摘要
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，其病因与人乳头瘤病毒（HPV)持续感染有关。宿主天然免疫系统和入侵的HPV都发展出了复杂而有效的机制来相互对抗。干扰素基因刺激因子（STING）在抗病毒和抗肿瘤免疫中发挥重要作用，而病毒癌蛋白E7，尤其是HPV16/18，在宫颈癌中参与细胞增殖，并可抑制STING的活性。本研究中发现激活STING-TBK1可促进E7泛素化降解从而抑制宫颈癌生长。机制上，TBK1磷酸化HPV16/18 E7 Ser71/Ser78，促进E3连接酶HUWE1对E7泛素化降解。功能上，激活的STING以TBK1依赖的方式下调E7来抑制宫颈癌细胞增殖，并可与放疗产生协同作用，达到更好的抗肿瘤效果。此外，STING-TBK1的基因或药理学激活可以抑制小鼠宫颈癌的生长，这种抑制作用不依赖于其先天免疫防御。本研究提示了宿主对肿瘤病毒天然免疫防御的新层次，激活STING/TBK1可能是治疗HPV阳性宫颈癌患者的一种有前途的策略。
背景介绍
宫颈癌是全球女性第四常见的癌症和第四位癌症死亡原因，2020年约有60.4万新发病例和34.2万死亡病例。高危型人乳头瘤病毒（HPV），尤其是HPV16/18的持续感染是宫颈癌发生的主要原因。HPV持续感染后，dsDNA病毒基因组整合到宿主基因组中，导致主要癌蛋白之一的E7过表达。E7通过参与细胞增殖、细胞死亡和先天性免疫等多条信号通路参与宫颈癌的发生和维持。例如，E7通过一个典型的LxCxE结构域结合并抑制肿瘤抑制因子视网膜母细胞瘤1（RB1），释放E2F转录因子促进细胞周期进程，并激活PI3K/Akt通路。E7在HPV相关的恶性肿瘤中的关键作用使其成为宫颈癌治疗中有吸引力的靶点。然而，临床上至今仍没有可用的特异性靶向E7的抑制剂。
干扰素基因刺激因子（STING，又名MPYS/MITA/ERIS）是一种内质网跨膜蛋白，是宿主抗病毒天然免疫应答过程中胞质DNA感受通路的重要接头分子。在HPV感染时，环鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）合成酶（cGAS）识别胞质中的dsDNA，产生第二信使cGAMP，激活STING，招募自磷酸化的TBK1。反过来，TBK1磷酸化STING的C端结构域，进一步招募干扰素调节因子3（IRF3），后者转位到细胞核中，诱导I型干扰素基因（IFN-I）和下游相关干扰素刺激基因的表达，导致宿主抗病毒状态的建立。另一方面，癌细胞常产生微核或胞质DNA，也可触发cGAS-STING通路启动抗肿瘤免疫反应，包括驱动DC成熟、抗肿瘤巨噬细胞极化、促T细胞启动和活化、促NK细胞活化等。因此，STING通路被认为是癌症免疫治疗中有前途的靶点，尤其是病毒相关的癌症。STING激动剂的临床前研究在广泛的癌症类型中取得了令人鼓舞的结果，促进了越来越多的临床试验的进行。
然而，HPV已经进化出逃避宿主天然免疫的手段，如E7可抑制cGAS-STING通路。在宫颈癌中，HPV18 E7可以直接与STING结合，选择性地拮抗STING触发的先天性免疫激活；在HPV阳性的头颈部鳞癌中，HPV16 E7通过NLRX1介导降解STING。由此可见，STING与E7之间的相互拮抗作用在HPV相关癌症的发生发展中发挥了重要作用。最近，越来越多的证据表明，STING参与调控一些与免疫应答无必然联系的细胞活动，如增殖、分化和程序性死亡。鉴于E7在宫颈癌增殖中的关键作用，作者想知道激活STING是否可以在与E7相互作用的过程中颠覆E7的作用，并最终改变宫颈癌的增殖。
本研究揭示了STING/TBK1介导的HPV16/18 E7分别在Ser71/Ser78的磷酸化促进其被E3连接酶HUWE1泛素化降解。STING-TBK1的激活通过降解E7来阻碍HPV阳性宫颈癌细胞增殖和肿瘤生长，而这一过程不依赖于其固有免疫防御，提示激活STING/TBK1可能对宫颈癌患者有益。
结果分析
1.激活STING/TBK1下调细胞中HPV16/18 E7
为了检测激活STING能否逆转HPV E7在其相互作用过程中的功能，作者用强效STING激动剂diABZI处理了分别整合有HPV16和HPV18 DNA的宫颈癌细胞系Caski和HeLa细胞。激活STING后，两种细胞中HPV16/18 E7的内源性蛋白水平显著降低（图1A-B）。另外两种STING激动剂SR-717和MSA-2也有类似结果（图1C-D）。此外，放疗（RT）以剂量依赖的方式降低Caski和HeLa细胞中HPV16/18 E7的内源性蛋白水平，因为RT能够激活STING/TBK1（图1E-F)。
鉴于STING/TBK1在瞬转过程中可被胞质游离DNA激活，作者将外源性STING分别与HPV16/18 E7共转染Caski和HeLa细胞，外源性E7的蛋白水平也明显降低（图1G-H）。此外，利用Tet-On调控系统构建了稳定表达STINGWT、STINGV155M或STINGR281Q（2个组成型活性STING突变体）的Caski和HeLa细胞。在多西环素（Dox）诱导下，STINGV155M和STINGR281Q均能降低内源性HPV16/18 E7蛋白水平（图1I-J），而STINGWT不能。这些结果表明激活的STING/TBK1导致细胞中HPV16/18 E7减少。
图1 激活STING/TBK1下调细胞中HPV16/18 E7
2.激活的STING/TBK1通过E3连接酶HUWE1促进HPV16/18 E7泛素化降解
接下来，作者研究了激活的STING/TBK1如何降低HPV16/18 E7。首先，激活的STING可能是在转录后水平下调HPV16/18 E7，因为细胞中HPV18 E7的mRNA水平几乎不受STINGV155M或STINGR281Q，以及diABZI处理的影响(图S2A-B)。其次，在Caski和HeLa细胞中，diABZI处理后内源性HPV16/18 E7的下调可以被蛋白酶体抑制剂MG132挽救，但不能被溶酶体抑制剂Baf A1或CQ挽救（图2A-B）。同样的，在293T中瞬转STING后，外源性HPV16/18 E7的减少也能被MG132挽救，不能被Baf A1或CQ挽救(图S2C-D)。第三，在Caski、HeLa或293T细胞中瞬转STING后，外源性HPV16/18 E7的泛素化增加（图2C-D，图S2E-F）。这些结果表明，激活的STING/TBK1诱导细胞中HPV16/18 E7的泛素-蛋白酶体途径降解。
图S2 激活的STING通过泛素化-蛋白酶体系统下调E7
然后，作者使用稳定表达Flag标签HPV18 E7的HeLa细胞，通过IP-MS鉴定了降解E7的E3连接酶。在与E7相互作用的蛋白中，有三个E3连接酶，HUWE1、XIAP和HERC4。然而，细胞中异位的HPV16/18 E7仅被外源性HUWE1降低，而不能被XIAP或HERC4降低（图2E-F）。与此一致，在Caski或HeLa细胞中转染sgHUWE1后，内源性HPV16/18 E7水平升高（图2G-H）。在HeLa细胞中敲低HUWE1可消除diABZI或RT对内源性HPV18 E7的降解作用（图2I-J），在293T、HeLa细胞中敲低或敲除HUWE1可降低瞬转STING诱导的HPV18 E7泛素化降解（图2K-L）。这些结果表明E3连接酶HUWE1在STING/TBK1激活后介导HPV16/18 E7的泛素化降解。
图2 激活的STING/TBK1通过E3连接酶HUWE1促进HPV16/18 E7泛素化降解
3.激活的STING通过TBK1介导的HPV16/18 E7磷酸化促进其泛素化降解
由于TBK1介导的STING磷酸化是细胞天然免疫应答的关键步骤，作者推测TBK1也可能参与了STING/TBK1激活后HPV16/18 E7降解。在STING-/-或TBK1-/- HeLa细胞中，diABZI或RT对HPV18 E7的降解作用均消失（图3A-B）。因此，TBK1可能是STING激活后磷酸化HPV16/18 E7的激酶，因为蛋白质的稳定性通常受磷酸化的调节，而HPV16/18 E7已被报道为可磷酸化的。事实上，在Caski和HeLa细胞中，外源性TBK1均能降低HPV16/18 E7水平（图3C-D）。
图3 激活的STING通过TBK1介导的HPV16/18 E7磷酸化促进其泛素化降解
且这种作用依赖于TBK1的激酶活性，因为TBK1的两个激酶失活（kinase-dead，KD）突变体TBK1S172A和TBK1Y325E均不能降低293T细胞中异位的HPV16/18 E7水平（图S4A-B）。然后作者研究了TBK1能否磷酸化E7。在TBK1与HPV16/18 E7共转染的细胞中，可检测到p-丝氨酸，但未检测到p-苏氨酸，而TBK1S172A与HPV16/18 E7共转染的细胞中未检测到p-丝氨酸，表明TBK1能够磷酸化HPV16/18 E7的一个或几个丝氨酸残基（图S4C-F）。此外，TBK1，而不是TBK1S172A，可以增强细胞中HPV16/18 E7的泛素化水平（图3E-F）。
图S4 图S4 TBK1激酶可磷酸化HPV16/18 E7丝氨酸残基
作者随后构建了HPV16 E7的5个丝氨酸残基突变体（S31A、S32A、S63A、S71G和S95A）和HPV18 E7的6个丝氨酸残基突变体（S32R、S34A、S78G、S79A、S95A和S103A)。外源性TBK1在细胞中不能下调HPV16 E7的S71G突变体或HPV18 E7的S78G突变体的水平（图S5A-B）。并且，在细胞中未检测到TBK1介导的HPV16 E7 S71G突变体或HPV18 E7 S78G突变体的丝氨酸磷酸化（图S5C-D)。这些结果表明，HPV16 E7的第71位丝氨酸和HPV18 E7的第78位丝氨酸是TBK1介导的主要磷酸化位点。
图S5 TBK1分别磷酸化HPV16/18 E7的Ser71/Ser78
随后作者制备了特异性的抗HPV16 E7 p-S71和HPV18 E7 p-S78的抗体，在TBK1与HPV16 E7共转染的细胞中检测到HPV16 E7第71位丝氨酸的磷酸化，但未检测到其S71G突变体的磷酸化（图3G-H）；在TBK1与HPV18 E7共转染的细胞中也检测到HPV18 E7第78位丝氨酸的磷酸化，但未检测到其S78G突变体的磷酸化。与此一致，均未观察到TBK1介导的HPV16 E7 S71G突变或HPV18 E7 S78G突变的泛素化（图3I-J）。这些结果表明TBK1对HPV16/V18 E7的Ser71和Ser78磷酸化分别介导了它们的泛素-蛋白酶体途径降解。
4.激活的STING/TBK1以TBK1依赖的方式降解E7并抑制宫颈癌细胞增殖
鉴于HPV E7可促进宫颈癌的增殖和生长，作者推测STING的激活可能通过降解E7来影响宫颈癌细胞的增殖和肿瘤生长。在Caski和HeLa细胞中，Dox诱导的STINGV155M或STINGR281Q显著降低E7水平，并抑制细胞增殖和克隆形成（图4A-C）。此外，在稳定过表达HPV16 E7的Caski细胞中，diABZI对细胞增殖和克隆形成的抑制作用被挽救（图4D-F），而在STING-/-和TBK1-/-HeLa细胞中，diABZI对细胞增殖和克隆形成均无影响（图4G-H）。这些结果表明，激活的STING通过TBK1介导的E7降解来抑制宫颈癌细胞的增殖。
图4 激活的STING以TBK1依赖的方式降解E7并抑制宫颈癌细胞增殖
由于80%的宫颈癌患者在其病程中接受RT治疗，并且RT可以通过激活STING/TBK1降低E7（图1E-F），因此作者研究了STING激动剂是否可以协同增强RT对宫颈癌细胞增殖的影响。与diABZI或RT单独应用相比，diABZI与RT联合应用能更有效地降低E7水平，并抑制细胞增殖和克隆形成（图5A-C）。这些结果表明，STING激动剂联合低剂量RT可能达到与高剂量RT相似的抑制宫颈癌生长的效果。例如，2Gy X射线+diABZI与4Gy X射线单独照射的效果相似，提示联合应用可增强放疗对宫颈癌患者的治疗效果，或替代可能对正常组织或器官造成严重损伤的大剂量放疗。
图5 STING激动剂增强了RT对Caski细胞中HPV16 E7、细胞增殖和克隆形成的抑制作用
5. STING/TBK1激活通过降解E7抑制HPV阳性宫颈癌的肿瘤生长
近年来，药理学激活STING作为一种潜在的肿瘤免疫治疗方法，在临床前模型和临床试验中得到了广泛研究。作者关心STING的激活除了可增强抗肿瘤免疫外，能否通过直接降解E7来特异性抑制HPV感染的宫颈癌的生长。为了避免STING介导的抗肿瘤免疫的影响，作者利用NOD-SCID小鼠模型，使用稳定表达STINGV155M或STINGR281Q的Caski细胞和Tet-On调控系统，评估了激活的STING/TBK1对体内肿瘤生长的影响（图4A)。在Dox诱导下，与载体组（图6A-D）相比，STINGV155M和STINGR281Q均能显著降低肿瘤的大小、体积和重量。
与对照组Caski细胞相比，过表达HPV16 E7的NOD-SCID小鼠的肿瘤体积和重量略有增加，而diABZI可降低对照组Caski细胞荷瘤小鼠的肿瘤体积和重量，但对过表达HPV16 E7的Caski细胞荷瘤小鼠的肿瘤体积和重量没有影响（图6E-H）。这些体内实验结果与过表达HPV16 E7可以挽救diABZI体外抑制细胞增殖的结果一致（图4D-F）。以上结果表明STING的激活可以通过降解E7来抑制HPV阳性宫颈癌的肿瘤生长。
图6 STING/TBK1激活通过降解E7抑制HPV阳性宫颈癌的肿瘤生长
讨论
HPV18 E7可以直接结合并抑制STING，从而逃避先天免疫监视。本研究首次发现STING/TBK1的激活可以促进HPV16/18 E7降解，从而抑制宫颈癌生长，且这种作用不依赖于STING/TBK1的天然免疫。主要机制如图7所示，当STING被激活后，STING二聚化并招募TBK1磷酸化HPV16/18 E7的Ser71/Ser78（且HPV16 E7的Ser71和HPV18的Ser78在各种HPV型别中相对保守），进而促进HUWE1对E7的泛素化降解。本研究揭示了宿主对致癌病毒天然免疫防御的新层次，并提出激活STING/TBK1可能是治疗宫颈癌患者的一种有前途的新策略。
