糖修饰介导的非典型泛素化途径抑制了Nrf1/NFE2L1的活化

结果

FBS2 是一种凝集素型 F-box 蛋白，可识别 N-连接的高甘露糖聚糖，SCF^FBS2 通过识别 N-聚糖有效地泛素化 Nrf1。然而，通常的泛素化位点K 残基在 N-糖基化位点簇周围未发现（图1A）。为了鉴定 Nrf1 的泛素化位点，我们首先构建了一个Nrf1突变体，其中所有K残基都被精氨酸（R）（26KR）取代，然后在通常不表达FBS2的HeLa细胞中过表达野生型（WT） Nrf1-血凝素（HA）或26KR Nrf1-HA与FLAG-FBS2或其凝集素缺陷突变体的组合。在蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Btz）存在下，在FLAG-FBS2过表达细胞中检测到WT和26KR Nrf1-HA 的缓慢移动拖尾（图S1A）。这些弥散条带不受去糖基化酶肽：N-糖基化酶F（PNGase F） 处理的影响，并与抗 Ub 抗体反应，证实 WT 和 26KR Nrf1-HA 在 FBS2 存在下均泛素化（图S1B）。在WT（NGLY1+）细胞中，WT Nrf1在没有Btz处理的情况下降解（图S1C），在使用Btz时由DDI2处理（图1B,泳道2）并转移到细胞核（图S1C）。有趣的是，26KR Nrf1突变体即使在没有Btz处理时也保持稳定，由DDI2处理（图1B,泳道3-4）并转移到细胞核（图S1C）。这一结果表明，K残基的泛素化是Nrf1有效降解所必需的，但 S 和 T 的补偿性泛素化允许 DDI2逆行易位和加工并转运到细胞核。相反，在FBS2过表达的NGLY1-KO细胞中，Nrf1既不被DDI2处理（图1B,泳道6-8）也不转运到细胞核（图S1C）。WT与26KR Nrf1产生了相似的泛素化（图1B,泳道1-8），表明Nrf1可能通过S/T残基上的氧酯键被SCF^FBS2泛素化。

SCF^FBS2对Nrf1的泛素化在NGLY1-KO细胞中比在WT细胞中更有效（图1B）。ENGASE 是另一种去糖基化酶，也存在于胞质中，可以修剪 N-糖基以在 N-糖蛋白上生成 N-GlcNAc（图2A）。这表明在NGLY1-KO细胞敲除ENGASE可能通过维持完整的N-聚糖来进一步增强Nrf1的 FBS2 依赖性泛素化。为了确定SCF^FBS2是否在NGLY1：ENGASE 双敲除（dKO）细胞中更有效地泛素化 Nrf1，我们使用NGLY1：ENGASE-dKO HeLa细胞，并在存在或不存在Btz的情况下与 FBS2 或其突变体联合过表达 NGLY1 和/或 ENGASE。令人惊讶的是，我们没有在 NGLY1：ENGASE-dKO HeLa细胞中检测到FBS2依赖性泛素化（图2B,1-4泳道）。WT ENGASE的表达恢复了泛素化，但活性缺陷的ENGASE E273A突变体没有（图2C ,5-8泳道）。因此，ENGASE活性似乎是 SCF^FBS2 有效泛素化Nrf1所必需的。在FBS2 存在的情况下，DDI2对Nrf1 有效处理（图1B,泳道5-8和图2B，泳道5-6）和核易位（图S1C）都需要NGLY1，但ENGASE的敲除去除了这种需求（图2B,泳道1-2，图S2A和S2B），这表明 ENGASE 和 SCF^FBS2依赖性泛素化发挥作用，阻止 DDI2 处理 Nrf1 和核易位。支持这一想法的是，在NGLY1:ENGASE-dKO HeLa细胞中共表达ENGASE和FBS2会导致泛素化蛋白的积累（图S2C，泳道5）并阻止 Nrf1加工（图S2D）。

NGLY1-KO通常是致死的，但在不表达内源性FBS2的HeLa细胞中是可行的。相比之下，尽管我们能够建立NGLY1：FBS2-dKO，但我们无法在表达内源性FBS2的HCT116细胞中产生NGLY1-KO以及NGLY1:ENGASE-dKO细胞系（图2D）。在NGLY1：ENGASE-dKO HCT116细胞中，ENGASE长时间过表达导致细胞死亡，而ENGASE的瞬时表达（逆转录病毒感染后48小时）导致泛素化Nrf1的积累，其Ub链可通过NH₂OH处理去除（图 2D）。这些观察结果与模型一致，在该模型中，ENGASE和FBS2依赖性泛素化对细胞有害，并且需要NGLY1来对抗ENGASE和FBS2活性。

图2

为了确认FBS2识别Nrf1上的N-糖，从WT、NGLY1-KO和NGLY1：ENGASE-dKO 细胞中免疫沉淀FBS2。Nrf1与WT FBS2共免疫沉淀，但不与其凝集素突变体共免疫沉淀（图 2E）。在WT和NGLY1-KO细胞免疫沉淀的Nrf1上观察到多泛素化，但在NGLY1：ENGASE-dKO细胞中未观察到。这些结果共同表明，SCF识别Nrf1上的N-糖，而Nrf1泛素化需要额外的ENGASE活性。

我们之前表明，SCF^FBS2对Nrf1的泛素化诱导NGLY1-KO细胞死亡，可能是由于蛋白酶体功能障碍。与此结果一致，FBS2的过表达增加了WT和NGLY1-KO细胞对Btz处理的敏感0性，如 LD50 值降低所示（图 2F、S2E 和 S2F）。FBS2过表达不影响Nrf1-KO和NGLY1：ENGASE-dKO细胞对Btz处理的敏感性，表明FBS2通过需要Nrf1和ENGASE的机制增加对蛋白酶体抑制剂的敏感性（图 2F和S2F）。这些结果表明，SCF^FBS2泛素化Nrf1，从而阻止其通过ENGASE依赖性过程上调蛋白酶体基因表达。即使拮抗SCF^FBS2依赖性失活的 NGLY1 处于活性状态，也可能发生Nrf1 的SCF^FBS2依赖性失活（图 2F，WT）。

ENGASE作用在N-聚糖最内层N，N′-二乙酰壳二糖部分的糖苷键上，在糖蛋白上产生 N-GlcNAc。由于FBS2介导的 Nrf1 泛素化几乎不发生在NGLY1：ENGASE-dKO和ENGASE-KO细胞（图 2B）中，它们不能产生N-GlcNAc残基，我们假设SCFFBS2可能泛素化Nrf1上的 N-GlcNAc 残基。

为了检验这一假设，我们使用化学合成的糖肽和重组蛋白进行了体外泛素化测定（图S3 和S4A）。我们首先合成了GP1作为模型底物，一种羧基四甲基罗丹明（TAMRA）连接的糖肽，对应于 Nrf1的421-431个氨基酸序列，其中两个潜在的N-糖基化N 残基被GlcNAc和 Man3GlcNAc2修饰（Man3GlcNAc2是FBS2识别的已知 N-糖结构）（图3A）。与我们的预期相反，GP1 的泛素化未发生在 ATP 存在下含有 E1、E2、SCF^FBS2和Ub的反应中，或包括促进泛素化活性的 neddylation 系统在内的反应中（图 3B，泳道 1 和 2）。接下来，我们测试了RBR型E3 ARIH1对泛素化反应的影响，因为ARIH1与SCFFBS2相互作用，但不与 SCF^FBS2mut相互作用（图S4B）。已知ARIH1与 neddylate化的cullin-RING E3连接酶 （CRL）结合，并介导 CRL底物上第一个Ub的添加。SCF^FBS2的CUL1亚基在NGLY1-KO HeLa细胞中高度 neddylation（图 S4B）。当 ARIH1 及其 E2 酶 UBE2L3添加到反应中时GP1会发生泛素化（图 3B，泳道 3-5）。当使用含有FBS2 YW/AA凝集素突变体的SCF或不存在ATP、E1、E3或Ub时，GP1不会发生泛素化（图 3C）。令人惊讶的是，在没有常规E2酶提供给SCF^FBS2的情况下，GP1的泛素化被促进，多聚泛素链略短，但信号更强（图 3C，比较泳道 1 和 4;另见图 S4C）。GP1上的这些Ub链被NH₂OH处理消除，证实这些链是通过氧酯键连接的（图 S4D）。

图3

GP1 含有三个假定的Ub受体位点、一个N-GlcNAc 和两个 T 残基。为了确定 Ub 在糖肽中的附着位置，我们合成了其他糖肽并进行了泛素化试验（图 3D）。含有两个 N-GlcNAc 而没有 Man3GlcNAc2 的 GP3 未被泛素化，这与 FBS2 识别 N-糖是泛素化所必需的想法一致。此外，添加过量的寡糖Man3GlcNAc2（而不是GlcNAc2 或 GlcNAc3）可有效抑制SCF^FBS2-ARIH1 对 GP1 的泛素化（图 S4E）。这些结果证实，N-Man3GlcNAc2 是 SCF-ARIH1 对糖肽泛素化所必需的。在缺乏 N-GlcNAc、GP2 和 GP4 的糖肽中观察到泛素化，这表明至少在体外，SCF^FBS2-ARIH1 也泛素化Man3GlcNAc2附近的T残基。具有 N-GlcNAc 但缺乏 T 残基的 GP5 也被 SCF-ARIH1 泛素化。GP5 显示出比 GP1、GP2 和 GP4 强度更低的多泛素信号，这可能是由于假定的 Ub 受体位点数量的差异；GP5 有一个 N-GlcNAc，GP2 和 GP4 有两个 T 残基，而 GP1 含有两者作为受体位点。为了确定Ub与糖肽结合的比例，我们利用SCF^FBS2-ARIH1和K0 Ub对GP1、GP2和GP5进行泛素化，并分析了Ub结合糖肽条带的强度（图S4F）。当GP5的荧光强度设为1时，K0-Ub结合的GP1和GP2的比例分别为2.7–4.1和1.5–2.6，这与Ub受体位点的数量相一致（即GP1：3，GP2：2），表明N-GlcNAc和T残基均被SCF^FBS2-ARIH1在体外以相似的效率泛素化。

为了鉴定 Ub 偶联的 N-GlcNAc 的羟基，我们合成了额外的含有 N-GlcNAc 的糖肽，这些糖肽在第 6 位或第 4 位具有脱氧羟基（GP6 和 GP7;图 S3A-S3C）。如图 3E 所示，糖肽与 6-脱氧 N-GlcNAc 的泛素化被消除，而糖肽与4-脱氧GlcNAc的泛素化不受影响，表明 SCF^FBS2-ARIH1 主要泛素化N-GlcNAc上的6位羟基。位置6羟基相对不受空间位阻，与 GlcNAc 中的其他醇相比具有较高的亲核性，表明它是泛素化的合适靶标。这些结果表明，SCF^FBS2与ARIH1-UBE2L3 合作，将 Ub与T 残基的羟基和 N-GlcNAc 的 6 位偶联。

SCF^FBS2-ARIH1-UBE2L3 对 Nrf1 的非传统泛素化可能是由于 Nrf1 的 N-糖基化位点附近缺乏 K 残基。为了检查 SCF^FBS2的经典泛素化，我们通过用 K 替换 GP1 的 N-GlcNAc 合成了 GP8，发现 K-连接的泛素化比通过氧酯键的泛素化效率高得多（图 4A）。SCF^FBS2 的 K 连接泛素化发生在没有 Nedd8 系统的情况下，但通过添加 ARIH1 和 UBE2L3（泳道 1-3）而增强。NHOH 处理未消除连接到 GP8 的聚泛素链，证实 SCF^FBS2泛素化 GP8 中的 K（图 S5A）。在没有常规 E2 酶的情况下，GP8 的泛素化导致更短Ub 链和荧光强度增加（图4A，泳道3 和4），GP1也获得相似的结果（图3C，泳道1和4）。这表明形成的Ub链类型取决于 UBE2D1的存在与否，但不取决于受体分子。

图4

接下来，我们检查了从用 HA-FBS2 过表达 Nrf1-FLAG 的 NGLY1-KO 细胞裂解物中纯化的 Nrf1 上的 Ub 链。使用基于液相色谱-串联质谱 （LC-MS/MS） 的绝对定量方法、Ub 平行反应监测 （Ub-AQUA/PRM） 对 Ub 键类型进行定量。正如之前报道的那样，FBS2 过表达连接到Nrf1的Ub链主要是K48连接的。Ub链由经典K48组成，其次是非典型K6（23%）、 K33（6%）、K11（5%）和K29（3%）（图 4B）。为了确认 细胞中SCF 的 Nrf1 泛素化需要 ARIH1，我们生成了NGLY1：FBS2-dKO HCT116细胞，其中FLAG-FBS2表达是用多西环素诱导的，因为持续的FBS2表达对 NGLY1-KO 细胞有毒。在这些细胞中，Nrf1 泛素化在 FBS2 表达时被诱导，并被 ARIH1 耗竭抑制，表明 ARIH1 与 SCF^FBS2 的合作对于细胞中的 Nrf1 泛素化至关重要（图 4C）。

为了检查 ARIH1-UBE2L3 是否参与 SCF^FBS2 对Nrf1的非典型泛素化，我们比较了使用GP8 的三个反应之间的 Ub 键类型：E1/UBE2D1/SCF^FBS2、包括E1/UBE2D1/SCF^FBS2/Nedd8 sys/ARIH1/UBE2L3 的完整反应，以及在没有UBE2D1的情况下的完整反应。由于 His 标记的重组酶在这些反应中也高度泛素化，如图 3C 中考马斯亮蓝 （CBB） 染色图像的泳道 6 所示，因此使用钴树脂从体外反应混合物中去除酶，并从与 SCF^FBS2YW/AA的反应中减去与 SCF^FBS2反应获得的值，以消除重组蛋白泛素化的背景（图 S5B）。在含有 UBE2D1 的反应中，连接到 GP8 的 Ub 键的组成与有或没有 ARIH1-UBE2L3 的反应相似，但与没有 UBE2D1 的反应不同（图 S5C）。在 UBE2D1 存在的情况下，K48 （36%–38%） 、K63 （26%–29%） 和 K11 （21%–23%） 是最丰富的键类型，其次是 K6 （12%）。在没有 UBE2D1 的情况下，附着在 GP8 上的 Ub 量增加，并且 Ub 键类型发生显著改变。K63 键减少到 8%，非典型 K6 和 K33 键增加到 33% 和 9%。当使用 63R Ub 抑制 K63 连接的 Ub 链的形成时，在 UBE2D1 存在下，连接到 GP1 的 Ub 链更短（图 S5D，比较泳道 5 和 6），但与在不存在 UBE2D1 的情况下使用 WT Ub 反应中的链长相似（比较泳道2 和5），证实 K63 连接的 Ub 链由 UBE2D1 连接。如图 4B 所示，通过 SCF^FBS2-ARIH1 连接到 Nrf1 的 Ub 链除了经典 K48 连接链外，还包括非经典K6 、K11和K33连接链，但不包括K63连接链。综上所述，这些分析表明，通过 SCF^FBS2 识别，ARIH1及其特异性 E2（UBE2L3）参与 Nrf1 上非典型 Ub 链的延伸。

使用不同的 Ub 突变体证明 SCF^FBS2-ARIH1在没有UBE2D1的情况下在GP1上形成的 Ub 链包含多种 Ub 连接。在使用Ub与单个K在 K6 、 K11 和 K48 的反应中检查 GP1 的多泛素化，所有这些反应都显示泛素化显着降低（图 S5E）。然而，Ub 中单个 K 到 R 的突变对多泛素链的形成影响不大（图 S5F）。接下来，我们在 Ub 中引入了额外的 K/R 突变，并使用这些突变体检查了多泛素化。聚泛素链仍然使用 Ub 突变体形成，其中 K6、K11 和 K48 被 R 残基取代，而使用带有额外 K33R 的突变体完全抑制聚泛素链形成（图 S5G）。我们还使用各种 Ub 突变体检查了缺乏 T 残基且含有 N-GlcNAc 作为单个 Ub 受体的 GP5 的多泛素化（图 4D 和 4E）。SCF^FBS2-ARIH1-UBE2L3介导的 GP5 泛素化结果与使用 GP1 的结果相似（图 S5E 和 S5G），表明 Ub 中的 K6、K11、K33 和 K48 残基需要在单个 GlcNAc 残基上组装复杂的 Ub 链。

为了分析 SCF^FBS2依赖性 Nrf1 泛素化对周转的影响，我们首先在 ER 中积累 Nrf1，然后让反应在过表达 WT 或突变 FBS2 的细胞中在蛋白质合成抑制剂放线菌酮 （CHX） 存在下继续反应。在本实验中，用可逆 VCP 抑制剂 NMS-873 预处理细胞 1 小时，然后将其洗去以恢复 VCP 功能并用 CHX 追逐 3 小时（图 5A）。Nrf1 的降解速率在 WT 和 NGLY1：ENGASE-dKO HeLa 细胞中不受 FBS2 表达的影响，而在 NGLY1-KO 细胞中降解速率显著延长。在相同条件下，已知被蛋白酶体降解的短寿命蛋白质的降解没有受到显着影响（图 S6A）。在过表达 FBS2 的 NGLY1-KO 细胞中，即使在追逐 3 小时后也能观察到与 Nrf1 偶联的多泛素链，并且这种泛素化的 Nrf1 保留在胞质中，没有被 DDI2 切割（图 5A、S6B 和 S6C）。

图5

我们进一步研究了 Nrf1 上的 Ub 链是否可以被 DUB 去除。将 Btz 处理细胞的细胞裂解物在有或没有 DUB 抑制剂的情况下孵育 2 小时（图 5C）。与 DUB 抑制剂一起孵育可维持总 Ub 信号，而在没有抑制剂的情况下孵育时信号显著降低（Ub 印迹中的 1-3 泳道），表明细胞裂解物中的内源性 DUB 使大多数多泛素化蛋白质去泛素化。然而，尽管通过 SCF^FBS2-ARIH1结合到Nrf1的较长多泛素链减少了，但较短的Ub链在孵育过程中对 DUB 的作用有一定的抵抗力（Nrf1 印迹中的 2 和 3 泳道）。与此一致，在用 E1 抑制剂 MLN7243 处理的细胞中，由于内源性DUB的去泛素化，总泛素化蛋白的丰度急剧降低，而不受PNGase F处理影响的连接到Nrf1 的较短多泛素链完全对去泛素化有抵抗力（图 S6D 和 S6E）。此外，连接到糖肽的近端 Ub 链也对 USP2（USP2cc）的催化核心有抵抗力，但 Ub 受体位点（GP1；GlcNAc/T、GP8；K/T）不影响 DUB 抗性（图 S6F）。这些结果表明，由 SCF^FBS2-ARIH1 结合的 Nrf1 上的近端 Ub 链在体外和细胞中都对 DUB 的作用有抵抗力。免疫共沉淀实验表明，一些泛素化的 Nrf1 仍然与 SCF^FBS2-ARIH1 相关（图 5D），这表明 SCF^FBS2 复合物的稳定结合会影响 DUB 对 Ub 链的可及性。

讨论

两种 RBR E3 ARIH1 和 ARIH2 通过 neddylated cullin 结合并激活广泛的 CRL。ARIH1 催化底物的初始单泛素化，并与 SCF 特异性 E2 酶一起促进 SCF 介导的多泛素化。在这项研究中,我们发现ARIH1-UBE2L3相互作用是导致Nrf1最初泛素化和多聚泛素链形成的原因。在体外泛素化试验中,SCF^FBS2-ARIH1 根据 UBE2D1 的存在与否形成不同的多聚泛素链。

由SCF^FBS2-ARIH1-UBE2L3形成的多泛素链非常复杂,近端链对去泛素化酶的作用具有抗性。UBE2L3与其他RBR E3s如PRKN合作。先前的一项研究表明,PRKN-UBE2L3 形成 Ub 链,附着在由 PINK1 磷酸化的 Ub 上,其中 K6、K11 和 K48 连接是最丰富的连接类型,其次是 K33 和 K63。这些结果与我们对 Nrf1 泛素化的观察结果一致,并表明 RBR-UBE2L3 形成复杂的异型 Ub 链。事实上,PRKN 对线粒体外膜蛋白(如 Mfn1 和 Mfn2)的泛素化模式(由碳氰化物 m-氯苯基联苯甲酮 [CCCP] 处理诱导)与 Nrf1 泛素化模式相似。然而，USP30 可以有效地从被 PRKN 泛素化的外膜蛋白中去除 Ub 链，从而拮抗线粒体自噬。这表明单独的异型链无助于维持稳定性，泛素化 Nrf1 的稳定性可能涉及其他因素。本研究中鉴定的泛素化位点位于 FBS2 识别所需的 N-聚糖附近，这表明 DUB 可能难以接近位于大体积 N-聚糖附近的聚泛素链。或者，由于 FBS2 和 N-糖之间的高亲和力，泛素化 Nrf1 与 SCF^FBS2-ARIH1 的稳定结合（图 5D）可能会影响 DUB 对 Ub 链的可及性。SCFFBS2 与 N-糖的稳定结合可以允许底物持续泛素化，即使在 DUB 去除一些 Ub 链后也是如此。尽管ENGASE活性会产生 N-GlcNAc 残基，而这些残基会被SCF^FBS2-ARIH1泛素化，但S和T残基也可作为泛素化位点。由于S和T残基位于 N-糖基化位点 (N-X-S/T)，因此它们始终存在于 N-糖附近。这就引出了一个问题：如果潜在的泛素化位点 (S/T) 已经存在于 N-糖基化位点，那么为什么 SCF^FBS2-ARIH1 依赖性泛素化需要 ENGASE？一种可能的解释是，ENGASE 需要去除在空间上阻碍 SCFFBS2-ARIH1 进入泛素化位点（对于 Nrf1 而言为 S/T 或 N-GlcNAc 残基）的庞大 N-糖（图 6）。另一种可能性是，Nrf1 上的 N-糖可能会干扰 ARIH1 与 neddylated SCF^FBS2 的结合，而 ENGASE 可能需要部分修剪这些干扰 N-糖。尽管 SCF^FBS2-ARIH1 可以泛素化含有两个Man3GlcNAc2的GP4肽，但在体外，ERAD底物上的内源性N-糖（Man7-9GlcNAc2），也预测存在于 Nrf1 上，显然比Man3GlcNAc2大得多。

NGLY1 基因的突变会导致一种称为 NGLY1 缺陷的先天性常染色体隐性遗传病。在小鼠中，Ngly1-KO 在 C57BL/6 中是致命的。敲除 Engase或Fbs2抑制这种致死性，尽管其潜在的分子机制仍不清楚。这项研究表明，ENGASE 形成 Ub 受体位点并可能消除 N-糖的空间位阻，从而允许SCF^FBS2-ARIH1有效泛素化Nrf1（图 S6G）。Engase的缺失仅部分抑制 Ngly1-KO 的致死率，而 Fbs2 的缺失则导致完全抑制。这表明 FBS2 可能与 NGLY1 竞争改变许多不同泛素化底物的命运，而 ENGASE 可能只需要泛素化包括 Nrf1 在内的较小子集。总之，目前的结果表明稳定泛素化的 N-糖蛋白的积累是NGLY1缺陷发病机制的关键因素。

非常规氧酯泛素化不仅在NGLY1-KO等特定条件下发生,而且在正常条件下也会发生(图2B,第10道),这表明FBS2可能作为Nrf1的一般负调节因子。除了Nrf1的负调节作用外,糖蛋白特异性SCFFBS2的内在功能仍不清楚。N-糖蛋白可以通过ERAD途径或其他途径转移到细胞质中,包括由细菌感染引起的细胞器损伤激活的途径。最近的一项研究表明，FBXO2/FBS1 通过识别链球菌表面碳水化合物结构中的 GlcNAc 参与异体吞噬。SCF^FBS2-ARIH1 形成类似于 PRKN 的非典型 Ub 链，FBS2 参与异体吞噬和其他生物防御反应值得进一步研究。