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摘要
溶酶体是代谢稳态的核心，小眼bHLH-LZ转录因子(MiT/ TFE)家族成员MITF、TFEB和TFE3促进溶酶体和自噬基因的转录，并且在癌症中经常失调。在本文中，作者发现GATOR2复合物在调控TORC1和保护MiT/TFE蛋白不被降解中具有独立的作用，因此这一过程在协调细胞代谢和控制溶酶体自噬系统中起着核心作用。
溶酶体功能的失调导致多种疾病，包括癌症、神经性疾病和溶酶体贮积症。碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸链MiT/TFE家族成员（MITF/TFEB/TFE3）通过促进多种溶酶体和自噬基因的转录来调节溶酶体功能。MiT/TFE活性的严格调控允许细胞在各种细胞环境中通过刺激溶酶体和自噬体的生物发生来维持代谢稳态。MiT/TFE的缺失导致溶酶体自噬缺陷和功能障碍。值得注意的是，MiT/TFE在癌症中经常失调,包括代谢过度活跃的KRAS驱动的胰腺导管腺癌(PDAC)和肾细胞癌(RCC)，因此，MiT/TFE代表了癌症治疗的有吸引力的靶点。
GATOR2复合物通过对抗TORC1抑制剂GATOR1的活性来激活TORC1。通过计算和结构分析表明，GATOR2复合物的多个组分具有涂层蛋白和膜系复合物的结构特征。与膜外壳蛋白结构相似，GATOR2定位于TORC1调控的溶酶体上。在典型的TORC1信号通路中，活化的Rag GTPase (RagA-GTP)将含有TOR信号传导(TOS)基元位点的底物(包括S6K、4EBP1和ULK1)招募到溶酶体中，在此过程中，它们被TORC1磷酸化，这一过程依赖于小的GTPase Rheb.。在第二种非典型途径中，Rag GTPase将MiT/TFE转录因子招募到溶酶体中，在此过程中，它们被TORC1以不依赖于Rheb的方式磷酸化，导致它们的胞质保留或降解。与典型的TORC1信号不同，MITF的募集依赖于RagC-GDP，因此需要RagC GTPase激活卵泡蛋白(FLCN)。
在这里，作者证明了GATOR2复合体通过阻止独立于GATOR1-TORC1轴和非经典TORC1信号通路的MiT/TFE转录因子的降解来调节溶酶体功能。发现GATOR2通过保护MiT/TFE免受蛋白降解而促进PDAC细胞的恶性行为。最后，z作者发现GATOR2的缺失降低了Xp11易位性肾细胞癌(tRCC)细胞中致癌TFE3融合蛋白的水平。因此，GATOR2复合物调节了两个对细胞代谢控制至关重要的途径，即TORC1信号传导和MiT/TFE依赖性溶酶体自噬系统。
结果
1、GATOR2维持溶酶体功能独立于TORC1活性
溶酶体是TORC1激活的中枢。GATOR2复合物位于溶酶体表面，由5个高度保守的蛋白(MIOS、WDR24、WDR59、SEH1和SEC13)组成，通过对抗TORC1抑制剂GATOR1的功能来激活TORC1(图1A)。之前对HeLa细胞和果蝇的研究确定了GATOR2亚基WDR24是溶酶体蛋白降解所必需的。我们想确定在哺乳动物细胞中，GATOR2复合物是否独立于GATOR1和TORC1活性调节溶酶体功能。如图1C和1D所示，GATOR1组分NPRL3的敲低恢复了WDR24-KO细胞中TORC1的活性，这表明TORC1靶点S6K磷酸化增加。然而，溶酶体pH值和货物蛋白LC3和p62的降解仍然存在缺陷(图1B、1C和1E)。为了证实GATOR2独立于GATOR1维持溶酶体功能，作者产生了WDR24和GATOR1组分DEPDC5 (WDR24-KO/DEPDC5-KO)的双敲除(KO)细胞。先前的研究表明，删除GATOR1的三个亚基中的任何一个都足以使其功能失效。我们确定p62在WDR24/DEPDC5双KO (dKO)细胞中积累(图10和1R)，但在DEPDC5-KO细胞中不积累。这些数据表明，在哺乳动物细胞中，GATOR2组分WDR24是维持独立于GATOR1的溶酶体降解功能所必需的。因此，已经确定了GATOR2复合物在维持溶酶体稳态中的功能，该功能独立于GATOR1-TORC1信号轴。
图1
2、GATOR2促进溶酶体和自噬基因的表达
为了更好地理解GATOR2复合物在溶酶体功能中的作用，作者检测了WDR24-KO细胞中多种溶酶体蛋白的水平。溶酶体V-ATP酶复合体将质子从细胞质泵入溶酶体腔内，以维持溶酶体的酸性pH，这是溶酶体酶活性所必需的。如图1F-1I所示，在WDR24-KO细胞中，V-ATPase亚基ATP6V1B2、ATP6V1D和ATP6V0D1的蛋白水平明显低于野生型(WT)细胞。除了V-ATPase成分外，WDR24-KO细胞中溶酶体酶Cathepsin D以及溶酶体结构蛋白LAMP1和LAMP2的蛋白水平也明显低于WT(图1J-1N)。此外，GATOR1亚基Nprl3和DEPDC5的KD或KO分别不能挽救WDR24-KO细胞中低溶酶体蛋白水平(图1F-1Q)。这些数据表明，需要GATOR2来维持独立于GATOR1的许多溶酶体蛋白的水平。值得注意的是RT-qPCR实验显示，WDR24的缺失导致所有6个基因的转录水平下降。(ATP6V1B2, ATP6V1D, ATP6V0D1, Cathepsin D, LAMP1和LAMP2)(图1S)。
溶酶体-自噬途径中许多基因的一个共同特征，是溶酶体协调表达和调控(CLEAR)元件的存在。CLEAR元件是MiT/ TFE转录因子家族的靶标，并驱动溶酶体自噬功能所需的基因的表达。使用RT-qPCR来确定WT与WDR24-KO细胞中含有CLEAR基序的50个额外基因的转录水平。值得注意的是，与WT相比，WDR24-KO细胞中所有50个含有CLEAR元件的基因的转录水平都降低了(图S)。综上所述，已经确定GATOR2复合体具有与torc1无关的功能，即可促进多种携带CLEAR基序的溶酶体自噬基因的表达。
3、GATOR2维持MiT/TFE蛋白水平
TFEB、MITF和TFE3是MiT/TFE转录因子家族的成员，在溶酶体自噬途径中具有独特和重叠的靶点。内源性TFEB免疫染色表明，由于TORC1活性降低，TFEB被转移到WDR24-KO细胞的细胞核中;然而，TFEB的整体信号强度明显低于WT细胞(图S3A)。在营养充足的条件下，TFEB被Rag GTPase招募到溶酶体中，在那里它被TORC1磷酸化在多个丝氨酸上，包括S211，这阻止了它转运到细胞核。我们发现在喂食的WT HeLa细胞中，TFEB与溶酶体标记物LAMP1共定位(图S3B)。然而，western blot结果显示，相对于WT HeLa细胞，内源性TFEB和TORC1磷酸化的TFEB (P-TFEB) S211水平在WDR24-KO细胞中显著降低(图2A和2B)。正如在图1B和1C中的结果所预测的那样，通过敲低NPRL3来恢复TORC1的典型激酶活性并不会增加内源性TFEB水平。此外，通过转染CMV启动子控制的GFP-TFEB质粒过表达TFEB, WDR24-KO细胞中TFEB蛋白水平无法恢复(图2C和2D)。最后，确定WDR24单个ko细胞中观察到的低水平TFEB、MITF和TFE3在WDR24- ko /DEPDC5-KO dKO细胞中没有恢复(图2L和20)。总之，GATOR2亚基WDR24是维持HeLa细胞中独立于GATOR1的TFEB蛋白水平所必需的。
接下来，检测了GATOR2复合体的其他成员，包括MIOS、Seh1和WDR59，是否需要维持MiT/TFE蛋白水平。在MIOS-KO和Seh1-KD细胞中观察到类似的低MiT/TFE蛋白水平模式(图2E, 2F, 2J和2K)，以及几种V-ATP酶亚基水平较低和p62降解缺陷(图2G-2I)。然而，在WDR59-KO细胞中，MiT/TFE蛋白水平与WT相当。此外，WDR59-KO细胞具有正常的溶酶体功能(图2E-2I)。这些数据表明WDR59调节GATOR1和GATOR2之间的相互作用,综上所述，表明GATOR2复合物组分MIOS、Seh1和WDR24是维持MiT/TFE蛋白水平所必需的。
RAG GTPase是MiT/TFE的重要调控因子。在营养充足的条件下，RAGA和RAGC将MiT/TFE招募到溶酶体中，在那里它们被TORC1的非典型激酶活性磷酸化，导致它们在细胞质中被隔离和/或被蛋白酶体降解.因此，在营养充足的条件下，TORC1磷酸化限制了MiT/TFE的活性。如前所述，P-TFEB S211水平在RAGA和RAGC-KO细胞中大幅降低，而MiT/TFE总蛋白水平相对于WT增加(图2M, 2N, 2P和2Q)。如果GATOR2通过Rag GTPase控制MiT/TFE的稳定性，那么GATOR2与RAGA或RAGC的dKOs将增加MiT/TFE水平，然而，发现WDR24/RAGA和WDR24/RAGC dKO细胞具有与WDR24单一KO细胞相似的低水平MiT/TFE蛋白(图2M, 2N, 2P和2Q)。从这些数据中得出结论，GATOR2亚基WDR24独立于RAG GTPase调节MiT/TFE蛋白水平。
图2
4、GATOR2抑制MiT/TFE的蛋白酶体降解
GATOR2突变细胞中MiT/TFE蛋白水平的下降可能是基因转录或翻译减少或蛋白质降解增加的结果。RT-qPCR数据并未显示WDR24-KO细胞中MITF或TFE3转录水平显著下降(图3A)，而TFEB转录水平下降了约50%。这一结果表明WDR24可能通过影响TFEB的转录来部分调节其蛋白水平。然而，mRNA水平降低50%并不能完全解释WDR24-KO细胞中TFEB蛋白的显著降低(图2A)。此外，观察到，与WT细胞相比，WDR24-KO细胞中CMV启动子过度表达的TFEB蛋白水平显著降低(图2C)，这表明GATOR2通过转录以外的途径控制TFEB蛋白水平。因此，接下来研究了MiT/TFE在GATOR2突变细胞中是否会发生蛋白质降解。如图3B-3D所示，MiT/FTE蛋白在WDR24-KO细胞中泛素化，并且在蛋白酶体抑制剂MG132处理后，MiT/FTE蛋白水平升高(图3E)。这些数据表明，在GATOR2突变体中，MiT/TFE通过泛素介导的蛋白酶体被降解。综上所述，作者发现GATOR2亚基抑制MiT/TFE蛋白的降解。
蛋白质可被K48或K63泛素化，分别导致蛋白酶体降解或功能调节。在WDR24-KO细胞中，MiT/TFE被蛋白酶体降解，因此预测它们会被K48泛素化。为了验证这一假设，用HA标记的K48泛素转染细胞，并使用抗HA抗体在WT和WDR24-KO细胞中进行免疫沉淀。发现MiT/TFE在WDR24-KO HeLa细胞中k48泛素化(图3F-3H)。通过用泛素K48R突变体得到了相反的结果。综上所述，MiT/TFE在WDR24-KO细胞中K48泛素化。
最后，使用UbPred(一种预测蛋白质泛素化位点的软件)，在TFEB中鉴定出四种赖氨酸(K219, 347,430, 431)，它们在WDR24-KO细胞中泛素化(图3I)。当这些赖氨酸通过体外突变转化为精氨酸时，TFEB的突变形式(TFEB4KR:赖氨酸到精氨酸)对泛素化具有抗性(图3J)，并且与营养状况无关，靶向细胞核(图3K)。在WDR24-KO细胞中观察到相对于WT TFEB更高的TFEB4KR蛋白水平，这表明该突变体具有抗降解能力。此外，与WT TFEB观察到的不同，TFEB4KR的表达恢复了WDR24-KO溶酶体缺陷(图3L-3N)。总之，对TFEB的泛素化分析证实，WDR24-KO细胞中的溶酶体缺陷是由于MiT/ TFEB蛋白酶体降解增加所致。
图3
5、在GATOR2突变细胞中，三个E3泛素连接酶使MiT/TFE泛素化
为了鉴定与GATOR2亚基相互作用的E3泛素连接酶，搜索了大型蛋白质相互作用数据，并选择了HERC2、SKP2和HECW2。具体来说，HERC2与WDR24和MIOS, HECW2与MIOS和Seh1, SKP2与WDR59相互作用。在WT和WDR24- ko HeLa细胞中对上述E3连接酶进行siRNA KD，然后检测TFEB水平的恢复，HERC2的KDs导致WDR24-KO HeLa细胞中TFEB水平的轻度恢复(图4A和4B)。先前的研究表明HERC2与第二种E3连接酶UBE3A (E6AP)具有功能和物理相互作用，发现UBE3A的KDs也增加了WDR24-KO细胞中TFEB蛋白的水平(图4A和4B)。最后确定，之前被证明在P-TFEB S211降解中起作用的E3连接酶STUB1的耗尽也会增加WDR24-KO细胞中的TFEB水平(图4A和4B)。任何单个E3连接酶的KD都会导致TFEB蛋白水平的部分增加，而HERC2、UBE3A和STUB1的三重KD导致TFEB完全恢复，与WT中观察到的结果相当(图4C和4D)，这表明所有三种E3连接酶都以TFEB降解为目标。
为了研究三种E3连接酶如何调节MiT/TFE中K48泛素化，使用了一种特异性识别K48泛素的抗体，发现在三种E3连接酶HERC2、UBE3A和STUB1的单独kd后，WDR24-KO细胞中TFEB、MITF和TFE3上K48泛素的程度降低(图4F-4K)。为了检验MiT/TFE是否是E3连接酶的直接靶点进行了体外泛素化实验。当添加到MiT/TFE和泛素化系统的其他组分中时，UBE3A、HERC2或STUB1可以单独泛素化MiT/TFE(图4L-4N)。此外，当所有三种E3连接酶都参与反应时，泛素化水平升高(图4L-4N)，这表明UBE3A、STUB1和HERC2可能协同促进MiT/TFE泛素化。总之，这些数据证实，在GATOR2突变细胞中，三个E3连接酶均靶向MiT/TFE介导的蛋白酶体降解。
图4
最后，利用共免疫沉淀(CO-IP)来确定GATOR2亚基WDR24、MIOS和WDR59是否与E3连接酶HERC2、UBE3A和STUB1有相互作用。内源性WDR24和MIOS与所有三种连接酶共同免疫沉淀(图5A和5B)。值得注意的是，E3连接酶和GATOR2亚基之间的相互作用需要MIOS和WDR24同时存在，而WDR24不能在MIOS- ko细胞中复制这三个E3连接酶，反之亦然(图5A和5B)。此外，进行了内源性CO-IP来检测UBE3A、HERC2和STUB1与MiT/TFE之间的相互作用。正如预期的那样，MiT/TFE仅在WDR24-KO细胞中与E3连接酶结合(图5C-5E)，进一步表明GATOR2抑制E3连接酶结合MiT/TFE。综上所述，在缺乏GATOR2复合物的细胞中，E3连接酶HERC2、UBE3A和STUB1促进了MiT/TFE的k48泛素化和功能破坏。
图5
6、GATOR2介导的MiT/TFE保护机制促进PDAC细胞的恶性
MiT/TFE蛋白是导致胰腺癌的代谢的核心。在KRas过度活跃突变的PDAC细胞中，MiT/TFE对TORC1抑制调控变得难以控制，从而将其限制在细胞质中。MiT/TFE的核输入增加反过来又驱动溶酶体基因的表达，从而增强胰腺癌生长和侵袭所必需的分解代谢功能。假设GATOR2复合物通过促进TORC1活性和维持MiT/TFE水平来促进PDAC细胞的侵袭性恶性肿瘤。为了验证该模型，使用了两种PDAC细胞系Panc-1和Panc 03.27，它们分别具有KRas G12D和G12V高活性突变.与在GATOR2 KO HeLa细胞中观察到的表型一致，Panc-1和Panc 03.27细胞中WDR24的siRNA kd导致溶酶体pH升高(图6A)，V-ATPases亚基和MiT/TFE蛋白水平降低(图6B - 6d)，溶酶体cargo降解缺陷(图6B, 6E和6F)。值得注意的是，在WDR24-NPRL3共敲低的PDAC细胞中，TORC1活性的恢复并没有恢复低MiT/TFE蛋白水平或溶酶体表型。这些数据表明，正如在HeLa细胞中观察到的那样，在PDAC细胞中，GATOR2突变体中MiT/TFE蛋白水平的调节与TORC1活性分离。此外，GATOR2亚基WDR59不需要维持PDAC细胞中TFEB和TFE3的蛋白水平(图S7)，与HeLa细胞一致(图2E)。重要的是，在WDR24-KD PDAC细胞中，TFEB4KR的过表达挽救了有缺陷的溶酶体表型(图6G-6K)，如V-ATPases亚基(图6H和6I)、p62降解(图6J和6K)和溶酶体自噬基因转录(图S6)水平的增加。综上所述，证实了PDAC细胞与HeLa细胞具有相同的GATOR2依赖性MiT/TFE保护系统，这是溶酶体功能所必需的。
作者接下来研究GATOR2如何影响PDAC细胞恶性。从图6L和图6M可以看出，WDR24给药后Panc-1和Panc 03.27细胞的增殖率明显降低。通过敲除NPRL3来恢复TORC1活性并不能完全恢复细胞增殖。然而，TFEB4KR突变体的过表达，结合siNPRL3处理，恢复了WDR24水平KD引起的细胞增殖缺陷。癌细胞的转移和侵袭需要溶酶体酶的强大功能与我们在细胞增殖中的发现相似，确定了GATOR2组分WDR24促进了不依赖于TORC1调控的PDAC的侵袭行为(图6N和60)。综上所述，GATOR2复合物通过保护MiT/TFE免受蛋白降解，在一定程度上促进了PDAC细胞的侵袭行为和增殖。
上皮-间质转化(EMT)是细胞获得迁移和侵袭特性的过程，是癌细胞转移潜力的标志使用针对EMT标记物的抗体:E-Cadherin、ZEB1和Slug56来观察PDAC细胞的EMT是否需要GATOR2亚基WDR24。发现Panc-1和Panc 03.27细胞中WDR24的siRNA KD增加了E-Cadherin的蛋白水平，同时降低了ZEB1和Slug的水平(图6P-6R)，这表明这些PDAC细胞在失去WDR24表达时失去了EMT标志。总之，证明了GATOR2复合物通过促进TORC1活性、抑制MiT/TFE降解和维持EMT过程来促进PDAC细胞的转移能力。
图6
7、GATOR2维持肾细胞癌细胞中MiT/TFEs蛋白水平
解除对MiT/TFE的调控有助于肾细胞癌的发展。为了补充研究，作者检测了两种患者来源的肾癌细胞系，它们通过阻断非规范TORC1信号通路的不同方面来破坏MiT/TFE活性的调节。UOK257细胞系来源于一个由FLCN基因致病性变异引起的BHD综合征个体的人肾癌FLCN是FLCN基因的产物，通过调控Rag GTPase，促进torc1依赖性的磷酸化和细胞质中TFE3和TFEB的隔离，从而调控溶酶体的功能。在FLCN缺失的情况下，TFE3和TFEB不会被招募到溶酶体中，而是进入细胞核并活跃。UOK124细胞系最初来源于一名患有侵袭性晚期肾癌的21岁女性，研究发现其特征是Xp11.2易位导致TFE3的基因组重排，产生致癌的TFE3融合蛋白，PRCC-TFE3.60 Xp11.2 trcc代表一种侵袭性肾癌，由TFE3的各种基因组重排引起。融合TFE3能够抵抗torc1依赖性的降解和隔离，因此在细胞核中通过使用siRNA对抗WDR24，发现UOK257细胞中TFEB、TFE3和MITF的蛋白水平显著降低(图7A和7B)。作为对照的UOK257-2细胞是通过在UOK257细胞中逆转录恢复FLCN基因而产生的。最后，在UOK124细胞中，随着WDR24 KD中TFEB和MITF的水平显著降低，PRC-TFE3融合水平也显著降低(图7C和7D)。综上所述，这些数据证实GATOR2维持MiT/TFE蛋白水平独立于TORC1和RAG GTPase的非规范活性。此外，表明GATOR2复合物在肾细胞癌中保护MiT/TFE蛋白免受蛋白降解。
图7
结论
1、 GATOR2通过调节MiT/TFE的蛋白酶体降解来维持溶酶体功能
2、 GATOR2独立于GATOR1和Rag GTPase调节MiT/TFE蛋白水平
3、 在GATOR2突变体中，三个E3连接酶靶向MiT/TFE蛋白降解
4、 GATOR2的缺失降低了Xp11易位性肾细胞癌中融合TFE3蛋白水平
