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摘要
肿瘤分子靶向治疗显著改善了患者的预后，但由于促癌蛋白的适应性变化，导致药物结合亲和力下降，其疗效的持久性常受到限制。此外，许多关键致癌蛋白因其抑制剂开发的挑战性而缺乏有效的靶向治疗方法。PROTAC是一种新兴的治疗模式，通过劫持细胞内蛋白质降解机制，有效减少靶蛋白。与传统疗法相比，PROTAC对靶蛋白的突变具有更强的适应性，选择性更高，所需剂量更低，并且能够有效靶向致癌转录因子和支架蛋白。本文总结了PROTAC在癌症治疗中的发展及其生物学活性，并探讨了PROTAC设计中的药物化学挑战与最新进展。
背景
癌症治疗的核心挑战在于如何高效、持久地抑制或消除癌细胞。传统的癌症治疗手段包括手术、放疗、化疗、以及近年来发展迅速的分子靶向治疗和免疫疗法。然而，这些方法存在不同程度的局限性，例如耐药性问题、治疗副作用大、以及靶向治疗的特异性不足。
分子靶向治疗的兴起标志着肿瘤治疗进入了一个新的阶段，这类疗法通过特异性地抑制肿瘤相关蛋白质功能，从而实现治疗效果。然而，随着时间的推移，许多患者会因为基因突变、蛋白质过表达或其他适应性机制，导致对这些靶向药物的耐药性。特别是许多肿瘤关键蛋白质（如转录因子、支架蛋白等）由于其结构特点，被认为是“难以成药”的靶点，传统的小分子抑制剂难以对这些蛋白质产生有效作用。
在这一背景下，PROTAC技术的出现为解决这些挑战提供了全新思路。PROTAC的设计理念是通过将靶蛋白与细胞内的E3连接酶结合，促使靶蛋白被泛素化并通过蛋白酶体降解，而不仅仅是通过抑制其活性。这种“事件驱动”机制不依赖于长期占据靶蛋白的结合位点，因此能够在较低剂量下实现有效降解，降低脱靶效应 。随着技术的发展，越来越多的靶向PROTAC化合物被设计出来，并在体外和体内模型中展示了强大的蛋白质降解能力 。
本文章探讨了PROTACs在癌症治疗中的应用。文章讨论了传统分子靶向癌症治疗面临的挑战，如疗效持久性有限、耐药性问题以及难以靶向某些难以成药的蛋白。作者重点介绍了PROTACs如何通过利用细胞自身的蛋白降解机制来克服这些问题，以及在选定癌症治疗靶点上的应用和生物学活性。此外，还讨论了PROTACs设计的药理化学挑战和进展。
癌症治疗的现状与挑战
癌症是由于基因突变和表观遗传改变引发的一类复杂疾病，表现为细胞的异常增殖和转移。在全球范围内，癌症仍然是导致死亡的主要原因之一。尽管近年来分子靶向治疗取得了显著进展，降低了癌症的死亡率，但这些治疗方法的持久性和广泛适用性仍然受到挑战。当前的癌症药物大体上可以分为三类：第一类通过引起DNA损伤或破坏细胞骨架来选择性地杀死快速分裂的细胞；第二类通过阻断性激素受体或减少其激活配体来抑制肿瘤生长；第三类则是分子靶向治疗，这类药物通过干扰肿瘤的生长、血液供应，或阻止肿瘤细胞逃避免疫系统的攻击来发挥作用。近年来，分子靶向治疗成为了新兴癌症药物开发的主要方向。然而，这些靶向治疗药物通常通过占位机制（occupancy-based mechanism）起作用，需要持续且高浓度的药物才能有效抑制靶蛋白的活性。因此，耐药性问题常常随着治疗的进行而产生，导致药物疗效逐渐降低。此外，许多致癌蛋白因其结构特点被认为是“不可成药的”（undruggable），如无酶活性、缺乏深度疏水口袋或对底物的高亲和力。这些蛋白质难以通过传统的小分子抑制剂进行靶向，严重限制了癌症治疗的范围。
PROTAC的机制与平台
蛋白质降解机制
在正常细胞中，蛋白质降解是由泛素-蛋白酶体系统（UPS）调控的。该系统通过将多聚泛素链连接到目标蛋白的赖氨酸残基上，标记蛋白质进行降解。这个过程通常由E1（泛素激活酶）、E2（泛素结合酶）和E3（泛素连接酶）三个酶促反应级联进行。E3连接酶识别特定的目标蛋白，并将其与E2酶结合的泛素分子连接在一起，形成多聚泛素链。随后，这些多聚泛素化的蛋白质被蛋白酶体识别并降解为短肽，从而在细胞内清除不需要的或损坏的蛋白质。
PROTAC的基本原理与工作机制
PROTAC（proteolysis targeting chimeras，蛋白降解靶向嵌合体）是一类新兴的治疗分子，通过劫持细胞的天然蛋白质降解系统（主要是泛素-蛋白酶体系统，UPS），实现对特定靶蛋白的降解。与传统的占位机制药物不同，PROTAC采用事件驱动机制（event-driven mechanism），通过将目标蛋白与E3连接酶结合，促进靶蛋白的泛素化，从而被蛋白酶体识别并降解（图1）。
PROTAC通常由三个主要部分组成：靶标蛋白配体（target protein ligand）、E3连接酶配体（E3 ligase ligand）和连接子（linker）（图1）。靶标蛋白配体通常是针对目标蛋白的高亲和力抑制剂或配体，E3连接酶配体则是可以招募细胞内E3连接酶的分子，连接子则起到将两者连接并维持适当空间构象的作用。
当PROTAC与靶标蛋白和E3连接酶同时结合时，形成三元复合物，促使E3连接酶介导的靶标蛋白泛素化。被泛素化的靶标蛋白随后被蛋白酶体识别并降解。这一过程可以反复进行，使得PROTAC在低剂量下也能有效地降解大量靶标蛋白。
图1
PROTAC的主要优势
（1）广泛的靶向范围：PROTAC能够靶向传统药物难以作用的“黑暗蛋白质”，如转录因子、支架蛋白和一些酶的非催化亚基。这扩展了可药物化的蛋白质范围，尤其是在癌症治疗中，这些蛋白质往往是致癌的关键因素。
（2）克服药物耐药性：传统靶向药物容易因靶蛋白突变而失效，而PROTAC通过诱导蛋白质降解，能够克服因基因突变导致的药物耐药性。例如，PROTAC能够降解因突变而失去药物结合能力的靶蛋白，从而恢复对癌细胞的抑制作用。
（3）降低药物剂量与副作用：由于PROTAC具有催化特性，能够在低浓度下实现高效的蛋白质降解，这有助于减少药物的脱靶效应和相关的毒副作用。与传统的占位抑制剂相比，PROTAC不需要高剂量的持续给药即可维持疗效。
（4）增强选择性：通过选择不同的E3连接酶，PROTAC可以在同一类蛋白质家族中实现更高的选择性。例如，PROTAC可以选择性地降解特定的蛋白质亚型，而不影响其他类似的蛋白质，这在癌症治疗中尤为重要。
选择E3连接酶与靶标蛋白的考虑因素
在开发PROTAC时，选择合适的E3连接酶和靶标蛋白至关重要。E3连接酶在蛋白质降解过程中起着识别特异性底物并介导泛素转移的关键作用。人类基因组中编码了600多种E3连接酶，但到目前为止，只有少数几种E3连接酶（如VHL和CRBN）被成功用于PROTAC的设计。文章还提到，靶标蛋白的选择也必须考虑其结构特点、功能活性位点以及可能与E3连接酶形成有效三元复合物的能力。此外，连接子的设计也是PROTAC开发中的一个重要环节。连接子的长度和组成需要仔细调整，以确保PROTAC的细胞渗透性、稳定性和靶向性。为了优化PROTAC的降解效率和药代动力学特性，研究人员通常会通过实验确定最合适的连接子结构。此外，当PROTAC浓度过高时，可能会出现靶蛋白与E3连接酶的非生产性结合，导致降解效率下降，因此需要优化剂量。总之，可以概括为以下几点：
（1）分子设计的复杂性：PROTAC分子由靶蛋白配体、E3连接酶配体和连接子三部分组成。为了确保高效的靶蛋白降解，连接子的长度和结构需要精确设计，以确保形成有效的三元复合体（靶蛋白-PROTAC-E3连接酶）。连接子的长度过短可能导致靶蛋白和E3连接酶无法形成稳定的复合体，而过长的连接子则可能导致分子过于柔性，无法精确定位靶蛋白和E3连接酶。此外，连接子的化学性质也会影响PROTAC的溶解性、细胞膜透过性以及药物稳定性。
（2）药物递送和细胞穿透性：PROTAC分子的分子量通常较大（一般超过1000道尔顿），这可能限制其在体内的药物递送和细胞穿透性。大分子量的药物通常难以穿透细胞膜，这对PROTAC的细胞内作用带来了挑战。研究人员需要开发创新的药物递送系统，如纳米颗粒、脂质体或其他靶向递送技术，以确保PROTAC能够有效进入癌细胞并发挥作用。
（3）选择合适的E3连接酶：E3连接酶在不同组织中的表达水平和活性不同，因此选择合适的E3连接酶对于PROTAC的设计至关重要。当前大多数PROTAC分子使用VHL或CRBN作为E3连接酶，但并非所有癌症细胞中都高表达这些连接酶。此外，E3连接酶的选择也会影响PROTAC的降解效率和选择性。因此，开发更多能够靶向其他E3连接酶的PROTAC配体，将进一步扩大PROTAC的应用范围。
（4）钩效应：当PROTAC浓度过高时，可能会出现所谓的钩效应（hook effect）。在这种情况下，PROTAC分子会分别与靶蛋白和E3连接酶形成二元复合体，而非所需的三元复合体，从而降低了降解效率。这种效应要求对PROTAC的浓度进行精确控制，以避免其在体内失效。
（5）非特异性降解和副作用：尽管PROTAC具有较高的选择性，但仍可能引发非特异性降解。例如，如果某种PROTAC能够降解靶蛋白的多个亚型，或与同一类E3连接酶结合的多个蛋白质，那么这可能会导致意想不到的副作用。此外，过量使用PROTAC可能引发全身性副作用，如免疫反应或非靶向组织的损伤。
连接子的设计与优化
连接子的设计需要综合考虑靶标蛋白和E3连接酶的空间构象、连接子的物理化学性质、细胞渗透性和药代动力学特性等。文章介绍了几种常用的连接子类型，如聚乙二醇（PEG）和线性烷基链连接子，这些连接子在设计中表现出良好的兼容性和降解效果。
此外，文章还提到了一些新型连接子的开发趋势，如含氮杂环（azaheterocycles）和含三唑的连接子，这些连接子在刚性、细胞渗透性和水溶性方面表现出优势。在一些最新的研究中，研究人员利用点击化学（click chemistry）合成了含三唑的PROTAC，从而提高了合成效率和生物活性评估速度。
早期的PROTAC开发与应用
文章回顾了PROTAC技术的发展历程，介绍了早期开发的几种PROTAC分子，并讨论了它们在体内外实验中的效果（图2）。
2001年，Raymond Deshaies和Craig Crews的研究团队首次合成了一个基于这种理念的分子，该分子被命名为PROTAC 1。这一PROTAC是由ovalicin（氨肽酶-2的抑制剂）与SCFβ-TRCP（E3连接酶）之间的连接子结合而成。该分子能够在体外实验中有效诱导氨肽酶-2的降解，标志着PROTAC技术的首次成功应用。然而，由于该分子存在细胞膜穿透性差等问题，限制了其在细胞实验中的应用。
为了克服最初的PROTAC分子在细胞渗透性方面的不足，研究者们开始设计去肽化的PROTAC。2004年，Crews的团队合成了第一个真正的细胞渗透性PROTAC分子，这个分子能够在细胞中有效降解靶蛋白AR（雄激素受体）。该分子通过非共价的方式将小分子抑制剂与VHL（Von Hippel-Lindau蛋白）连接酶连接，展示了PROTAC技术的潜力。这一进展推动了更多细胞渗透性PROTAC的开发，并验证了该技术在体内环境中的可行性。
在2000年代初期，多个研究团队也合成了其他类型的PROTAC。例如，Estrogen Receptor（雌激素受体）的降解剂被合成并用于研究ER阳性乳腺癌的治疗。随着技术的进步，这些早期的PROTAC分子逐渐优化，采用了非肽类连接子，增强了其在细胞中的稳定性和渗透性。
图2
PROTAC在特定癌症靶点中的应用
PROTAC技术在多个癌症靶点中展示了广泛的应用潜力，特别是在一些传统药物难以成药的靶点上。以下是文章中对几种重要癌症靶点的详细分析。
雄激素受体（AR）降解剂及其在前列腺癌中的应用
雄激素受体（AR）是前列腺癌治疗的一个关键靶点，AR的激活与前列腺癌的进展密切相关。传统的抗雄激素疗法通过阻断AR的激活来抑制肿瘤生长，但AR的突变和过表达常导致抗雄激素治疗的耐药性问题。
PROTAC在AR降解方面展现出独特优势，通过降解AR蛋白，能够有效应对传统治疗方法中存在的耐药性问题。文章详细回顾了多个AR降解剂的开发历程，如ARCC-4、PAP508、ARD-69等，这些降解剂在体外细胞实验和动物模型中表现出强大的降解效果（图3）。特别是VHL依赖的AR降解剂ARD-69展示了优异的降解性能，能够在低浓度下实现对AR的高效降解，并在前列腺癌小鼠模型中显示出显著的抗肿瘤活性。
图3
雌激素受体（ER）降解剂及其在乳腺癌中的应用
雌激素受体（ER）在乳腺癌，特别是ER阳性乳腺癌的发展和维持中扮演着重要角色。尽管抗雌激素药物（如他莫昔芬）在临床上广泛使用，但其疗效常因耐药性问题而受限。PROTAC技术为解决这一问题提供了新的思路，通过降解ER蛋白，能够有效抑制ER信号，并克服传统抗雌激素治疗中的耐药性。文章详细介绍了多个ER降解剂的设计与开发，如ERD-308、ARV-471等（图4）。
ERD-308是一种基于VHL的ER降解剂，通过对雷洛昔芬（Raloxifene）的衍生化设计，并结合适当的连接子，展示了优异的ER降解效果。此降解剂在MCF-7和T47D乳腺癌细胞系中表现出亚纳摩尔级别的降解浓度，并在5纳摩尔以下即可实现超过95%的ER降解，显示出极高的效力；ARV-471则是由Arvinas公司开发的一种口服可用的ER靶向PROTAC，目前正在I/II期临床试验中进行评估。ARV-471在多种乳腺癌细胞模型中表现出强大的抗肿瘤活性，其DC50仅为2纳摩尔，并且能够降解多种临床相关的ER突变体。这一化合物的开发展示了PROTAC技术在临床应用中的巨大潜力。
图4
布鲁顿氏酪氨酸激酶（BTK）降解剂及其在B细胞淋巴瘤中的应用
布鲁顿氏酪氨酸激酶（BTK）在B细胞恶性肿瘤的发生和发展中起着重要作用。BTK通过与B细胞受体（BCR）相互作用，激活下游的多个信号通路，从而促进B细胞的生长和存活。虽然目前已有BTK抑制剂（如伊布替尼、阿卡替尼、泽布替尼等）获批用于治疗B细胞淋巴瘤，但这些抑制剂的疗效往往受到BTK的耐药突变（如C481S突变）的影响。
PROTAC技术在BTK降解方面显示出优势，通过降解BTK蛋白，能够有效应对BTK抑制剂耐药突变问题。文章介绍了多个BTK降解剂的开发，如P13I、L18I、MT-802等（图5）。
P13I是一种基于CRBN的BTK降解剂，采用伊布替尼作为BTK靶向配体，通过与CRBN结合实现BTK的降解。该化合物在多种B细胞淋巴瘤细胞系中表现出纳摩尔级别的降解效果，尤其在C481S突变体中展示了显著的降解活性。；L18I则是P13I的优化版本，通过用来那度胺替代泊马度胺，提高了化合物的水溶性，并实现了体内活性。L18I在BTK耐药细胞系中表现出优异的抗增殖效果，并在小鼠异种移植模型中展现出明显的肿瘤抑制效果。；MT-802与P13I结构类似，但在设计上减少了连接子的长度，提高了降解效率。MT-802能够有效降解BTK，包括其耐药突变体，同时展示了更好的靶向选择性。
图5
间变性淋巴瘤激酶（ALK）降解剂及其在NSCLC中的应用
间变性淋巴瘤激酶（ALK）是一种细胞表面受体酪氨酸激酶，在多种癌症（如非小细胞肺癌、神经母细胞瘤等）中因基因易位或突变而活化。ALK抑制剂如艾乐替尼、布加替尼、劳拉替尼、克唑替尼和色瑞替尼已被批准用于ALK阳性肿瘤的治疗，但这些抑制剂在面对ALK的耐药突变（如L1196M、C1156Y、G1202R等）时疗效有限。PROTAC通过降解ALK及其融合蛋白，为应对ALK阳性肿瘤的耐药问题提供了新的治疗策略。文章详细介绍了多个ALK降解剂的开发，如TL13–12、MS4077、SIAIS117等（图6）。
图6
TL13–12和TL13–112是基于CRBN的ALK降解剂，分别采用TAE684和色瑞替尼作为ALK靶向配体。这些降解剂在多种ALK阳性细胞系中展示了强大的降解效果，尤其在H3122细胞系中，DC50达到了10纳摩尔。然而，TL13–12和TL13–112在Ba/F3细胞系中对ALK耐药突变体的降解效果相对较弱；MS4077和MS4078是基于色瑞替尼的CRBN依赖性降解剂，尽管其结合亲和力相对较低，但在NPM-ALK融合蛋白阳性的SU-DHL-1细胞系中表现出优异的降解效果。这两种化合物在体内表现出良好的药代动力学特性，能够维持有效浓度超过12小时；SIAIS117是一种基于VHL的ALK降解剂，采用布加替尼作为靶向配体，并通过连接子衍生化优化了其降解效果。该化合物在SR细胞系中展示了7.0纳摩尔的DC50，并在对EML4-ALK耐药突变体的抗增殖实验中表现出良好的活性。
未来的前景与方向
随着对PROTAC机制的深入理解和技术的不断进步，未来这一领域有望取得更多突破。
新型E3连接酶的发现与应用
目前，绝大多数PROTAC是基于VHL和CRBN两种E3连接酶的配体。然而，E3连接酶家族中还有许多其他成员未被充分利用。未来，随着对其他E3连接酶的深入研究，可能会发现更多适用于PROTAC开发的新型E3连接酶，从而拓展PROTAC的应用范围。
多靶点降解剂的开发
传统的PROTAC通常针对单一靶点进行设计，而多靶点降解剂则能够同时靶向多个相关的致癌蛋白，从而提高治疗效果。未来，随着PROTAC技术的进一步发展，多靶点降解剂有望成为一种新的治疗策略，特别是在对抗多种癌症或复杂疾病时表现出更好的疗效。
PROTAC在其他难治性疾病中的应用潜力
尽管PROTAC在癌症治疗中已展现出巨大潜力，但其应用范围并不仅限于此。未来，PROTAC技术可能在神经退行性疾病、自身免疫疾病等其他难治性疾病中发挥重要作用。通过靶向降解致病蛋白，PROTAC有望为这些疾病的治疗带来新的希望。
PROTAC的未来发展及其在癌症治疗中的地位
综上所述，PROTAC作为一种新兴的蛋白降解技术，在癌症治疗中展现出广阔的应用前景。尽管目前还存在一些技术瓶颈和挑战，但随着研究的深入和技术的进步，PRO TAC有望克服这些挑战，成为癌症治疗中的重要工具。
总结
PROTAC作为一种颠覆性的治疗手段，正在逐渐改变我们对蛋白质靶向降解的认识，并为癌症治疗提供了新的思路和工具。尽管目前仍存在一些技术挑战，但随着研究的不断深入和技术的日益成熟，PROTAC有望在未来的癌症治疗中占据重要地位，并扩展至更多疾病领域。对于科研人员和制药公司而言，PROTAC代表着一个充满潜力的研究方向，未来将见证这一技术在医学领域的广泛应用和巨大影响。
