Science｜AMPK磷酸化FNIP1诱导溶酶体和线粒体的生物生成

细胞对线粒体毒物的反应是迅速激活AMPK，通过AMPK磷酸化引起急性代谢变化，并通过转录作用延长代谢的适应期。TFEB是AMPK一个主要的效应蛋白，它能增加溶酶体基因的表达以应对能量应激，但AMPK是如何激活TFEB仍不清楚。作者证明，AMPK直接磷酸化FNIP1中五个保守的丝氨酸残基，抑制FLCN-FNIP1复合物的功能。FNIP1的磷酸化对AMPK诱导TFEB的核转位和TFEB依赖性地增加PGC1α和ERRα mRNA是必需的。因此，线粒体损伤触发了AMPK-FNIP1依赖性的TFEB的核转位，诱导溶酶体和线粒体生物生成。

简介

适应长期营养匮乏的能力是所有生物生存的一个基本特征，真核生物包含一个高度保守的信号传导途径，当氧气或者葡萄糖浓度下降导致线粒体ATP生成减少，或者出现干扰氧化磷酸化的线粒体毒性物质，AMPK会在几分钟内完全激活。AMPK激活后会迅速将有限的直接底物磷酸化，调节脂质和葡萄糖代谢，调节自噬和mTORC1信号途径。如果能量匮乏的压力长期存在，新陈代谢就会因调控不同代谢过程的基因表达程序的转录变化而进一步改变。转录因子EB（TFEB）和相关的TFE3在营养匮乏时被激活。TFEB和TFE3都可以被mTORC1信号抑制，并被AMPK信号传导激活。mTORC1可以直接磷酸化TFEB的Ser122、Ser142和Ser211位点，导致TFEB分布在细胞质中。
     氨基酸(AA)通过以下方式调节mTORC1对TFEB的磷酸化能力。GTP激活蛋白（GAP）复合体由卵磷脂蛋白（FLCN）和FLCN伴侣蛋白1（FNIP1）组成。FLCN-FNIP1复合物调节GTP酶RagC的GTP负荷，从而导致TFEB和TFE3从溶酶体中释放出来并远离mTORC1，导致TFEB的核转位。在细胞核内，TFEB和TFE3直接与协调溶酶体表达和调节的CLEAR motif结合，该元件在溶酶体的50多个组分和一些自噬基因的近端启动子中是保守的。通过这种方式，TFEB和TFE3在营养充足的情况下是不活跃的。但在应对特定的细胞压力时，它们会转入细胞核并促进溶酶体的生物生成和自噬。在能量匮乏期间，TFEB转位到细胞核需要AMPK。AMPK是如何激活TFEB仍然是未知的，但可以推测它依赖于AMPK对mTORC1的抑制，通过AMPK磷酸化mTORC1组分Raptor和上游调节器TSC2。

作者研究了TFEB和TFE3是AMPK直接底物的可能性，但作者没有找到任何证据支持这一点。最近，有报道称AMPK在三个C端残基上对TFEB进行磷酸化、而这些磷酸化事件可能在溶酶体基因转录中发挥作用。然而，这三个紧密聚集的位点与AMPK底物共识序列的匹配度很低，而且这些位点的突变并没有破坏AMPK诱导TFEB和TFE3核转位的能力。因此，一个未知的AMPK依赖性事件可能支配TFEB和TFE3转位到细胞核，没有它，CLEAR基因的转录就不能发生，即使TFEB和TFE3在其C端被AMPK依赖性信号磷酸化。

AMPK如何激活线粒体生物生成转录程序的精确机制也尚未解决。AMPK在面对能量压力时，可以控制线粒体的生物生成，并合成过氧化物酶增殖体激活受体PGC1α mRNA。已经提出几个AMPK促进PGC1α mRNA的积累和PGC1α功能的机制，包括控制PGC1α的磷酸化或乙酰化，但确切的机制仍不甚明了。作者对线粒体OXPHOS抑制剂的转录反应进行了时间过程分析，揭示了细胞器生物生成的时间级联反应在遗传上依赖于AMPK。作者发现FNIP1是一个直接的AMPK底物，其磷酸化是TFEB激活和核转位的关键。这反过来又导致了PGC1α和ERRα的mRNAs产生增加，导致溶酶体生物生成，然后是线粒体生物生成。

结果

电子运输链抑制剂需要AMPK来诱导线粒体的基因转录
    为了阐明AMPK在线粒体能量应激的转录反应中的作用，作者通过CRISPR-Cas9技术在HEK293T细胞中敲除AMPKa1和AMPKa2（AMPK KO细胞），并对野生型（WT）和AMPK KO细胞用电子运输链（ETC）抑制剂处理，包括100 ng/ml rotenone (complex I)， 2 mM phenformin (complex I)，和5 μM CCCP（一种质子团，破坏了ATP所需的电化学梯度）。作者进行了一个长达16小时的RNA测序动态监测。RNA-seq数据集中的所有基因的差异表达分析显示了每一种药物所诱导的基因表达模式。差异性表达的定义是：Fold Change≥1.3和P≤0.05，然后进行层次化的聚类发现了一组共同的基因，它们的表达在WT对照组细胞中被CCCP、rotenone和phenformin诱导，但在缺乏AMPK的细胞中却没有。这些基因中，大约有三分之一的基因转录在最初的16小时内三种ETC抑制剂处理后都有相似程度地增加，并且依赖于AMPK进行全基因诱导（图1A和B）。对这种常见的、AMPK依赖的和线粒体能量应激诱导的基因集在2小时和4小时进行分析，使用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）的基因转录调控数据库，发现TFEB是富集程度最高的转录因子（图1C）。
    作者观察到在用四种药物治疗后，溶酶体和线粒体组分表达的共同差异基因具有相似性。接下来，作者重点研究线粒体基因的变化。作者重新分析了原始数据，在CCCP、rotenone和991处理后增加的线粒体基因有明显的重叠（图1 D和E）。分析显示，用ETC毒性药物或小分子AMPK激活剂991处理后，在WT细胞中而不是在AMPK敲除的细胞中，约有300个线粒体基因的转录增加（图1 D，F和 G）。尽管这些化合物抑制ETC的机制不同，该分析表明转录反应的很大一部分需要AMPK的激活。作者验证了核心溶酶体和线粒体基因表达的增加，包括LAMP2（图1H和K）、IDH2（图1I和L）、Cox6A1或ACO2（图1J和M），以响应CCCP和991（图1，K至M），通过qPCR实验发现，所有这些指标在WT细胞中的表达都增加了，而在缺乏AMPK的细胞中则没有。

鉴于TFEB对线粒体毒物诱导的基因的调控（图1C）和TFEB在AMPK依赖的转录作用中的主要作用（图1C），作者检查了线粒体毒物在WT或AMPK KO细胞中对TFEB蛋白的调节。从991或phenformin处理一小时的WT细胞中分离内源性TFEB蛋白显示出流动性降低的带状移位，而在AMPK敲低细胞中的TFEB中没有发生（图1N）。作者检查了更长时间下用rotenone和991处理的TFEB的电泳移动性，再次观察到WT细胞在处理后2至24小时内TFEB有持续的移动性下移，而这一现象在AMPK KO细胞中几乎检测不到(图1O和P）。作者用RNA-seq或qPCR检测了一些线粒体目标蛋白的丰度，并观察到PDHA1和IDH2在rotenone或991处理之后上调，这也在AMPK KO细胞中没有观察到（图1O和P）。

作者通过核质分离评估了TFEB和TFE3的细胞定位。在WT细胞中，991处理导致了TFEB和TFE3在细胞核中的丰度增加，细胞质部分几乎没有剩余的TFEB（图1Q）。在缺乏AMPK的细胞中，991处理并没有导致TFEB或TFE3转位到细胞核。用免疫荧光显微镜观察细胞内的TFEB证实了这些结果。在基础条件下的WT细胞中，TFEB主要在细胞质中，在细胞核中的数量较少（图1R和S）。当用991激活AMPK后，在TFEB完全去磷酸化的条件下，几乎所有的TFEB都转位到细胞核。反之，在AMPK KO细胞中，无论有无991，大多数TFEB仍留在在细胞质中（图1R和S）。这些结果表明，在线粒体能量匮乏的压力下，TFEB是AMPK的一个主要效应器 (图1T）。

图1 AMPK通过MiT-TFE转录因子家族在线粒体毒物的转录反应中发挥主导作用。

FNIP1是一个保守的AMPK底物，控制着TFEB的磷酸化状态和定位

        作者进行了一项筛选，以寻找能够调控细胞生长和代谢的AMPK底物，并确定了FNIP1。FNIP1是FLCN的一个已知的伴侣蛋白，已被报道与AMPK存在共免疫沉淀，并受AMPK调节，具体细节尚不清楚。FNIP1-FLCN复合物是氨基酸传感器，影响mTORC1信号通路，氨基酸参与控制TFEB的激活。因此，作者研究了AMPK是否可以独立于氨基酸来调节FNIP1控制TFEB。分析FNIP1蛋白序列显示有四个位点可能是合适的AMPK底物motif（Ser230， Ser232， Ser261和Ser593）。作者用质谱法（MS）来检查FNIP1在体内的磷酸化情况。作者用表位标记的FNIP1 cDNA转染HEK293T细胞，用DMSO或phenformin处理细胞。作者检测了横跨四个丝氨酸位点（Ser230、Ser232、Ser261和Ser593）的多肽（图2B），这些多肽的磷酸化在phenformin处理过的样品中增加了。MS分析检测到第五个丝氨酸位点，Ser220，该位点在AMPK激活后也被高度磷酸化（图2A），表明它也可能是AMPK磷酸化的一个位点(图2B)。为了测试FNIP1是否是AMPK的直接底物，作者进行了体外磷酸化试验。作者将cDNA瞬时转染到HEK293T细胞，免疫纯化了FLAG标签标记的WT FNIP1或FNIP1 S-A突变体蛋白（图2C）。重组的AMPK使WT FNIP1磷酸化增加，对于五个候选AMPK位点的丝氨酸Ser230、Ser232、Ser261、Ser593和Ser220突变体蛋白显示出磷酸化程度最小（以下简称为SA5突变体）（图2C）。值得注意的是，在体外磷酸化试验中，一些突变位点并不受AMPK的直接调节，或被多余的磷酸化掩盖了整体所判断的一两个位点损失的影响。

为了评估内源性FNIP1的磷酸化，作者用991处理小鼠胚胎成纤维细胞MEFs，在30分钟内，内源性FNIP1在Ser220位点被强烈地磷酸化。而TFEB和TFE3在相同条件下在WT细胞中被去磷酸化，而不是在AMPK KO MEFs细胞中（图2D）。作者用MK-8722处理小鼠，MK-8722是一种口服的991类似物，能够激活AMPK。然后检查小鼠肝脏裂解物中内源性FNIP1的磷酸化。作者在用MK-8722治疗的WT小鼠的肝脏中检测到FNIP1的Ser220磷酸化。但在AMPKa1/a2肝脏特异性KO小鼠中没有检测到（图2E）。其他AMPK底物，如pRaptor Ser792，在这些小鼠中也没有被磷酸化。TFEB和TFE3在MK-8722治疗的WT动物的肝脏中被去磷酸化，但在缺乏AMPK的肝脏中却没有(图2E）。用二甲双胍处理初级肝细胞，在WT肝细胞中诱导内源性FNIP1 Ser220的磷酸化，而在缺乏AMPK的肝细胞中则没有(图2F)。在WT肝细胞中，TFEB和TFE3在二甲双胍的处理下变得去磷酸化，但仍在缺乏AMPK的肝细胞中仍保持磷酸化。即使在缺乏AMPK的肝细胞再次给予二甲双胍也是如此（图2F）。因此，FNIP1似乎是一个真正的，在体外和体内的AMPK的底物，在AMPK的直接刺激下和对线粒体能量压力的反应中被磷酸化。鉴于mTOR和AMPK对TFEB和TFE3转录因子有相反的作用，并且这两种途径都会聚在FNIP1-FLCN复合物，AMPK对FNIP1的磷酸化可能是AMPK控制这些转录因子的主要机制。为了测试FNIP1的这种作用，作者在FNIP1敲低的细胞里面过表达WT，SA4或SA5 FNIP1，并用991处理这些细胞（图2G）。在WT FNIP1细胞中，AMPK的激活导致TFEB发生去磷酸化，移动速度加快。然而，在SA4和SA5 FNIP1细胞中，TFEB和TFE3仍然处于缓慢移动的高磷酸化形式（图2G）。当FNIP1上所有五个AMPK位点都发生突变时，这种效应进一步增强。TFEB在FNIP1 SA5细胞中，即使在991存在的情况下，TFEB也被完全磷酸化（图2G）。

图2 FNIP1是一个保守的AMPK底物，可调节TFEB和TFE3。

AMPK依赖FNIP1的磷酸化控制mTORC1与TFEB和TFE3的结合

尽管TFEB被细胞外信号调节激酶1（ERK）、糖原合成酶3（GSK3）和蛋白激酶磷酸化。但是人们认为TFEB的大部分调节是通过mTORC1对Ser 122和Ser 211的磷酸化来实现的。为了区分AMPK与mTORC1对TFEB的调节，作者用991对WT、AMPK KO HEK293T、WT FNIP1和SA5 FNIP1 HEK293T细胞进行处理。在WT细胞和WT FNIP1细胞中TFEB和TFE3在30分钟内变得去磷酸化，但在AMPK KO和SA5 FNIP1细胞中仍然高度磷酸化（图3A和B）。在WT HEK293T和WT FNIP1细胞中，mTORC1信号传导被991减弱，这体现在mTORC1直接底物4EBP1和P70-S6K磷酸化减少。相比之下，在AMPK KO HEK293T细胞中，mTORC1信号传导在991处理后没有变化（图3A）。然而，在WT和SA5 FNIP1细胞中，典型的mTORC1对P70-S6K1和4EBP1的信号传导在用991激活AMPK后被抑制、而TFEB和TFE3在SA5细胞中仍然完全磷酸化（图3B）。这揭示了FNIP1修饰影响mTORC1依赖性的磷酸化，但不影响S6K1和4EBP1的mTORC1磷酸化，与最近的多项研究一致。作者在FNIP1磷酸化位点突变体的背景下研究了，氨基酸（AAs）丰度对TFEB磷酸化状态和mTORC1活性的影响。mTORC1信号的传导，如p70S6K、S6、4EBP1的磷酸化，在被剥夺了氨基酸的WT和AMPK KO HEK293T细胞中都有所下降，被剥夺了AAs的mTORC1信号减少（图3C）。在被剥夺了AAs的细胞中，TFEB和TFE3在WT和AMPK KO细胞中都变得去磷酸化（图3C），这与用991处理的细胞形成鲜明对比，在WT细胞中TFEB和TFE3变得去磷酸化，但在AMPK KO HEK293T细胞中没有（图3A）。同样地，在WT FNIP1和SA5 FNIP1细胞中，在AA剥夺后，mTORC1信号传导减少。当WT FNIP1和SA5 FNIP1细胞被剥夺AA 1小时后，TFEB和TFE3也变得去磷酸化。而用991激活AMPK导致TFEB在WT FNIP1细胞中去磷酸化，但不包括SA5 FNIP1细胞。这些发现表明，AMPK-FNIP1介导对MiT-TFE转录因子家族的控制。

为了弄清AMPK激活后SA5细胞中残留的TFEB磷酸化是来自未受抑制的mTORC1依赖性磷酸化，还是一种未知的激酶，作者用2种强效和选择性的mTOR抑制剂，AZD8055和Torin1处理WT和SA5 FNIP1细胞，同时或不使用991。AZD8055和Torin1都减少了SA5 FNIP1细胞中TFEB的磷酸化，表明在这些细胞中观察到的TFEB过度磷酸化确实是mTORC1的结果（图3D）。虽然其它mTOR底物的磷酸化，如S6K1或4EBP1，不受FNIP1上AMPK位点突变的影响，但TFEB特别受到FNIP1的AMPK依赖性磷酸化的高度调节。

为了进一步了解TFEB在这种情况下的调控，作者产生了WT FNIP1和SA5 FNIP1 HEK293T细胞，这些细胞稳定地表达GFP标记的TFEB，并对这些细胞进行991处理（图3E）。来自WT FNIP1细胞的GFP-TFEB免疫沉淀物表明，991对AMPK的激活导致TFEB从mTOR和Raptor中分离。相反，在SA5-FNIP1细胞中，991没有这种作用，mTOR和Raptor仍然与GFP-TFEB相互作用（图3E）。尽管在SA5-FNIP1细胞中，mTORC1对S6K1和4EBP1的信号传导因AMPK的激活而减少，但在表达SA5 FNIP1的细胞中，由于mTORC1仍然与TFEB有关，似乎TFEB是构成性磷酸化的。

AMPK对FNIP1的磷酸化抑制了FNIP1-FLCN GAP的活性，通过RagC控制转录因子TFE

在受AAs刺激的细胞中，Rag GTPases招募mTORC1到溶酶体表面，在那里它被激活。Rag蛋白以异源二聚体的形式发挥作用，其中的活性复合物由GTP结合的RagA或RagB与二磷酸鸟苷（GDP）结合的RagC或RagD组成。mTORC1的激活因为AAs刺激GTP与RagA和RagB的结合，促进与Raptor的结合，激活mTORC1复合物的组装。在没有AAs的情况下，Rag采取非活性构象（GDP结合的RagA或B和GTP结合的RagC或D），导致mTORC1失活并重新定位到细胞质中。同时，活跃的Rag异质体与TFEB相互作用并促进TFEB被招募到溶酶体中，导致mTORC1依赖性的磷酸化并使TFEB保留在细胞膜上。耗尽或使Rags失活，可防止TFEB被招募到溶酶体。此外，FLCN中的一个催化精氨酸是TFEB和TFE3的氨基酸依赖性易位所必需的，将FLCN-FNIP1 GAP活性的控制与RagC的AA调节联系起来。为了进一步说明FNIP1如何被AMPK磷酸化控制TFEB，作者用991处理WT FNIP1和SA5 FNIP1细胞，稳定表达GFP-TFEB，并免疫沉淀GFP-TFEB。在10分钟内，内源性RagA，特别是内源性RagC与GFP-TFEB的相互作用增强，并在处理过程中保持不变（图3F）。反之，在SA5 FNIP1细胞中，RagA和RagC与TFEB的相互作用在用991处理后没有改变（图3F）。RagB与TFEB的结合是最小的而且在WT和SA5 FNIP1之间或在991处理后没有变化。为了可视化AMPK激活后细胞中RagC和mTOR的定位变化，作者使用RagC或mTOR的抗体对内源性RagC或mTOR进行免疫荧光成像的检测。在新鲜培养基中，WT FNIP1细胞中RagC与溶酶体标志物Lamp2存在共定位（图3G和H）。如果用991激活AMPK，RagC与Lamp2的定位通过Pearson's correlation测量，是WT FNIP1细胞的三分之一，但在有或没有991的SA5 FNIP1细胞中仍与Lamp2定位（图3，G和H），这证实了前面的实验结果。

在AMPK被991激活的细胞中，RagC和TFEB的相互作用增强，表明RagC不仅是TFEB招募到溶酶体的必要条件，而且与RagC结合的增加可能会促进TFEB从溶酶体中移除。作者深入探讨了FNIP1被AMPK磷酸化如何触发控制TFEB的溶酶体机制。FLCN-FNIP1复合物作为RagC和RagD的GAP发挥作用，促进RagC和RagD的GDP结合状态，这是mTOR招募到溶酶体所需要的。因此，AMPK对FNIP1的磷酸化可能改变了FLCN-FNIP1复合物的GAP活性。为了测试这一点，作者在WT FNIP1和SA5 FNIP1或WT和AMPK KO细胞中瞬时转染了一个HA标记的、GTP锁定的RagC突变体（Q120L）或一个HA标记的GDP锁定的RagC突变体（S75N），并用991处理它们（图3I）。如果AMPK对FNIP1的磷酸化阻断了FLCN-FNIP1复合物对RagC的GAP活性，那么加载GDP的RagC应该在缺乏AMPK的细胞或者SA5细胞中积累。该模型的一个预测结果是，过量表达GTP锁定的突变体（Q120L）而不是GDP锁定的RagC突变体（S75N）应该在AMPK KO细胞和SA5 FNIP1细胞中恢复TFEB和TFE3去磷酸化。过度表达GTP锁定的RagC取代了SA5 FNIP1的作用，允许TFEB和TFE3在有或没有991的SA5细胞中被去磷酸化（图3I）。

作者在WT FNIP1中观察到相反的效果，在用991处理后，当GDP锁定的RagC突变体被过度表达时，与GTP锁定的RagC相比，TFEB的去磷酸化发生得更少（图3I）。在AMPK KO细胞中观察到类似的结果，其中GTP锁定的RagC克服了AMPK缺失的缺陷，使TFEB去磷酸化，而阻止了WT细胞中TFEB的完全去磷酸化。因此，AMPK对FNIP1的磷酸化似乎抑制了FLCN-FNIP1的GAP的激活。它促使RagC以其无活性的GTP结合形式积累，它不仅从溶酶体上脱落（图3G和H），而且还能更紧密地与TFEB结合（图3F）。使用表达GTP或GDP的RagC突变体的细胞进行免疫沉淀实验，在在与图3I所示相同的条件下，显示在WT FNIP1细胞中，更多的TFEB在GTP锁定的状态下与RagC结合，绕过了AMPK激活的需要。而GDP锁定状态只有在用991处理细胞时才会发生结合（可能是因为存在内源性RagC的存在，在991处理的细胞中它也会结合TFEB）（图3J）。此外，在SA5 FNIP1细胞中，外源性GTP锁住的RagC与TFEB有关，推翻了SA5突变的影响，而GDP锁定的RagC没有以同样的程度与TFEB结合，无论细胞是否用991处理（图3J）。与缺乏AMPK的细胞相比，在WT细胞中也观察到类似的模式。这些结果进一步证实和解释了图3F中所示的结果：在具有AMPK活性的细胞中，HA-RagC-TFEB相互作用的增加，因为FLCN-FNIP1 GAP复合物的激活，将RagC转变成GTP结合状态，它与TFEB的结合比RagC的GDP结合形式更强。尽管GDP-RagC将TFEB招募到溶酶体上进行mTOR依赖性的磷酸化，但GTP-RagC则将TFEB从溶酶体上脱落下来，防止其磷酸化。

图3 AMPK磷酸化FNIP1，阻断FLCN-FNIP1的GAP活性 以控制RagC，从而控制TFEB 和TFE3的活性。

FNIP1被AMPK磷酸化是溶酶体生物生成的必要条件

MiT-TFE家族的转录因子，包括TFEB和TFE3，是致癌基因和溶酶体生物生成的主调控因子。鉴于AMPK的激活会导致TFEB和TFE3的核转位，它们的转录活性增加是可以预期的。作者在WT和AMPK KO HEK293T细胞中的RNA-seq数据显示了AMPK依赖的溶酶体基因特征。为了评估FNIP1被AMPK磷酸化的功能作用，作者通过RNA-seq分析了WT和SA5 FNIP1细胞中用991处理0至16小时的的全局转录。GSEA 分析显示，与同样处理的SA5 FNIP1细胞相比，"KEGG溶酶体"是WT FNIP1中最富集的基因组之一（图4A）。

为了更深入地研究AMPK和FNIP1如何控制溶酶体生物学，作者手动策划了一个约1500个基因的列表，其中包括实验验证的CLEAR目标基因和分子特征数据库（MsigDB）-GSEA定义的TFEB目标。

基因表达模式分析显示，在WT FNIP1条件下，约75%的CLEAR靶基因在AMPK激活后转录增加（图4B）。这些基因主要集中在4个方面，其中一组在2至4小时内显示出早期转录激活；第二组表现出两波转录，一波在早期时间点（2小时），另一波在较晚的时间点（16小时）。16小时），第三组从2小时开始就被激活，但一直到16小时都保持较高的水平，第四组主要是在较晚的时间点（8至16小时）做出反应。这些基因中的很大一部分在991处理的WT FNIP1细胞中的表达量增加，而在过表达SA5 FNIP1的细胞中却没有对AMPK的激活作出反应（约600个基因）（图4 B和C）。

为了验证作者RNA-seq分析中的一些目标，作者将另一批WT FNIP1和SA5 FNIP1细胞用991延长处理0-30小时，并用引物进行qPCR，靶向检测几个典型的CLEAR基因。

PCR检测的表达模式与RNA-seq数据中的相似。在WT FNIP1细胞中，991给药后2到16小时内检测到，SESN， Hex a， Neu1， Lamp1， FNIP2， 和ULK1的mRNA表达水平迅速增加，从约1.2到6倍不等（图4D到I）。对于几个溶酶体CLEAR靶基因，如Neu1、SESN、HEXA和Lamp1，在WT FNIP1细胞中观察到两个独立的转录波。一个是在早期的时间点，即1到2小时之间，另一个是较大的转录波，发生在16至24小时，CLEAR基因转录率上升。然而，当FNIP1上的AMPK磷酸基点发生突变时，没有发现CLEAR基因的转录增加（图4D至I）。

在TFEB-TFE3 DKO组与对照组相比，AMPK-FNIP1-依赖性溶酶体基因的一个子集的表达受损，包括GLA和LAMTOR4（图4J和K）。为了进一步研究AMPK和FNIP1对溶酶体蛋白的影响，作者检查了溶酶体成分的蛋白表达包括Lamp1、Lamtor 1和cathepsin B。在991处理后，新生的、非糖基化的Lamp1蛋白的数量反映了Lamp1 mRNA的表达水平，显示出WT FNIP1细胞中Lamp1 mRNA和蛋白的表达增加（图4L）。相比之下，在过量表达SA5 FNIP1的细胞中，没有测到Lamp1蛋白的丰度变化，在AMPK激活前，其含量与WT FNIP1细胞一样低；Lamtor1和cathepsin B的表达模式与Lamp1相似（图4L）。作者使用免疫荧光成像技术，通过对细胞内Lamp2的染色来分析溶酶体结构。通过测量溶酶体体积和Lamp2的荧光强度，对溶酶体结构进行了定量。用991处理的WT FNIP1细胞中，超过0.1毫米阈值体积的溶酶体结构的百分比，显示出与Lamp1 mRNA和蛋白质相同的双相上调模式（图4G和L到N）。在991处理的SA5 FNIP1细胞中，溶酶体的百分比不同，但没有超过起始时间点的增加（图4M和N）。作者还对每个溶酶体的Lamp2总强度进行了定量，它没有出现双相模式，但在WT FNIP1而不是SA5 FNIP1细胞中，991处理16和24小时后确实有所增加（图4O）。因此，FNIP1被AMPK磷酸化似乎有助于溶酶体生物生成（图4P）。

图4 由MiT-TFE转录因子家族介导的溶酶体生物生成依赖于AMPK对FNIP1的磷酸化

AMPK对PGC1α基因诱导的调节受FNIP1磷酸化的制约

在作者的RNA-seq数据集，phenformin， rotenone和CCCP都能诱导WT细胞中PGC1α（PPARGC1A）mRNA的表达，但是在AMPK KO细胞中没有此作用。RNA-seq分析还显示991诱导WT FNIP1细胞中PPARGC1A mRNA的转录，而不是在SA5 FNIP1细胞（图4C）。

PPARGC1A近端启动子是TFEB和TFE3的直接目标。因此，AMPK通过影响FNIP1磷酸化控制TFEB-TFE3，可能是长期寻找的机制之一，支撑着线粒体生物生成的转录调节。qPCR结果显示PGC1α在991处理的WT FNIP1细胞中转录增加，但是在SA5 FNIP1细胞中转录没有增加（图5A）。PPARGC1A含有两个潜在的CLEAR元件来指导TFEB和TFE3的结合，毗邻经典外显子1a的近端启动子中。除了不同的启动子外，PPARGC1A基因的第6和第7外显子之间的替代剪接产生了一个编码PGC1α的N端异构体的转录本，其中含有267个经典PGC1α的AA和来自剪接插入的3个AA（图5B）。NT-PGC1α是一种构成型的转录辅助因子，因为它保留了全长PGC1α的转录激活和核受体相互作用结构域，但不再受制于与全长蛋白相关的磷酸化介导的变动，从而导致PGC1α的截断和转录活性形式，具有较长的蛋白半衰期。为了进一步研究PPARGC1A在991处理的细胞中的调控，作者通过Western检测了内源性的PGC1α蛋白的表达（图5C）。在991处理的WT或SA5 FNIP1细胞中，作者没有检测到PGC1a的典型的、全长约100kDa异构体。然而，在FNIP1被磷酸化，TFEB和TFE3被激活的相同条件下，作者确实检测到991处理后WT FNIP1细胞中，更小的~35 kDa的N端异构体的表达有时间依赖性的增加（图5C）。35 kDa PGC1α蛋白的这些变化通过密度测量法进行定量，显示在WT FNIP1细胞中，991处理后PGC1α的表达增加了8-16倍（图5D）。在SA5 FNIP1细胞中，较短的PGC1α蛋白的丰度仍然相对较低（图5C和D）。作者用两种商业抗体检测到类似的变化，这两种抗体都已被验证用于检测NT-PGC1α的异构体。为了与作者最初观察到的PPARGC1A mRNA总量（针对共同的第2外显子，存在于所有剪接异构体中）进行比较，作者用针对外显子5和7a的引物进行了qPCR，专门检测NT-PPARGC1A替代剪接形式的表达（图5A）。在用991处理的WT FNIP1细胞中，NT-PARGC1A似乎比PPARGC1A mRNA总量增长更明显；在表达SA5 FNIP1的细胞中没有检测到变化（图5A）。

CCCP处理的WT细胞和AMPK KO细胞的qPCR观察到与991处理组类似模式，用CCCP处理后，NT-PPARGC1A短异构体在WT细胞中积累，但不在缺乏AMPK的细胞中积累（图5E）。991处理后，WT细胞中的NT-PPARGC1A短异构体也出现了类似的结果，但在缺乏AMPK的细胞中没有（图5F）。因此，NT-PGC1α异构体是PGC1α在HEK293T细胞中对线粒体毒物、葡萄糖饥饿或991处理后AMPK激活的反应中所表达的主要剪接异构体。

为了确定FNIP1是否是AMPK和PGC1α之间促进线粒体生物生成的关键环节，作者对RNA-seq数据集进行了等级聚类和差异表达分析。线粒体基因的mRNA表达在2-16小时在991处理后会增加，大部分转录物在研究的最长时间点积累（图5G）。值得注意的是，当FNIP1中的AMPK磷酸化位点在SA5 FNIP1样本中发生突变时，即使用991处理细胞，这些转录物也没有增加（图5G和K）。为了研究AMPK对FNIP1的磷酸化是否通过PGC1触发线粒体生物生成，并确定由AMPK和FNIP1调节的线粒体的基因特征，作者使用siRNA来敲低HEK293T细胞的PGC1α，用991处理细胞后进行RNA-seq。PGC1α的耗竭导致291个线粒体基因的表达减少，其中约80个基因的子集是依赖于AMPK对FNIP1的磷酸化（图5H和M）。

为了测试线粒体基因表达的变化是否由AMPK-FNIP1对TFEB的控制所介导，作者还分析了WT和TFEB-TFE3 DKO RNA-seq数据集中线粒体基因的表达。作者特别检查了AMPK和FNIP1-依赖的线粒体的基因，并观察到与CLEAR网络基因类似的情况：大约50%的AMPK-FNIP1依赖的线粒体基因在991处理的WT细胞中会增加，但是不会在TFEB TFE3 DKO样本中增加（图5 I和L）。作者调查了表达WT FNIP1或SA5 FNIP1的细胞中用991处理后线粒体基因的表达情况。通过qPCR验证了几个PGC1α线粒体靶点的转录。IDH2、Cox IV、Cyto C、SOD2和UCP2的mRNA水平在早期时间点仍然很低，但在991给药后16至24小时之间累积（图5P）。在表达SA5 FNIP1的细胞中，尽管用991长时间刺激细胞或剥夺葡萄糖，所有测试的线粒体基因的转录都没有增加（图5P）。尽管许多溶酶体基因显示出两波表达，但线粒体基因的表达一般发生在较晚的时间点，这与与PGC1α的调节相一致，其mRNA本身的转录与溶酶体生物发生的第一次高峰保持一致（图5Q中的模型）。

AMPK-FNIP1诱导的线粒体生物生成需要ERRa

PGC1α通过与ERRα相互作用启动线粒体生物生成，ERRα基因的转录也可以随着PGC1α的增加而增加。作者重点关注AMPK和FNIP1依赖的线粒体基因，以评估这些基因中哪些在WT对照组中被991上调，但在ERRα不存在时被抑制（图5J和N)。作者通过qPCR验证了其中几个基因的表达，包括CPT1A、COX6A1、IDH2和PDHA1，并观察到在用991处理的细胞中转录增加，在16至24小时的后期，转录增加的幅度最大。在缺乏ERRα的细胞中，991并没有诱导这些基因的转录。作者接下来进行了一个四向的比较，受到991调控的线粒体基因的变化 (i) WT和SA5 FNIP1细胞，(ii) WT和TFEB-TFE3 DKO细胞，(iii) 对照组和PGC1α siRNA细胞，以及（iv）WT和缺乏ERRα的细胞（图5O）。作者观察到所有组间有190个AMPK和FNIP1依赖的基因重叠，有131个受一个或多个因素的调节。20个线粒体基因受所有4个因子的调节，61个基因受其中3个因子的调节。在这四种条件下，（以SA5-FNIP1依赖性的方式），作者提出了一个核心的最小AMPK-FNIP1-TFEB-PGC1α-ERRα依赖的基因组，参与线粒体生物生成（图5Q）。

图5 AMPK对FNIP1的磷酸化是通过MiT-TFE转录因子诱导PGC1α和ERRα介导的线粒体生物生成程序的关键。

AMPK-FNIP1是线粒体和溶酶体生物生成的必要条件

作者对线粒体蛋白进行了免疫印迹，这是作为线粒体生物生成的一个衡量标准。在991处理的WT FNIP1细胞中而不是在SA5 FNIP1细胞中，作者检测到关键线粒体蛋白的表达增加，包括IDH2，UQCRB，NDUFB3（图6A）；这些都是在RNA seq数据库中检测到的，显示出类似的表达模式。一致的是，线粒体蛋白，如UQCRB、PDHA1和NDUFB3，经991处理后，WT细胞的表达量增加，而TFEB-TFE3 DKO细胞中则没有，表明这些蛋白质也需要TFEB和TFE3（图6B）。最后，作者还在siRNA敲除PGC1α或CRISPR删除ERRα后对这些线粒体蛋白进行免疫印迹，观察到PGC1α和ERRα（图6C）都是这些线粒体蛋白在991处理的细胞中积累的必要条件。

尽管线粒体生物生成所需的大部分基因是由细胞核编码的，但线粒体基因组编码13种蛋白质，这些蛋白质是OXPHOS系统的组成部分。作为衡量线粒体生物生成的另一个参数，作者在线粒体基因转录和蛋白表达最大的24小时的时间点，通过qPCR定量测定相对线粒体DNA（mtDNA）的拷贝数（即线粒体基因与参考核基因之间的比率）。在用991处理24小时的细胞，作者观察到WT FNIP1细胞中的mtDNA丰度增加了约30%，但SA5 FNIP1细胞中没有(图6D）。

图6 AMPK-FNIP1介导的线粒体生物生成影响线粒体的功能。

讨论

FNIP1最初被确定为FLCN的一个伴侣蛋白，并在同一研究中发现与内源性AMPK亚单位共同免疫沉淀，但是在此后的几十年里，FNIP1介导AMPK功能方面的作用从未被研究过。随后的研究集中在FLCN缺失状态下AMPK信号如何被过度激活。作者的研究结果表明，AMPK和FLCN-FNIP1之间的生理关系是，在代谢应激后，AMPK位于FLCN-FNIP1的上游，其中AMPK依赖的FNIP1的磷酸化急性抑制FLCN-FNIP1的GAP功能，从而导致TFEB的激活。FNIP1-FLCN GAP复合体控制RagC，将TFEB和TFE3保留在溶酶体上，并且TFEB和TFE3是mTORC1的特定和选择性的底物。在FLCN FNIP1复合物中，FLCN的GAP活性需要一个关键的精氨酸，用于AA诱导控制的TFEB和TFE3的转位。

作者的数据表明，AMPK的激活抑制FLCN-FNIP1的GAP活性，促进GTP负载的RagC的积累、Rag复合物的非活性状态。这种机制使TFEB和TFE3在低能量条件下被激活，即使在AA丰富的情况下也可以。AMPK对FNIP1的磷酸化促进了RagC和mTOR从溶酶体中分离出来，以及mTOR与TFEB本身的分离，这与mTORC1-介导的TFEB磷酸化的丧失相一致。

在AMPK缺乏或FNIP1中5个AMPK位点发生突变的细胞中，即使面对能量应激，FNIP1-FLCN复合物也不能被AMPK调节，mTOR仍然与溶酶体表面的TFEB结合，使TFEB不能被线粒体毒物、葡萄糖剥夺或直接的AMPK激活剂的激活产生抵抗力。因此，AMPK通过其对FNIP1的磷酸化维持对TFEB和TFE3的特异性控制，这与AA对FLCN-FNIP1复合物的调节无关。综上所述FNIP1在Ser220、Ser230、Ser232、Ser261和Ser593的磷酸化是AMPK控制MiT-TFE家族的一个关键机制。AMPK通过该机制控制MiT-TFE家族的转录因子，以增加溶酶体生物生成，同时增加PGC1α mRNA，诱导线粒体的生物生成，将FNIP1置于多个AMPK依赖过程的中心，而AMPK的直接生化底物仍未被发现。