对沙门氏菌和相关病原体的感染具有抗性。

图3 RNF213 RING-domain激活RZ-domain且带有ATP酶活性

4.  RNF213 RZ引发细胞焦亡

CYLD和SPATA2负调节NF-κB，并且不意外地，BT474或AU565细胞中的PTPN1-KO(伴随着CYLD/SPATA2降解)增加了NF-κB应答活性(图4c)。当PTP1B从RNF213-KO细胞中被敲除时，应答活性没有增加，但是WT-RNF213表达的恢复使PTPN1-KO细胞的活性增加到与PTPN1-KO BT474细胞相似的水平。即使PTPN1完整，RING-dead RNF213细胞也显示NF-κB活性显著增加，PTPN1缺失后活性进一步增加。与其对CYLD/SPATA2的作用一致，RNF213的其余突变体形式在任何条件下都不能诱导NF-κB(图4c)。PTPN1-KO也增强了NF-κB靶基因(IL1B，NLRP3)的表达。

CYLD和SPATA2可以促进细胞凋亡和坏死，而NF-κB通常促进癌细胞存活。然而，PTP1B的缺失或抑制会增加缺氧时的细胞死亡，同时促进CYLD降解和增强NF-κB活性。为了解决这个明显的矛盾，最初是通过使用细胞死亡抑制剂研究了PTP1B缺陷的缺氧细胞是如何死亡的。抑制铁增生或坏死未能阻断PTPN1-KO BT474细胞中的缺氧超敏反应；然而，常规胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK防止了缺氧细胞死亡(图4d)。

我们报道了PTP1B缺陷型乳腺癌细胞中细胞凋亡(一种胱天蛋白酶依赖的过程)没有增加；而且，细胞死亡方式似乎是坏死。Z-VAD-FMK还抑制“炎症性胱天蛋白酶”，并且值得注意的是，用酪蛋白酶1/4抑制剂VX765治疗，减弱了PTPN1-KO BT474和MDA-MB-361细胞中的低氧细胞死亡(图4e)。NF-κb诱导炎症酶组分NLRP3的表达，与IL1B相一致。重要的是，用NLRP3抑制剂MCC950(图4f)或用GSDMD-KO(图4g)处理阻断了PTPN1-KO BT474或MDA-MB-361细胞的缺氧超敏性。低氧的PTPN1-KO BT474和MDA-MB-361细胞显示乳酸脱氢酶(LDH)释放，其被热解抑制(图4h)或GSDMD-KO(图4i)抑制。PTPN1-KO还增强了IL-1β的产生(图4j)。在表达RING-dead RNF213的细胞中，IL-1β水平进一步增加，但在其他突变体的细胞中，没有检测到增加。得出结论是，PTP1B–RNF213–CYLD–SPATA2通路在缺氧的癌细胞中触发细胞焦亡。

图4 敲除了PTPN1的细胞引发细胞焦亡

5.  内质网应激提供了“第二信号”

NF-κB可以引发细胞焦亡，但需要第二个信号来触发炎症小体组装/炎症性胱天蛋白酶激活、gasder- min D (GSDMD)裂解和死亡。在0.5% O₂时，PTPN1/CYLD-KO、PTPN1/SPATA2-KO或单独CYLD-KO显示缺氧高敏感性。但这些缺失都不影响1% O₂中的生存力。值得注意的是，用IRE1α抑制剂4μ8c(图5a)或PERK抑制剂GSK2606414处理的PTPN1-KO BT474和MDA-MB-361细胞对缺氧性细胞死亡具有抗性，表明PTP1B缺陷细胞中的缺氧敏感性需要内质网应激信号。

为了弄清内质网应激是否足以激活细胞焦亡，我们用衣霉素或毒胡萝卜素（内质网应激诱导剂）处理了SPATA2和CYLD缺陷的细胞。在SPATA2-和CYLD-缺陷的BT474细胞和相关的MDA-MB-361细胞中，这两种药物选择性地减少活细胞数量并增加LDH释放(图5c)。相比之下，在PTPN1-KO BT474或MDA-MB-361细胞中，内质网应激不影响NF-κB报告基因活性/靶基因表达。

6.  RNF213在肿瘤中触发细胞焦亡

最后，将亲代、PTPN1-KO、CYLD-KO和PTPN1/CYLD-KO BT474和MDA-MB-361细胞植入无胸腺小鼠，并监测肿瘤的发展。值得注意的是，PTP1B、CYLD或两者的缺乏抑制了肿瘤生长，而NLRP3的敲除证实了炎症体在抑制肿瘤生长方面的重要性(图5d)。与亲代或PTPN1-KO/NLRP3-KO肿瘤相比，PTPN1-KO、CYLD-KO或PTPN1/CYLD-KO BT474-和MDA-MB-361衍生的肿瘤显示坏死增加(图5e)。为了确定肿瘤死亡所需的RNF213结构域，我们植入了用强力霉素(dox)诱导的RNF213^WT、RNF213^Y1275F、RNF213^H4014A或RNF213^H4509A重建的RNF213-KO sgPTPN1 BT474细胞。当体积达到大约100 mm³时，将小鼠换成含有Dox的食物以诱导RNF213的野生型或突变体。可以发现RNF213-WT或RNF213-RING dead的表达损害肿瘤生长(图5f)。PTPN1-或CYLD-KO诱导裂解的CASP1和裂解的GSDMD(图5h，I)，证实了细胞焦亡。

图5 缺氧的内质网应激激活了炎症小体

本篇文章主要是在低氧癌细胞中发现了一种独特的炎症细胞死亡途径，其中PTP1B和ABL1/2相互调节RNF213寡聚化、RZ结构域激活和K63泛素化/CYLD/SPATA2降解。由此激活NF-κB引发炎症小体，然后炎症小体被缺氧诱导的内质网应激激活，导致GSDMD细胞焦亡。

研究发现，在严重缺氧的癌细胞中，NF-κB通路是通过被RNF213催化的去泛素化酶CYLD/SPATA2的降解所激活的。由E6导致的HPV，也是通过降解CYLD激活缺氧条件下的NF-κB。通过杀死缺氧的癌细胞，PTP1B或CYLD/SPATA2的抑制或降解可能会增强其他抗肿瘤药物的疗效。此外，热原性细胞死亡是炎症性的，因此可能“使冷肿瘤变热”并增加抗肿瘤免疫反应。PTP1B/TCPTP抑制剂由于其免疫细胞刺激作用，目前正作为抗肿瘤药进行临床试验(NCT04777994 )，结果表明，PTP1B抑制剂还可能具有有益的肿瘤细胞自主作用。

本篇文章的结果也表明了缺氧反应途径，RNF213调节和MMD发病机制之间的关系。有趣的是，研究人员发现RZ结构域，之前考虑与脂质的K63泛素化有关，也催化两个靶蛋白的K63泛素化。这种双重活性的机制有待于进一步的生物化学/结构研究。RNF213还与LUBAC合作通过LPS将沙门氏菌靶向至内溶酶体。研究人员发现RING突变体表现出RZ功能增益，这为MMD的常染色体显性遗传和先前观察到的MMD等位基因对NF-κB的激活提供了解释。